مقالة منهجية

الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

DOI:

10.3791/55909

⸱

أغسطس 22, 2017

 , 
1Centre de Recherche sur le Cancer de l’Université Laval, Faculté de Médecine, Département de Biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie, Université Laval, 2CRCHU de Québec: L’Hôtel-Dieu de Québec

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه المخطوطة وصف أسلوب لتصور وتحديد الأحداث الترجمة المترجمة في المقصورات سوبسيلولار. يتطلب نظام تصوير [كنفوكل] أساسية والمواد الكاشفة النهج المقترح في هذه المخطوطة وهي سريعة وفعالة من حيث التكلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الآليات التي تنظم الترجمة مرناً وتشارك في مختلف العمليات البيولوجية، مثل جرثومة خط التنمية وتمايز الخلايا وأورجانوجينيسيس، وكذلك في العديد من الأمراض. وقد أظهرت العديد من المنشورات مقنع أن آليات محددة تنظم أحكام الترجمة مرناً. زيادة الاهتمام بتنظيم تعبير البروتينات المستحثة بالترجمة أدى إلى استحداث طرق جديدة لدراسة ومتابعة حيثياته البروتين التوليف في سيلولو. ومع ذلك، معظم هذه الأساليب معقدة ويجعلها مكلفة وكثيراً ما يحد من عدد أهداف مرناً التي يمكن دراستها. وتقترح هذه المخطوطة أسلوب الذي يتطلب فقط الكواشف الأساسية ونظام تصوير الأسفار [كنفوكل] قياس ووضع تصور للتغيرات التي تحدث في أي خط الخلية تحت ظروف مختلفة في الترجمة مرناً. واستخدمت هذا الأسلوب مؤخرا لإظهار الترجمة المترجمة في الهياكل سوبسيلولار الخلايا ملتصقة على مدى فترة قصيرة من الوقت، مما يتيح إمكانية تصور الترجمة حيثياته لفترة قصيرة من خلال مجموعة متنوعة من البيولوجية العمليات أو التحقق من صحة التغييرات في النشاط متعدية الجنسيات في الاستجابة للمحفزات محددة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنظيم الترجمة بمختلف الوظائف الخلوية ودفعت العديد من فرق البحث لتطوير أدوات جديدة وأساليب لتحديد التعريب سوبسيلولار الترجمة مرناً وتنظم البروتين التوليف1،2 ،،من34. تسمح هذه التطورات التكنولوجية الحديثة لتحسين فهم الآليات التي تنطوي على أوبريجولاتيون الترجمة أو قمع مرناس محددة خلال العمليات البيولوجية، مثل تنمية الخلايا العصبية والمخدرات واستجابة وورم خبيث5 6، ،،من78. ومع ذلك، تتطلب معظم هذه الطرق مكلفة أو الخطرة والمواد الكيميائية ومعدات معينة قد لا تكون متاحة لمعظم المختبرات. على هذا النحو، قد وضعت طريقة فعالة من حيث التكلفة للسماح للتقييم السريع للأحداث الترجمة للتحايل على وجه التحديد هذه القضايا المحتملة. هذا الأسلوب يكشف التحويرات متعدية الحادة التي تحدث أثناء العمليات الخلوية المحددة ويسمح أيضا لإضفاء الطابع المحلي على الترجمة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل].

