مقالة منهجية

تحديد وتوصيف العوامل المنتشر بنقل الجينات في رواية التمزق--الوسم؛ مزق--tva النموذجي مورين

DOI:

10.3791/55890

⸱

أكتوبر 16, 2017

 ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا لإثبات نظام نقل جينات جسدية رواية استخدام التمزق--الوسم؛ مزق--tva طراز الماوس لدراسة وظيفة الجينات في ورم خبيث. يتم تسليم الفيروسات القهقرية إنفلونزا الطيور إينتراكاردياكالي لضمان نقل الجينات إلى آفات ما قبل الخبيثة، noninvasive الخلايا β البنكرياس في الفئران الكبار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السرطان المنتشر تمثل 90 في المائة من الوفيات في المرضى الذين يعانون من الأورام الصلبة. وهناك حاجة ملحة لفهم القوى المحركة لسرطان خبيث وتحديد الأهداف العلاجية الرواية. للتحقيق في الأحداث الجزيئية التي تدفع التدرج من السرطان الابتدائي لورم خبيث، قمنا بتطوير نموذج ماوس بيترانسجينيك، التمزق--الوسم؛ مزق--tva. في هذا الطراز الماوس، محركات المروج الأنسولين الفئران (RIP) التعبير عن مستضد SV40 تي (العلامة) والمستقبلات للفريق الفرعي المعني بفيروس إنفلونزا الطيور ليوكوسيس (tva) في خلايا بيتا في البنكرياس. وضع الفئران أورام الغدد الصم العصبية البنكرياس مع بينيترانسي 100% من خلال مراحل محددة تحديداً جيدا التي تشبه tumorigenesis البشرية، مع المراحل بما في ذلك تضخم والأوعية، والورم الحميد، وسرطان الغازية. لأن التمزق--الوسم؛ مزق--tva الفئران لا تتطور المرض المنتشر، التعديلات الوراثية التي تروج لورم خبيث يمكن تحديدها بسهولة. نقل الجينات الجسدية إلى الإعراب عن tva، تنتشر β البنكرياس والآفات بريماليجنانت يتحقق من خلال حقن intracardiac الجزيئي إنفلونزا الطيور التي تأوي التعديلات الوراثية المرغوبة. عيار من > 1 × 108 وحدات المعدية كل مل يعتبر مناسباً للعدوى في الجسم الحي . وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تصيب الفيروسات القهقرية إنفلونزا الطيور خطوط الخلايا المستمدة من الأورام في التمزق--الوسم؛ مزق--tva الفئران بكفاءة عالية. يمكن أيضا استخدام خطوط الخلايا لوصف العوامل المنتشر. هنا نحن لشرح كيفية الاستفادة من هذا الطراز الماوس وخلية خطوط لتقييم وظائف الجينات المرشحة في ورم خبيث.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتنشأ معظم حالات السرطان من طفرات جسمية 1. نماذج الماوس المهندسة وراثيا التقليدية (جيمم) قدمت أفكاراً هامة في مساهمة محددة التعديلات الوراثية إلى توموريجينيسيس 2. ومع ذلك، لديهم العديد من القيود. العيب الرئيسي لهذه النماذج هو أنها لا تكرر متفرقة طبيعة تشكيل الأورام في البشر، والذي يكتسب فقط بعض الخلايا داخل أنسجة التعديلات الوراثية. الطفرات في الفئران المحورة وراثيا والضربة القاضية هي أيضا germline مع احتمال أن تؤثر على التنمية. وعلاوة على ذلك، تولد هذه النماذج الماوس مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً.

ورم خبيث قضية هامة في مجال السرطان. النمذجة خبيث كان صعباً في جيم. ومن النادر خبيث عفوية في الماوس. بينيترانسي متغير والكمون الطويل في جيمم لورم خبيث 3. نماذج تجريبية خبيث تستخدم الحقن المباشر من الخلايا إلى الدورة الدموية للفئران، حتى يتم القضاء على الخطوات المبكرة في تتالي المنتشر.

للتغلب على بعض أوجه القصور المذكورة أعلاه في دراسة العوامل المنتشر في نماذج الماوس، قمنا بتطوير نموذج ماوس بيترانسجينيك، التمزق--الوسم؛ مزق--tva4. ترتكز الاستراتيجية على الجمع بين استخدام ورم متزامنة عالية تقدم ماوس نموذج، التمزق، العلامة 5، والمستقبلات فيروس leukosis الفريق الفرعي المعني بإنفلونزا الطيور، tva 6،7. هذا التمزق -الوسم؛ مزق--tvaيسمح طراز الماوس الجينات إدخال سوماتيكالي في سلالة ماوس بيترانسجينيك واحد. مع مستضد SV40 تي قمع مهام القمعية الورم Rb و p53، وضع الفئران أورام الغدد الصم العصبية البنكرياس بطريقة مماثلة ل tumorigenesis البشرية، مع المراحل بما في ذلك تضخم والأوعية، والورم الحميد، وسرطان الغازية. هذا النموذج التمزق-العلامة كانت مفيدة جداً لفهم السمات المميزة للسرطان، لا تقتصر على أورام الغدد الصم العصبية البنكرياس. فقد استخدمت أيضا في التجارب الإكلينيكية 8.