واستخدمت الأساليب الموصوفة هنا لرصد الترجمة المترجمة داخل مقصورات سوبسيلولار تسمى الشروع في نشر مراكز (SIC)5. سيكس هي عابرة الهياكل الموجودة في خلايا المصنف التي يتم ترجمتها على رأس المجمعات التصاق الوليدة. رغم سايكس ومجمعات التصاق متميزة، ترتبط ارتباطاً وثيقا مصائرهم. وفي الواقع، معروفة سايكس تختفي تدريجيا عند نضوج التصاق المحورية المعقدة إلى موقع التصاق خلال المرحلة الأولية للالتصاق. وجدنا أن الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات المعروفة للسيطرة على وجه التحديد مرناً الترجمة (مثلاً، Sam68، فمرب، و G3BP1) وبوليادينيلاتيد وقد أثري الكشف داخل هذه الهياكل5. باستخدام الأساليب الموضحة هنا، أظهرنا أن تنظيم مرناً SIC المرتبطة بمثابة الترجمة السماح بتفتيش المصنف الخلايا توطيد التصاق الخلية. ويمكن اعتبار هذا الأسلوب، استناداً إلى التأسيس بوروميسين، صيغة معدلة للاستشعار السطحية للمقايسة الترجمة (غروب الشمس). وضعت أصلاً لقياس معدلات توليف البروتين العالمية باستخدام الأحماض الأمينية مسماة غير إشعاعيا، بوروميسيليشن البروتين يوفر طريقة فعالة لتصور حيثياته البروتين التوليف9. يعتمد هذا الأسلوب على السلوك الجوهرية من بوروميسين، مضاد كتل الترجمة عن طريق إنهاء سلسلة سابقة لأوانها في الريبوسوم10. وفي الواقع، بوروميسين يماثل هيكلياً تيروسيل-الحمض الريبي النووي النقال، يسمح لإدماجها في سلاسل ببتيد عبر تشكيل السندات ببتيد التمطيط. بيد بوروميسين ملزم لسلسلة ببتيد متزايد يمنع سندات ببتيد جديدة يجري تشكيلها بالقادم أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال، منذ بوروميسين سندات غير هيدروليسابل أميد بدلاً من السندات إستر هيدروليسابل وجدت في ترنس. وهكذا يؤدي إدماج بوروميسين في التمطيط البروتينية في إصدار سابق لأوانه عديدة بوروميسيلاتيد مبتوراً البروتينية المقابلة لترجمتها بنشاط مرناً9،11،12 .

باستخدام هذا الأسلوب، كان من الممكن لتقييم الترجمة النشطة خلال وقت قصير أرملة (مثلاً 5 دقائق) خلال الالتصاق الخلوي استخدام جسم محددة موجهة ضد بوروميسين في الخلايا التي استكملت بالمضادات الحيوية لفترات 5-دقيقة في نقاط زمنية مختلفة خلال عملية التصاق الخلية5. دقة هذا الفحص يعتمد على أجسام مضادة محددة للغاية الموجهة ضد مجموعة بوروميسيلاتيد. ويوفر اكتشاف ببتيد بوروميسيلاتيد إيممونوفلوريسسينت إعادة تقسيم سوبسيلولار عامة مرناً المترجمة حديثا، التي يمكن قياسها كمياً بدقة كبيرة باستخدام نظم التصوير [كنفوكل] أيضا.

ومن ثم، يقدم هذا الأسلوب خيار المناسب لعدد كبير من المختبرات التي تدرس آليات تنظيمية متعدية الجنسيات المشاركة في العمليات مثل تحبيب العصبية6،،من1314، 15ومورفوجين مرناً التعريب والترجمة خلال التنمية16،17. وأيضا مناسب تماما لدراسة الترجمة المترجمة أو المجزأة أثناء الأحداث البيولوجية السريعة، مثل الهجرة الخلية أو الالتصاق أو الغزو، أو لمجرد تقييم العلاج بالعقاقير التي قد تسبب التغييرات متعدية5، 7 , 18-وعموما، يسمح هذا الأسلوب لتصور الأحداث الترجمة المترجمة أو التي تسيطر عليها بطريقة سريعة ودقيقة وفعالة من حيث التكلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-"تحديد شروط بوروميسيليشن"

ملاحظة: هذا الأسلوب توضح هذه المقالة الطريقة المستخدمة لتقييم الترجمة المترجمة خلال عملية التصاق الخلايا لجنة نهر الميكونج--5 5. كما يمكن أن يتم بوروميسيليشن في أي خلية، من المهم تحسين شروط بوروميسيليشن خطوط خلية معينة لاستخدامها، لأن شروط المعاملة ليست متطابقة لكل خط الخلية من حيث تركيز بوروميسين والمطلوب وقت الحضانة. لإظهار كيفية تعريف هذه الشروط، يعاملون ثلاثة خطوط الخلايا مثال (أي، هيلا، لجنة نهر الميكونج--5، وهوه-7) مع زيادة تركيزات بوروميسين لاحتضان مختلف الأوقات ( الشكل 1).