نقدم بروتوكول لنقل الجينات الجسدية من خلال ضخ إينتراكاردياكالي الفيروسات القهقرية إنفلونزا الطيور في التمزق--الوسم؛ مزق--tva الفئران. يتطلب نجاح العدوى بالفيروسات القهقرية إنفلونزا الطيور المستمدة من ركاسبب بنشاط تكاثر الخلايا المستهدفة. لذلك، اخترنا التمزق--الوسم؛ مزق--tva الفئران في 7 أسابيع عمر، عندما يتطور فرط تنسج في حوالي 50% جزيرات البنكرياس. حقن intracardiac البطين الأيسر من الفيروسات عيار عالية مطلوب لتحقيق كفاءة عدوى من 10-20% 4. طريقة التسليم هذه يقلل التخفيف الكبير من الجزيئات الفيروسية داخل الدورة الدموية من قبل الفيروسات تصل إلى جزيرات البنكرياس.

باستخدام هذا النهج، أثبتنا سابقا أن يعزز Bcl-xL سرطان خبيث مستقلة بوظيفة مكافحة--أبوبتوتيك 4،9. هذه الدالة المنتشر المضادة-أبوبتوتيك-مستقلة لم يلاحظ عندما أعرب Bcl-xL عبر التحوير في كافة الخلايا β البنكرياس في جميع أنحاء أونتوجيني الورمية في التمزق--الوسم؛ RIP-Bcl-xL الفأر نموذج 10. ولذلك، يوفر الطراز الماوس لدينا فرصة فريدة لتحديد وتوصيف الوظائف الجينات المعبر عنه في مرحلة لاحقة من توموريجينيسيس. لأن 2-4% جزيرات تتطور إلى أورام في التمزق--الوسم؛ مزق--tva بيترانسجينيك الفئران دون العدوى الفيروسية، وليس كل الآفات premalignant مصابون بالفيروسات القهقرية إنفلونزا الطيور المستمدة من ركاسبب، ويمكن التعرف على العوامل التي تمنح ميزة انتقائية على المسار الطبيعي توموريجينيسيس فقط. على وجه الخصوص، المنتشر العوامل الأكثر سهولة سيعترف بهذا الأسلوب، نظراً لورم خبيث بالغدد الليمفاوية البنكرياس أو الأجهزة الأخرى لا يحدث عادة في التمزق--الوسم؛ مزق--tva الفئران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أخلاقيات البيان: تجارب على الحيوانات وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية والقواعد المحددة من قبل المعهد لرعاية الحيوان واستخدام اللجنة لويل كورنيل الطب.

1. "اختيار الناقلة للفيروس إنفلونزا الطيور" (المستندة إلى ألف ركاسبب أو RCANBP(A)-based)

    ناقلات
  • مستمدة من ساركومه راوس الفيروسات 11. يمكن تسليم الناقلة للفيروس إنفلونزا الطيور كدناس (≤ 2.5 كيلو بايت)، قصيرة دبوس الكشف (شرناس)، ميكرورناس (ميرناس)، والأخرى الكشف فضله. ناقلات المتاحة تجارياً ترد في المواد والبعض الآخر بحاجة إلى أن يطلب مباشرة من المؤلفين.
  • إلى أوفيريكسبريس الجينات للفائدة، استخدم أحد موجهات التالية، RCASBP(A) 12 ( الشكل 1A)، تقييمات النتائج والكفاءات-X ( الشكل 1B)، تقييمات النتائج والكفاءات-Y 13 ( الشكل 1)، "العنف المنزلي" ركاسبب-ص 14، أو أخرى ناقلات ALV A (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html)-
  • لضرب الجينات للفائدة من شرنا، استخدم أحد موجهات التالية: "العنف المنزلي" ركان-X 15 أو 16 من تقييمات النتائج والكفاءات-[رني].
  • إلى أوفيريكسبريس ميرناس، تولد ناقلات مير تقييمات النتائج والكفاءات كما هو موضح في 17-
  • تحول إلى شرط كولاي والحمض النووي-
    • يفضل تحويل
  • الحمض النووي في الخلايا المختصة Stbl2 أو Stbl3، الذي يكون النمط الوراثي الفريد لتحقيق الاستقرار في تسلسل تكرار والنسخ العكسي المباشر. تنقية بلازميد الحمض النووي باستخدام أسلوب الذي سوف تسفر عن الصرفة، الصف تعداء الحمض النووي. هناك حاجة إلى 5 ميكروغرام من الحمض النووي مع تركيز الحد الأدنى من 0.1 ميكروغرام/ميليلتر.