أرقام متطابقة
  1. تنمو من الخلايا في صفيحة 24-جيدا في 0.5 مل من المناسب استكمال الثقافة المتوسطة ح 16 قبل الاختبار. البذور 30,000 لجنة نهر الميكونج-5 خلايا أو خلايا هيلا 50,000 50,000 هوة-7 خلايا كل بئر. تأكد لتجنب تجاوز التقاء 60-70% (الشكل 1A).
  2. -6 إعداد الأنابيب مع 1.5 مل من خلية كاملة الثقافة المتوسطة مع زيادة تركيزات بوروميسين (0، 5، 10، 15، 20، و 30 ميكروغرام/مل). قبل الحارة في 37 درجة مئوية.
  3. لكل تركيز بوروميسين المتوسطة (أعد الخطوة 1.2)، نقل 0.5 مل من كل أنبوب إلى 6 أنابيب جديدة وإضافة سيكلوهيكسيميدي بتركيز 50 ميكروغرام/مل نهائي لجميع الأنابيب الجديدة 6. قبل الحارة في 37 درجة مئوية.
    4. تغيير
  4. المتوسطة مع 0.5 مل من إكمال الثقافة المتوسطة (الصف 1 و 2). بالنسبة للصف الثالث، إضافة 0.5 مل متوسطة ثقافة كاملة وتستكمل مع 50 ميكروغرام/مل من سيكلوهيكسيميدي ( الشكل 1B).
    ملاحظة: تم إنشاء معاملة سيكلوهيكسيميدي كأفضل لمراقبة سلبية للبروتين بوروميسيليشن نظراً لقدرته على منع استطالة الترجمة. لأنه يتطلب إدماج بوروميسين استطالة الترجمة، سيكلوهيكسيميدي في المعاملة يؤدي إلى فقدان بوروميسيلاتيد البروتين إشارات 5 ، 18-
  5. احتضانها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية (5% CO 2)-
  6. إضافة 0.5 مل الوسط بوروميسين إعدادها في الخطوة 1.2 للصف الثاني للحصول على تركيزات نهائية من 0 و 2.5، 5، 7.5، 10 و 15 ميكروغرام/مل، على التوالي، في أعمدة أ، ب، ج، د، هاء وواو. في الوقت نفسه، إضافة 0.5 مل بوروميسين إلى سيكلوهيكسيميدي تكمل المتوسطة (الخطوة 1.3) في الصف الثالث ( الشكل 1).
  7. احتضانها لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (5% CO 2)-
  8. إضافة 0.5 مل الوسط بوروميسين إعدادها في الخطوة 1.2 للصف الأول للحصول على تركيزات نهائية من 0.0 و 2.5، 5، 7.5، 10 و 15 ميكروغرام/مل ( الشكل 1).
  9. احتضانها لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (5% CO 2)-
  10. يغسل كل من الصفوف 1 إلى 3 مع 1 مل من المثلج 1 X مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) 5 دقائق بعد الإضافة من بوروميسين إلى الآبار للصف الأول (يغسل مرتين). إضافة ميليلتر 75 من المخزن المؤقت X Laemmli 1 (4% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، 4% 2-mercaptoethanol، 0.120 HCl تريس م الأس الهيدروجيني 6.8، والغليسيرول 0.004% بروموفينول الأزرق، و 10 في المائة) للحصول على كامل الخلية ليساتيس لكل شرط.
  11. تشغيل 10% الحزب الديمقراطي الصربي-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) باستخدام 1/3 عينات المعدة لتقييم إدماج بوروميسين.
    1. تحديد مستوى إدماج بوروميسين بتحليل لطخة غربية لاستخدام جسم مضاد بوروميسين المضادة (د 10 12) المخفف بنسبة 1:25,000 في جسم الابتدائي الحضانة المخزن المؤقت (2% ألبومين المصل البقري (BSA)) 430 ملم كلوريد الصوديوم، 10 مم تريس الأس الهيدروجيني 7.4 و 0.01 ٪ أزيد الصوديوم).
      ملاحظة: تظهر الصور التمثيلية المقابلة لمقتطفات خط خلية مختلفة كما هو موضح في الخطوة 1 كأمثلة في الشكل 2-

2. في سيلولو مترجمة "ترجمة التصور"

ملاحظة: استخدمت الأسلوب الموصوفة هنا لتقييم الترجمة المترجمة داخل سايكس في لجنة نهر الميكونج-5 الخلايا أثناء عملية الالتصاق 5. على الرغم من أن لجنة نهر الميكونج-5 خلايا تستخدم هنا، يمكن استخدام خطوط الخلايا الأخرى بنفس المنهجية الموضحة في الخطوة 2، 1-