2. نشر الفيروسية في "الدجاج تنتجها الخلايا الليفية DF1 الخلية خط"

  1. استخدام ماصة المصفاة نصائح لخلية ثقافة مطلوب لمنع تلويث الصليب الفيروسية أسهم 18-
  2. DF1 الحفاظ على الخلايا في الطبق 6 سم مع النمو المتوسطة (دميم مع ارتفاع الجلوكوز، 10% مصل بقرى الجنين، 6 مم (تركيز النهائي) ل الجلوتامين، 10 وحدات/ml البنسلين، 10 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) في 37 س ج و 5% أول أكسيد الكربون 2. إذا كان يتم إذابة الخلايا DF1 طازجة من الأرصدة المجمدة، ثقافة لهم لمدة 3 أيام على الأقل قبل تعداء-
  3. تعداء، قبل يوم واحد من نقل الخلايا DF1 إلى طبق استنبات الأنسجة 6 سم حتى تكون روافد 30-50% في وقت تعداء.
  4. ميكروغرام 5 إضعاف من الحمض النووي الفيروسي نقية مع دميم (بدون المصل أو البنسلين والستربتوميسين) إلى إجمالي حجم 150 ميليلتر في أنبوب ميكروسينتريفوجي داخل غطاء زراعة الأنسجة.
  5. إضافة 30 ميليلتر من سوبيرفيكت مباشرة في أنبوب الحمض المخفف؛ ودوامه هذا الخليط لمدة 10 ق؛ وإجازة هود الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقيقة في زراعة الأنسجة للسماح بتشكيل مجمع تعداء.
  6. بينما يجري تشكيل معقدة، بلطف نضح المتوسطة النمو من طبق ثقافة الخلية DF1، وتغسل بعناية الخلايا مع 4 مل برنامج تلفزيوني --/---
  7. مل 5 بيبيت من النمو المتوسطة (التي تحتوي على المصل والمضادات الحيوية)؛ حفظ مل 4 إلى أنبوب صقر للخطوة التالية؛ وإضافة ما تبقى من 1 مل متوسط النمو إلى مجمعات تعداء. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً مرتين، ونقل على الفور مجمعات كاملة تعداء الخلايا DF1. دوامة لضمان أن تغطي طبقة الخلية؛ احتضان لمدة 2-3 ساعات في 37 يا جيم
  8. نضح الخليط تعداء؛ غسل الخلايا مع 4 مل برنامج تلفزيوني -/- إضافة 4 مل من النمو الطازجة المتوسطة (التي تحتوي على المصل والمضادات الحيوية)؛ إعادة الخلايا إلى حاضنة 37 س ج.
  9. عندما تصل الخلايا كونفلوينسي، ممر الخلايا (تعبير عابر قد تكون جزيئي ح 48 إلى 72 بعد تعداء)-
  10. تواصل تمرير الخلايا لمدة 7 أيام حتى يصاب يفترض أن كافة الخلايا؛ واختبار التكامل الحمض النووي الفيروسي PCR وتحديد التعبير البروتين من النشاف الغربية؛ وتجميد الخلايا في المتوسط دميم مع 10% [دمس] و 20% الجنيني البقري المصل.

3. في فيفو الإصابة بالتمزق -الوسم؛ مزق--tva الفئران

  1. جمع الفيروس وتركيز
    طازجة يتركز استخدام الفيروسات للإصابة في فيفو. لم يتم خفض عيار فيروسات أبقى في 4 س ج في غضون أسبوع إلى حد كبير. ومع ذلك، عرض مختبرين المجمدة للأسهم الفيروسية عيار تخفيض الوقت عند ذوبان الجليد.
    1. توسيع الفيروس--منتج DF1 الخلايا في أطباق 15 سم تبعاً لكمية الفيروس اللازمة. للإصابة في فيفو الماوس، إعداد متوسطها لوح واحد كل الماوس.
    2. قبل chill الدوار (على سبيل المثال، SW28)، دلو سوينغ، وآله أولتراسينتريفوجي إلى 4 س جيم
    3. جمع المادة طافية من المتلاقية 15 سم الأطباق. إزالة الحطام خلية بالطرد المركزي ذات سرعة منخفضة في 1,650 س ز لمدة 10 دقائق في 4 س جيم
    4. نقل المادة طافية الفيروسية إلى ultracentrifuge الأنابيب (أنابيب الطرد المركزي بوليالومير). تدور في أولتراسينتريفوجي لساعة ونصف في 95,400 س ز 4 يا جيم لالة أولتراسينتريفوجي بيكمان XL-100، استخدام أكسل: 1؛ ديسيل: إعدادات 1.
      5. أنابيب
    5. إزالة المادة طافية من أولتراسينتريفوجي إلى أقصى حد ممكن. إضافة برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم (برنامج تلفزيوني --/--) إلى أنبوب ultracentrifuge جعل النهائية الوقف الفيروسية 100 ميليلتر من صحن واحد 15 سم. وتغطي هذه الأنابيب مع بارافيلم. ريسوسبيند بيليه الفيروسية الخفية التي فورتيكسينج أولتراسينتريفوجي أنابيب لمدة 2 دقيقة على سرعة متوسطة.
    6. روك أنابيب أولتراسينتريفوجي في 4 س ج لمدة ساعة واحدة بين عشية وضحاها.
    7. نقل تعليق الفيروسية في أنبوب ميكروسينتريفوجي. الاحماء تعليق الفيروسية إلى درجة حرارة الغرفة قبل الحقن في الفئران.
  2. تحديد عيار الفيروسية.
    لكل بناء الفيروسية الجديدة، يحتاج عيار الفيروسية يتحدد قبل الإصابة في فيفو.
    1. الخلايا DF1 البذور في جميع الآبار من صفيحة زراعة الأنسجة 12-جيدا (الاقتراح: 2 × 10 4 خلايا/حسنا، 1 مل/حسنا)، بحيث تكون روافد 30% في وقت الإصابة. مطلوب لوح 12-بئر واحد لواحد عيار الفيروسية التصميم.
    2. جعل سلسلة من تخفيف إذ من المادة طافية الفيروسية في المتوسطة النمو كالتالي:
      1. ميكس 5 ميليلتر المادة طافية الفيروسية مع 495 ميليلتر النمو المتوسط لتمييع 2 10 في أنبوب ميكروسينتريفوجي. الدوامة بإيجاز لبضع ثوان.
      2. ميليلتر تأخذ 40 من 10 إضعاف 2 إلى 360 المتوسطة النمو ميليلتر في أنبوب ميكروسينتريفوجي لتمييع 3 10. الدوامة بإيجاز لبضع ثوان.
      3. اتبع الخطوة 3.2.2.2 ل 10 4 و 10 5 إضعاف.
        4. أنابيب
      4. مجموعة 5 6 مل البوليسترين. الكوة مل 2.25 النمو المتوسطة كل أنبوب، وتسمية 10 منهم 6، 10 7، 10 8، 10 9، 10 10، على التوالي.
      5. ميكس 0.25 مل من 10 إضعاف 5 مع متوسط نمو مل 2.25 في أنبوب البوليستيرين 6 مل لتمييع 6 10. الدوامة بإيجاز لبضع ثوان.
      6. اتبع الخطوة 3.2.2.5 ل 10 7، 10 8، 10 9، و 10 10 إضعاف-
        7. إزالة
      7. المتوسطة الثقافة الأصلية من الخلايا DF1 على لوحة 12-جيدا. وضع فيروسات 1 مل المخفف لكل منهما أيضا في تكرار (وقاية، 10 10 10 6 وحدة دولية/مل)-
    3. تسمح للخلايا أن تنمو لمدة 7 أيام على الأقل (أداء تريبسينزيشن عند الضرورة). جمع الخلايا لعزل الحمض النووي والتحقق من وجود الحمض النووي الفيروسي من بكر كما هو موضح في " 6. بروتوكولات بكر ". إذا كان هذا عيار الفيروسية 10 8 وحدات المعدية كل مل (وحدة دولية/مل)، وسيتبع إيجابية 398 bp [بكر] منتوجات من ركاسبب باستخدام الحمض النووي من الخلايا التي تحتوي على 10 8 إلى 10 6 وحدة دولية/مل الفيروسات، ولكن ليس من خلايا مصابة، أو الخلايا التي تحتوي على 10 10 10 9 فيروسات وحدة دولية/مل. عيار من > 1 × 10 8 وحدات المعدية كل مل ينبغي أن تستخدم للإصابة في فيفو.
  3. إينتراكاردياك حقن
    Hemizygous التمزق--علامة الفئران، الفئران غير متماثل، وتستخدم في هذه الدراسة. تطوير Hemizygous التمزق--علامة الفئران أورام الغدد الصم العصبية البنكرياس حوالي 10 ~ 12 أسبوعا عمر، بينما الفئران متماثل من كمون ورم أقصر. نظراً لانتشار الخلايا مطلوب من أجل إدماج كدنا الفيروسية في البلد المضيف الجينوم، عمرها 7 الأسبوع التمزق--الوسم؛ مزق--tva وتستخدم الفئران مع الخلايا β البنكرياس هايبربلاسيك. يرجى ملاحظة أن الخلايا β الأكثر طبيعية تنتشر ليس في الفئران الكبار.
    1. 7 استخدام أسبوع التمزق--الوسم؛ RIP-tva الفئران في خلفية C57BL/ج خالصة للتجارب-
    2. أنيسثيتيزي الماوس باستخدام مزيج الكيتامين/إكسيلازيني (150 مغ/كغ؛ 15 مغ/كغ). استخدام الدعم الحرارة للحفاظ على درجة حرارة الجسم الماوس طوال فترة التخدير.
    3. تطبيق مواد التشحيم العين لكلتا العينين لمنع جفاف القرنية-
    4. حلاقة الشعر من تجويف الصدر التمزق--الوسم؛ مزق--tva الفئران. موقف الماوس على ظهرها مع الصدر مواجها لأعلى. تو-قرصه تتم مراقبة الحيوان لعدم الاستجابة لتأكيد تأثير التخدير الكامل.
    5. يمدد أطرافهم الجبهة وأمن لهم مع الأشرطة. الفأر مارك ' الصدر s للحقن. وضع علامة موقع في منتصف الطريق بين الدرجة القصية وأعلى من عملية إكسيفويد، ويترك قليلاً (التشريحية) للقص ( الشكل 2).
    6. فرك جدار الصدر الأمامي مع فرك بوفيدون أو فرك الكلورهيكسيدين متبوعاً بكحول الأيزوبروبيل 70% أو 70% إيثانول غارقة الأسفنج الشاش.
    7. رسم 50 ميليلتر من الهواء إلى الأنسولين معقمة 28 ز ½ المحاقن لإنشاء مسافة بين الغطاس وغضروف من 500 ميليلتر حقنه، وثم رسم 100 ميليلتر من الفيروسات. المجال الجوي دون أي سائل على الجدار أمر حاسم لرؤية نبض القلب.
    8. تبقى الإبرة تستقيم. عقد الجلد الماوس مشدود مع جهة، وإدخال إبرة إلى موقع ملحوظ. عندما يظهر نبض أحمر مشرق للدم في المحاقن، التوقف عن المضي قدما الإبرة وإصلاح عمق الإبرة في الماوس مع يد واحدة.
    9. استخدام اليد الأخرى بعناية وبطء دفع المكبس لتقديم تعليق الفيروسية (~ 100 ميليلتر من وحدة التخزين) على مدى فترة ~ 60 ثانية. تقديم 10-20 ميليلتر كلما رؤية نبض أحمر مشرق من الدم تظهر في المحاقن. مدخل مستمرة من الدم المؤكسج الحمراء الوصل إبرة شفافة تشير إلى الموضع الصحيح من الإبرة في البطين الأيسر.
    10. بعد آخر دفع المكبس تقديم تعليق الفيروسية، وقبل رؤية نبض الأحمر القادم من الدم، بسرعة سحب الإبرة خارج تجويف الصدر.
    11. تطبيق ضغط لطيف على موقع الحقن لتقليل النزيف على الأقل 1 دقيقة
    12. بعناية قم بتحريك الماوس على لوحة تدفئة أو تحت مصباح حرارة حتى تعي تماما. وسوف يكون شاهد الفئران حتى يلبس التخدير، ذلك لأنهم يمكن أن الابتعاد عن المنبهات، فترة عادة ما تستغرق حوالي ساعة واحدة. وسيتم رصد الفئران يوميا لمعطف بل وسليمة وأي تغييرات في السلوك-