  1. خلية إعداد-
    1. 5 MRC فصل الخلايا باستخدام 0.25% التربسين/2.21 ملم حمض الإيثيلين (يدتا) في هانك ' s حل متوازن الملح (حبس). بيليه الخلايا بالطرد المركزي (5 دقائق في 200 س ز) في أنبوب 15 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي، وتعليق عليها في دولبيكو ' s التعديل النسر المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) في 40,000 خلايا/مل بعد فرز الأصوات بدائرة عد.
    2. احتضان خلايا معلقة في 37 درجة مئوية تحت دوران لطيف باستخدام المدورة أنبوب لمدة 20 دقيقة للحفاظ عليها في التعليق.
      ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة للسماح للانفصال الكامل من المجمعات التصاق المحورية.
    3. مل 2 لوحة علقت لجنة نهر الميكونج-5 خلايا (40,000 خلايا/مل) في اثنين 35 ملم الزجاج-أسفل الأطباق. استخدام الطبق أسفل الزجاج 35 ملم الأولى للانزيم بوروميسيليشن (راجع الخطوة 2.1.5) واستخدام الثاني كعنصر تحكم سلبية (راجع الخطوة 2.1.6)-
    4. إبقاء الخلايا في 37 درجة مئوية (5% CO 2) لمدة 55 دقيقة للسماح للالتصاق الخلوي وتشكيل SIC.
    5. بوروميسين إضافة إلى المتوسطة في الأطباق أسفل الزجاج 35 ملم (مقايسة) استخدام تركيز المعرفة مسبقاً في قسم 1. استخدام لعلاج الخلايا لجنة نهر الميكونج--5، 10 ميكروغرام/مل بوروميسين لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (5% CO 2)-
    6. كعنصر سلبي، إضافة سيكلوهيكسيميدي إلى الطبق 35 ملم الزجاج-السفلي الثاني 40 دقيقة بعد زرع الخلايا إلى ما قبل تعاملهم مع 50 ميكروغرام/مل سيكلوهيكسيميدي ( الشكل 2). ثم إضافة 15 دقيقة بعد إضافة سيكلوهيكسيميدي، بوروميسين إلى متوسط استخدام في نفس الوقت تركيز والحضانة كما هو الحال في الخطوة 2.1.5 (مثلاً، استخدام 10 ميكروغرام/مل من بوروميسين لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (5% CO 2) للجنة نهر الميكونج-5)-
    7. يغسل كل لوحة مرتين مع 2 مل من المثلج 1 X برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا مع 1 مل من 4% فورمالدهايد (مخففة في برنامج تلفزيوني X 1) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      تنبيه: بارافورمالدهيد يجب أن يقتصر استخدامها في غطاء كيميائية.
  2. إيمونوستينينج.
    1. بعد التثبيت بارافورمالدهيد، يغسل ثلاث مرات مع 2 مل من 1 X PBS واحتضانها في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-تريتونكس-100 (0.5 في المائة) لمدة 20 دقيقة في RT الخلايا بيرميبيليزي-
    2. لمنع جسم غير محدد ملزم، كتلة العينة مع 500 ميليلتر PBS – جيش صرب البوسنة (1%) لمدة 20 دقيقة في الرايت
    3. تغسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%)، واحتضان مع 300 ميليلتر من 1:12,500 بوروميسين المضادة الأجسام المضادة (د 10 12) المخفف في برنامج تلفزيوني X 1 ح 1 في الرايت
    4. أغسل 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%)، واحتضان مع 300 ميليلتر من الماوس المضادة مترافق مفتش إلى فلوروفوري (هنا، 488 نانومتر) المخفف في برنامج تلفزيوني لتصور البروتينية بوروميسيلاتيد ومع فالويدين مترافق إلى فلوروفوري آخر (هنا، 555 نانومتر) أن تصور واكتين. احتضانها ح 1 في الرايت
    5. يغسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%)، وثم احتضانها لمدة 5 دقائق في RT في 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%) وتستكمل مع 1 ميكروغرام/مل 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)-
    6. يغسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%)، ويغسل مع 2 مل من 1 X PBS. منع الخلايا من التجفيف بحفظ العينة في 2 مل 1 X برنامج تلفزيوني أثناء الحصول على الصور-

3. الحصول على الصور إيممونوفلوريسسينت

ملاحظة: المنهجية التالية التي يمكن استخدامها مع أي نظام التصوير المتاحة تجارياً [كنفوكل].