4. تحليل أورام نسيجية

euthanize
  1. تسعة أسابيع بعد الحقن، 16 من العمر الأسبوع التمزق--الوسم؛ مزق--tva الفئران. سجل الأحجام والأرقام الأولية أورام البنكرياس وأي الانبثاث الإجمالي-
  2. إصلاح البنكرياس والكبد، و/أو الأجهزة الأخرى في 10% مخزنة الفورمالين بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في منصة هزاز.
  3. نقل الأنسجة الثابتة إلى إيثانول 70% في اليوم التالي. معالجة الأنسجة إلى أقسام جزءا لا يتجزأ من البارافين.
  4. إجراء المناعي تلطيخ سينابتوفيسين (علامة الجهاز الهرموني) أو الأنسولين (علامة خاصة بخلية بيتا) عقب الشركة المصنعة ' تعليمات s لتحديد الانبثاث الخلايا β البنكرياس في الغدد الليمفاوية البنكرياس أو كبد. ولكن متمايزة إزالة ورم الخلايا أو الخلايا السرطانية سيئة المتباينة قد يفقد التعبير عن الأنسولين وفقط يمكن الكشف عنها بواسطة immunostaining سينابتوفيسين.

5. في المختبر عدوى خلايا tva-الإعراب عن

فإنه ليس من الضروري استخدام فيروسات مركزة للإصابة في المختبر. البروتوكول هو موضح أدناه لجولتين من العدوى. جولات أخرى من عدوى يمكن تنفيذها بواسطة تكرار البروتوكول التالي-

  1. جمع المادة طافية الفيروسية من المتلاقية DF1 الخلايا. تبقى المادة طافية الفيروسية في 4 س ج للإصابة في غضون أسبوع. قبل الإصابة، تمرير المادة طافية الفيروسي من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر للحصول على الخلية الحرة الفيروسات.
  2. شطف بإيجاز tva-الإعراب عن الخلايا المستهدفة (أي N134 β البنكرياس خلية ورم الخلية خط من التمزق--الوسم؛ ريبتفا الماوس) مع برنامج تلفزيوني -/- لإزالة جميع آثار مصل الدم، التي تحتوي على مثبطات التربسين. شطف بإيجاز tva-الإعراب عن الخلايا الهدف مع الحل يدتا التربسين (مثل 0.25% التربسين-2.21 مم يدتا). إضافة حل يدتا التربسين واحتضان لمدة دقيقتين. اضغط برفق اللوحة. مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب. عادة فصل الخلايا بمقدار 2 إلى 3 خلايا الهدف البذور في لوحة 6 سم. استخدام 3 ~ 4 مل تصفية المادة طافية الفيروسية كمتوسط نمو.
    ملاحظة: التغذية في المادة طافية الفيروسية وتستهلك الخلايا DF1، حتى تغير في المتوسط في اليوم التالي-
  3. في اليوم التالي، الاحماء يكفي مبلغ من المادة الفيروسية طافية على درجة حرارة الغرفة. إزالة الوسيطة من الخلايا المستهدفة، ويستعاض عن المادة طافية الفيروسية مل 3-4-
  4. اليوم الثالث، مرور الخلايا حسب الحاجة. إذا كانت الخلايا غير كثيفة ما يكفي لتكون باساجيد، الاحماء ~ 4 مل متوسط النمو العادية (دميم مع ارتفاع الجلوكوز، 10% مصل بقرى الجنين، 6 مم (تركيز النهائي) ل الجلوتامين، 10 وحدات/mL البنسلين، 10 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) ليحل محل المادة طافية الفيروسية.
  5. توسيع الخلايا المصابة، وفحص البروتين إعراب الغربية النشاف 19 مرشحا. يمكن تحليل تأثيرات الجينات المرشحة على الهجرة والغزو في فحوصات ترانسويل. يمكن أيضا اختبار هذه الخطوط الخلية لامكاناتهم المنتشر للكبد في تحليل المنطلق ذيل لورم خبيث.

6. بروتوكولات بكر

ينبغي تجميع الحلول، في أسرع وقت ممكن على الجليد. ويمكن إجراء mastermix دون القالب لعدد كبير من العينات والكوتيد في أنابيب PCR. مضاعفة كمية كاشف كل حاجة عدد من العينات. مزيج الكواشف قبل عبها ودوامه مع تلميح بيبيت قبل اتخاذ بعض إضافة إلى mastermix. بعد إضافة كل كاشف للأنبوب mastermix بيبيت صعودا وهبوطاً لتسليم أي بقايا داخل النصائح.

  1. للكشف عن وجود ركاسبب في الخلايا المصابة أو ترانسفيكتيد.
    ويدعو البروتوكول التالي 11.5 ميليلتر من mastermix و 1 ميليلتر من الحمض النووي لكل عينة. تأكد من دوامة قبل إضافة كل كاشف.
    1. إعداد mastermix 7.68 المياه خالية من نوكلاس ميليلتر و 0.75 ميليلتر [دمس]، 1.25 10 x ميليلتر المخزن المؤقت الثاني ل AmpliTaq دنا بوليميريز، 1.375 ميليلتر من 25 مم مجكل 2 وميليلتر 0.125 من 25 مم دنتب.
    2. إضافة ميليلتر 0.125 من 100 ميكرومتر إلى الأمام التمهيدي RCAS5626F: (5 '-أككججججاتجكجتاجكتكا-3 ') وميليلتر 0.125 من 100 ميكرومتر عكس التمهيدي RCAS6023R: (5 '-ككجكاكاكككاكتجكاتاكك-3 ') إلى mastermix.
    3. إضافة ميليلتر 0.075 AmpliTaq دنا بوليميريز mastermix.
      4. مزيج
    4. mastermix خلال يسددها الأنبوب مع الأصابع. تدور أسفل ماتيرميكس في بريفل آلة الطرد المركزيص 3 ~ 5 ثوان.
      5. أنابيب PCR
    5. 11.5 اليكووت ميليلتر من mastermix لكل فرد. دوامة كل مرة قبل اليقوتينج إلى أنبوب جديد.
    6. دوامة وإضافة 1 ميليلتر المجينية الحمض النووي قالب لكل أنبوبة PCR. لتحضير الحمض النووي: بيليه خلية
      1. ليس في 200 ميليلتر من 0.05 M هيدروكسيد الصوديوم. بيبيت صعودا ونزولاً إلى أن يحل بيليه.
      2. حرارة الخلية إلى 98 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في جهاز PCR، ثم تبريده إلى 25 درجة مئوية.
      3. إضافة 20 ميليلتر 1.0 م تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5) بأنابيب، وتخزين عينات الحمض النووي في 4 ° C.
    7. تخلط العينات بالتحريك وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز لمدة 3-5 ثوان. وضع الأنابيب في جهاز PCR.
    8. "بكر" شرط يتم تعيين لمدة 2 دقيقة في 92 درجة مئوية تمسخ الأولى، تليها دورات 40 من 30 ثانية في 94 درجة مئوية تمسخ، 30 s في 67 درجة مئوية للصلب، 30 s في 72 درجة مئوية للتمديد، ومسافة 10 أمتار في 72 درجة مئوية للتمديد النهائي.
    9. بعد الانتهاء من بكر إضافة 3 ميليلتر من 6 × صبغ تحميل الحمض النووي لكل عينة. مزيج من قبل التحريك وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز عن 3 ~ 5 ثوان.
      10. يتم فحص المنتجات بكر
    10. بالتفريد في 2% (w/v) [اغروس] هلام في المخزن المؤقت x TAE 1. حجم ناتجها PCR هو 398 هناك
  2. التنميط العلامة.
    ويدعو البروتوكول التالي 10.5 ميليلتر من mastermix و 2 ميليلتر من الحمض النووي لكل عينة. تأكد من دوامة قبل إضافة كل كاشف.
    1. إعداد mastermix 4.5 المياه خالية من نوكلاس ميليلتر وميليلتر 4.00 5 × ميتاق رد فعل المخزن المؤقت "ميتاق دنا بوليميريز".
    2. إضافة ميليلتر 0.4 من 100 ميكرومتر إلى الأمام التمهيدي TagF2: (5 '-جاكااككاكاكتاجاتجكاجتج-3 ') و 0.4 ميليلتر من 100 ميكرومتر عكس التمهيدي TagR2: (5 '-كاجاجكاجاتجتجاجتج-3 ') إلى مزيج الرئيسي-
      3. إضافة
    3. ميليلتر 0.8 من 10 ميكرون السلائف بيتا-2-ميكروجلوبولين (B2m) التمهيدي مزيج للمراقبة الداخلية. [بكر] كبسولة تفجير ل B2m هي الرقابة الداخلية والسلائف بيتا-2-ميكروجلوبولين (B2m)، و B2 (5 '-كاككجاجاتججاجككجا-3 ') و B2 R (5 '-تككاكاكاجاتجاجكجتككاج-3 ').
    4. إضافة ميليلتر 0.4 "ميتاق دنا بوليميريز" mastermix.
      5. مزيج
    5. mastermix خلال يسددها الأنبوب مع الأصابع. تدور أسفل mastermix في جهاز الطرد المركزي ل 3 ~ 5 س.
      6. أنابيب PCR
    6. 10.5 اليكووت ميليلتر من mastermix لكل فرد. دوامة كل مرة قبل اليقوتينج إلى أنبوب جديد.
    7. دوامة وإضافة 2 ميليلتر المجينية الحمض النووي قالب لكل أنبوبة PCR. الحمض النووي هو إعداد كما هو موضح أعلاه.