إعدادات
  1. تحديد المناسبة لكل فلوروفوري لزيادة النطاق الديناميكي للقياس الكمي-
    ملاحظة: الممثل الكمي يمكن يمكن الحصول عليها إلا إذا تجنب التشبع بكسل ويتم ضبط عتبة إشارة بشكل صحيح. يمكن أن تكون هذه الإعدادات الحصول على تحقيقها عن طريق تعديل قوة الليزر، الجهد العالي (HV)، بعناية، والإزاحة. عامل
    1. ضبط التكبير/التصغير (5 X) وعدد وحدات البكسل (512 × 512) لتحسين حجم بكسل-
      ملاحظة: هذا ينبغي أن يكون على الأقل 2.3-مرات أصغر من الدقة البصرية، ووفقا لنظرية نايكست.
    2. تقلل من سرعة المسح الضوئي (12.5-20 المايكروثانيه بيكسل) واستخدم في المتوسط (2-3 مرات) لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء طبقاً للإعدادات المذكورة أعلاه-
  2. يدوياً تحديد المناسبة أعلى وأسفل الطائرات التركيز على طول محور "ع" مع حجم الخطوة المثلى (0.4 ميكرومتر في شريحة).
    ملاحظة: يتم تحديد الطائرة حجم الخطوة القرار المحوري مقسوماً على 2، 3، وفقا لنظرية نايكست. عادة، تكون الطبقات 20-25 اللازمة لتغطية عمق الخلية بأكملها من الخلايا ملتصقة.
  3. الحصول على صورة [كنفوكل] من خلية واحدة كاملة مع 60 X Apo خطة نفط غمر هدفا (1.42 الفتحة العددية)-

4. تحديد حجم الصورة إيمونوفلوريسسينت

  1. التصميم لتخصيب.
    1. فتح صورة المقابلة لطبقة z-الطائرة من الفائدة من ملف البيانات خلية المكتسبة باستخدام برنامج إيماجيج (مجانية متاحة في http://fiji.sc)-
    2. رسم خط باستخدام أداة خط الرسم (شريط الأدوات → على التوالي) عبر مناطق الخلية حيث يتم رغبت القياس الكمي. تعديل عرض الخط بالنقر المزدوج فوق " على التوالي؛ " سوف بلغ متوسط قيم الكثافة من خلال عرض السطر (تعيين الساعة 8 في الشكل 3).
      ملاحظة: خط أرق من المفضل تجنب تداخل الإشارات من هياكل مختلفة-
    3. بعد أن يتم تعيين بشكل صحيح في السطر، الشخصية كثافة إشارة على طول محور العزم (شريط القوائم → تحليل → ارسم الشخصية)-
      ملاحظة: سيتم فتح نافذة جديدة يظهر ملف تعريف المقابلة لشدة الإشارة لكل بكسل للقناة المحددة (محددة fluorophore) على طول الخط للمقطع z-الطائرة المحدد.
      1. تكرار هذه العملية لكل قناة المقابلة fluorophore المستخدمة (أي، واحد التحديد الكمي ل 488، واحد 568، وواحدة ل 405)-
        ملاحظة: قيمة كثافة إشارة سوف دائماً يكون أمرت بعد اتجاه خط مرسومة.
    4. للحصول على قيم الرمادي تحجيم العددية لكل بكسل للشخصية المقابلة كوانتيفيكاتيونس طبقة z-الطائرة المحدد، قم بنسخ البيانات الشخصية (شريط القوائم في إطار الصورة → نسخة) ولصقها في أي برنامج جدول بيانات.
      5. 4.1.1-4.1.4
    5. تكرار الخطوات لكل قسم z-الطائرة من الصورة [كنفوكل] المكتسبة وكل قناة حيث المطلوب هو التحديد الكمي-
      ملاحظة: يمكن تجميع التحديد الكمي لطبقات z-طائرة مختلفة للحصول على تقييم عام لإثراء الإشارات الخاصة بحساب قيمة المبلغ لكل بكسل على طول الخط لكل طبقة z-الطائرة. هذا النوع من تجميع يتحقق إلا إذا كان الخط الذي رسمته متطابقة لكل طبقة z-الطائرة المدرجة في القيم الوسطية.
    6. كأسلوب بديل لتحديد مقدار كامل الخلية من قنوات مختلفة مع عدد كبير من الطبقات، استخدام الماكرو تسمى ستاكبروفيليداتا (انظر الملف التكميلي)-
      ملاحظة: هذا الماكرو يمكن الوصول إليها بحرية في https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt ويمكن أن تستخدم على النحو التالي:
      1. لصق الماكرو إلى ملف نصي وحفظ عليه.
      2. فتح ملف الصورة الذي يحتوي على كافة الطبقات [كنفوكل] من الخلية.
      3. رسم خط، كما هو موضح في الخطوة 4.1.2، فتح نافذة جديدة لاستيراد الماكرو (شريط القوائم → الإضافات → وحدات الماكرو → تشغيل) واختر الملف النصي المحفوظ مسبقاً المقابلة إلى الماكرو ستاكبروفيليداتا ثم انقر " فتح. "
        ملاحظة: بعد استيراد الماكرو، نافذة جديدة تسمى " نتائج " سيتم فتح وكل التقدير الكمي على طول محور العزم سيتم سرد لكل طبقة z-الطائرة وقناة موجودة في ملفات الصورة.
      4. نسخ البيانات لكل قناة (شريط القوائم → تحرير → نسخة) للحصول على تمثيل رسومي الشخصية المقابلة كوانتيفيكاتيونس إشارة. لصقها في أي برنامج جدول بيانات. حساب قيمة المبلغ لكل قناة لكل بكسل على طول الخط لكل طبقة z-الطائرة. استخدام هذه القيم لإنشاء تمثيل رسومي مماثلة لتلك المعروضة في الشكل 3-
  2. التحديد الكمي للإشارات في مكان مخصص منطقة الخلوية أو وحدة التخزين-
    1. فتح ملف الصورة باستخدام برنامج إيماجيج-
    2. رسم مجالاً للدلالة على مجال الاهتمام باستخدام الدالة شكل هندسي (شريط الأدوات → " المستطيل، " " البيضاوي، " أو " المضلع ")-
      ملاحظة: سيتم تحديد قيمة القياس الكمي للمنطقة المقابلة للنموذج مرسومة.
    3. ضبط مستوى العتبة لتجنب أي إشارة خلفية (شريط القوائم → "ضبط الصورة" → العتبة)؛ سوف تظهر نافذة جديدة لتمثيل كثافة بكسل في نموذج الرسم البياني. قم بتغيير القيم تضمين/استبعاد البيكسلات في التحديد الكمي باستخدام شريط التمرير. حدد عتبة أن يلغي الحمراء بكسل خارج الخلية، كما سلط الضوء على اللون الأحمر بكسل ستدرج في التحديد الكمي-
    4. تعريف معلمات القياس لقياس الإشارات بكسل داخل المنطقة المحددة، دون إشارة خلفية (شريط القوائم → تحليل → تعيين قياسات)، وتأكد من التحقق من " الحد الأقصى لعتبة " " "كثافة المتكاملة" " مربعات-
    5. قياس القيم الكمية للمنطقة المحددة (شريط القوائم → تحليل → التدبير).
      ملاحظة: ستقدم إشارة كثافة الكمي في نافذة جديدة تحت " إينتدين " الهوية، الذي يمثل نتاج قيم رمادي متوسط وعدد وحدات البكسل داخل المنطقة المحددة.
      6. رسم
    6. منطقة التي تضم الخلية بأكملها باستخدام شكل هندسي (شريط الأدوات → " المستطيل، " " البيضاوي، " أو " المضلع ") والمضي قدما في خطوات 4.2.3-4.2.5 للحصول على قيمة المقابلة للإشارة الإجمالية. حساب نسبة الإشارة داخل المنطقة المحددة عبر إشارة كاملة للحصول على النسبة المئوية للإشارة ضمن مجال الاهتمام.
      7. كرر الخطوات 4.2.2-4.2.6 للحصول على التقدير الكمي لحجم الخلية لكل طائرة z
    7. . التكيف مع شكل هندسي حسب الحاجة.
    8. نسخ/لصق البيانات التي تم الحصول عليها من " نتائج " windows لكل طبقة z-الطائرة إلى جدول بيانات لتصوير رسومي والعثور على قيمة متوسط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدقة مراقبة أحداث الترجمة باستخدام إدراج بوروميسين، من الأهمية بمكان لتحديد الظروف المثلى لكل خط الخلية لأنه يظهر كل بوروميسين مختلفة إدماج حركية (الشكل 1)9،11 ،،من1218. ومن ثم، للتحقق من صحة إدراج بوروميسين، من الضروري التعامل مع خط الخلية المطلوب مع مجموعة موحدة من التركيزات المتزايدة بوروميسين (1.0 و 2.5، 5.0، 7.5، 10.0 و 15.0 م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأتاحت التطورات التكنولوجية الحديثة لفهم أفضل لآليات المشاركة في upregulation متعدية الجنسيات أو قمع مرناس محددة في العمليات البيولوجية، مثل تنمية الخلايا العصبية والمخدرات واستجابة وورم خبيث. منهجية فعالة من حيث التكلفة الموضحة هنا يسمح لترجمة الأحداث تصور في الخلايا لدراسة كيف البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة تنظم عمليات المنتشر، مثل التصاق الخلوية، والهجرة، والغزو.