    8. ميكس الحل بالتحريك وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز لمدة 3-5 ثوان. وضع الأنابيب في جهاز PCR.
    9. "بكر" شرط يتم تعيين لمدة 3 دقائق في 95 درجة مئوية تمسخ الأولى، تليها دورات 35 من 15 ثانية عند 95 درجة مئوية تمسخ، 15 s عند 65 درجة مئوية للصلب، 30 s في 72 درجة مئوية للتمديد، و 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية للتمديد النهائي.
    10. بعد الانتهاء من بكر إضافة 3 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ لكل عينة. مزيج من قبل التحريك وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز عن 3 ~ 5 ثوان.
      11. ويتم فحص المنتجات بكر
    11. بالتفريد في 2% (w/v) [اغروس] هلام في المخزن المؤقت x TAE 1. هي أحجام منتجات العلامة وبكر B2m ~ 450 bp و 300 شركة بريتيش بتروليوم، على التوالي.
  3. الوراثي tva.
    ويدعو البروتوكول التالي ميليلتر 10.5 من خليط كاشف لكل عينة. تأكد من دوامة قبل إضافة كل كاشف.
    1. إعداد mastermix 5.6 ميليلتر nuclease المياه مجاناً، 0.5 ميليلتر [دمس]، ميليلتر 1.25 10 × "المخزن المؤقت الثاني" ل AmpliTaq دنا بوليميريز، 1.375 ميليلتر من 25 مم مجكل 2 وميليلتر 0.125 من 25 مم دنتب.
    2. إضافة ميليلتر 0.125 100 ميكرومتر tva-3 (5 '-جكككتجججاجتككتجككك-3 ') وميليلتر 0.125 100 ميكرومتر tva-5 (5 '-كتجكتجكككجتاكجتجاككج-3 ') إلى mastermix.
    3. ميليلتر 1.275 إضافة من 10 ميكرون B2m التمهيدي مزيج للرقابة الداخلية على mastermix.
    4. إضافة ميليلتر 0.125 AmpliTaq دنا بوليميريز mastermix.
      5. مزيج
    5. mastermix خلال يسددها الأنبوب مع الأصابع. تدور أسفل mastermix في جهاز الطرد المركزي بإيجاز لمدة 3-5 ثوان.
      6. أنابيب PCR
    6. 10.5 الكوة ميليلتر من mastermix لكل فرد. دوامة كل مرة قبل اليقوتينج إلى أنبوب جديد.
    7. دوامة وإضافة قالب الدنا الجينومي 2µL لكل أنبوبة PCR. الحمض النووي هو إعداد كما هو موضح أعلاه.
    8. ميكس الحل بالتحريك وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز عن 3-5 س. وضع أنابيب في آلة PCR.
    9. "بكر" شرط يتم تعيين لمدة 2 دقيقة في 92 درجة مئوية تمسخ الأولى، تليها دورات 35 من 30 ثانية في 94 درجة مئوية تمسخ، 30 s عند 60 درجة مئوية للصلب، 30 ثانية عند 72 درجة مئوية للتمديد، و 10 دقائق في 72 درجة مئوية للتمديد النهائي.
    10. بعد الانتهاء من بكر إضافة 3 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ لكل عينة. مزيج من قبل التحريك وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز عن 3-5 س.
      11. يتم فحص المنتجات بكر
    11. بالتفريد في 2% (w/v) [اغروس] هلام في المخزن المؤقت x TAE 1. الأحجام من tva ومنتجات B2m PCR هي 500 bp و 300 شركة بريتيش بتروليوم، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أن معدل الإصابة في الجسم الحي وفي المختبر من التمزق--الوسم؛ مزق--tva الخلايا السرطانية بالفيروسات المستندة إلى ركاسبب ~ 20% و ~ 80% على التوالي 20. في التمزق -العلامة؛ مزق--tva طراز الماوس، بطبيعة الحال نحو 4 في المائة جزيرات البنكرياس 400 في كل الماوس سوف تتطور إلى 20من الأورام؛ ولذلك هناك كمية كافية من الخلايا السرطانية في كل الماوس للتحليل النسيجي والمظهرية للأثر المحتمل للجينات بالفيروسات. باستخدام هذا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، وصفت لنا نموذج ماوس قوية، التمزق--الوسم؛ مزق--tva، لتحقيق إيصال الجينات الجسدية عن طريق الفيروسات القهقرية إنفلونزا الطيور لتحديد وتوصيف العوامل المنتشر. على الرغم من أن التمزق--الوسم؛ مزق--tva الفئران تطوير أورام الغدد الصم العصبية البنكرياس، المنتشر العوامل المحددة في هذا النموذج الماوس قد تعزز أيضا ورم خبيث لأنواع أخرى من السرطان.