على الرغم من أن قد وضعت أساليب عديدة لتقييم الترجمة البروتين حيثياته ، أنهم جميعا مشاركة نفس الاستراتيجية، التي تت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر الدكتور رشيد المزروعي (جامعة لافال، كيبيك، كندا) لقراءة نقدية من المخطوطة. ونحن نشكر "وحدة التصوير الخلية" التابعة لمركز البحوث الخاصة بالمساعدة التقنية. هوت م. É. هو أحد علماء البحوث 1 جونيور دي فوندز بحوث دو كيبيك والصحة (فرق-S). هذا العمل كان يدعمها "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" (منح عدد استوفوا، 286437 اجتماع الأطراف أن É م. هوت).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMwisent319-005-CL
Trypsinewisent325-043 EL
FBSThermo Fisher Scientific12483020
Puroycin الأجسام المضادة 12D10EMD milliporeMABE343تخفيف اللطخة الغربية 1: 25،000
تخفيف التألق المناعي 1: 10،000
IgG المضاد للفأر ، إشارات خلايا الأجسام المضادة المرتبطة ب HRP التكنولوجيا7076اللطخة الغربية 1: 8,000
Western Lightning Plus-ECLPerkin ElmerNEL104001EA
IgG المضاد للفأر (H + L) ، F (ab') 2< / sub> جزء (Alexa Fluor 488 Contringate)إشارات الخلية4408الفلور المناعي 1: 400
CF568 الفالودينالبيوتيوم00044الفلور المناعي 1: 400
CyclohexmideSigmaC1988-1G50 & micro; جم / مل التركيز النهائي
DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، Dihydrochloride)InvitrogenD1306التركيز النهائي 1 & micro ؛ جم / مل
بوروميسينبيو بيسكPJ5932.5 ومايكرو ؛ جم / مل إلى 10 & مايكرو ؛ جم / مل
Ibidi & micro ؛ - طبق 35 مم ، مرتفع ، ibiTreatIbidi81156
MRC-5 خلاياATCCCCL-171
خلايا HeLaATCCCCL-2
Huh-7 خلايامن Dr. Mazroui (Universit & eacute; لافال)
نظام التصوير متحد البؤرFv1000أوليمبوس
برنامج فيجيhttp://fiji.sc
PBS (فوسفات بافأحمر سالين) بيوبيسكPD8117
الفورمالديهايد 37٪ محلولحيوي أساسيC5300-1
تريتون X-100بيو بياسيكTB0198
BSAكواشف فيشر الحيويةBP9702-100
Tween20فيشر الكواشف الحيويةBP337-500
تخفيف تقنية تخفيف تخفيف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  2. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  3. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  4. Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
  5. Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
  6. El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192(2016).
  7. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
  8. Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
  9. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
  10. Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
  11. Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
  12. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
  13. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  14. Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
  15. Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
  16. Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
  17. Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
  18. Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
  19. Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968(2012).
  20. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
  21. Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
  22. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MRC 5

مقالات ذات صلة