وقد نهجنا ميزة إدخال التغييرات الوراثية الجسمانية على وجه التحديد في الآفات بريماليجنانت الخلايا β البنكرياس بطريقة تحكم وقت، وب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر هارولد فارموس، براين جيم لويس، Hanahan دوغلاس، هوانغ داني، بانغ شارون، ميغان وونغ، وماناسي م. جودبولي. Y.C.N.D. معتمد من قبل وزارة الدفاع منحة W81XWH-16-1-0619 والمعاهد الوطنية للصحة منحة 1R01CA204916.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RCASBP-Y DV البلازميدAddgene11478
RCAS-RNAi البلازميدAddgene15182
DMEMCorning10-013-CV
مصل الأبقار الجنينيAtlanta Biologicals25-005-CI
L-glutamine ، 100xCorning25-005-CI
محلول البنسلين الستربتومايسين ، 100xCorning30-002-CI
PBS-/- < / sup> ، 1xCorning21-040-CV
SuperfectQiagen301305
أنبوب الطرد المركزي Polyallomerبيكمان كولتر326823
0.45 مم Nalgene
مرشحات حقنة مع غشاء PES		حراري علمي194-2545
محاقن الأنسولينBD329461
سينابتوفيسينناقلاتVP-S284
مجموعة فيكتاستن إيليت ABC HRP (بيروكسيداز ، أرنب IgG)مختبرات ناقلاتPK-6101
AmpliTaq DNA Polymerase مع تقنيات Buffer IILifeN8080153
MyTaq DNA PolymeraseBiolineBIO-21106
مختبرات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The multistep nature of cancer. Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).
  2. Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
  3. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  4. Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276(2007).
  5. Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
  6. Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
  7. Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
  8. Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
  9. Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384(2016).
  10. Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
  11. Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
  12. Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
  13. Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
  14. Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
  15. Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
  16. Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
  17. Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
  18. Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
  19. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  20. Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
  21. Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
  22. Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RIP Tag RIP tva

مقالات ذات صلة