الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

تنظيم الترجمة بمختلف الوظائف الخلوية ودفعت العديد من فرق البحث لتطوير أدوات جديدة وأساليب لتحديد التعريب سوبسيلولار الترجمة مرناً وتنظم البروتين التوليف^{1،2 ،،}من³⁴. تسمح هذه التطورات التكنولوجية الحديثة لتحسين فهم الآليات التي تنطوي على أوبريجولاتيون الترجمة أو قمع مرناس محددة خلال العمليات البيولوجية، مثل تنمية الخلايا العصبية والمخدرات واستجابة وورم خبيث^{5 6، ،،}من⁷⁸. ومع ذلك، تتطلب معظم هذه الطرق مكلفة أو الخطرة والمواد الكيميائية ومعدات معينة قد لا تكون متاحة لمعظم المختبرات. على هذا النحو، قد وضعت طريقة فعالة من حيث التكلفة للسماح للتقييم السريع للأحداث الترجمة للتحايل على وجه التحديد هذه القضايا المحتملة. هذا الأسلوب يكشف التحويرات متعدية الحادة التي تحدث أثناء العمليات الخلوية المحددة ويسمح أيضا لإضفاء الطابع المحلي على الترجمة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل].

واستخدمت الأساليب الموصوفة هنا لرصد الترجمة المترجمة داخل مقصورات سوبسيلولار تسمى الشروع في نشر مراكز (SIC)⁵. سيكس هي عابرة الهياكل الموجودة في خلايا المصنف التي يتم ترجمتها على رأس المجمعات التصاق الوليدة. رغم سايكس ومجمعات التصاق متميزة، ترتبط ارتباطاً وثيقا مصائرهم. وفي الواقع، معروفة سايكس تختفي تدريجيا عند نضوج التصاق المحورية المعقدة إلى موقع التصاق خلال المرحلة الأولية للالتصاق. وجدنا أن الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات المعروفة للسيطرة على وجه التحديد مرناً الترجمة (مثلاً، Sam68، فمرب، و G3BP1) وبوليادينيلاتيد وقد أثري الكشف داخل هذه الهياكل⁵. باستخدام الأساليب الموضحة هنا، أظهرنا أن تنظيم مرناً SIC المرتبطة بمثابة الترجمة السماح بتفتيش المصنف الخلايا توطيد التصاق الخلية. ويمكن اعتبار هذا الأسلوب، استناداً إلى التأسيس بوروميسين، صيغة معدلة للاستشعار السطحية للمقايسة الترجمة (غروب الشمس). وضعت أصلاً لقياس معدلات توليف البروتين العالمية باستخدام الأحماض الأمينية مسماة غير إشعاعيا، بوروميسيليشن البروتين يوفر طريقة فعالة لتصور حيثياته البروتين التوليف⁹. يعتمد هذا الأسلوب على السلوك الجوهرية من بوروميسين، مضاد كتل الترجمة عن طريق إنهاء سلسلة سابقة لأوانها في الريبوسوم¹⁰. وفي الواقع، بوروميسين يماثل هيكلياً تيروسيل-الحمض الريبي النووي النقال، يسمح لإدماجها في سلاسل ببتيد عبر تشكيل السندات ببتيد التمطيط. بيد بوروميسين ملزم لسلسلة ببتيد متزايد يمنع سندات ببتيد جديدة يجري تشكيلها بالقادم أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال، منذ بوروميسين سندات غير هيدروليسابل أميد بدلاً من السندات إستر هيدروليسابل وجدت في ترنس. وهكذا يؤدي إدماج بوروميسين في التمطيط البروتينية في إصدار سابق لأوانه عديدة بوروميسيلاتيد مبتوراً البروتينية المقابلة لترجمتها بنشاط مرناً^9،11،12 .

باستخدام هذا الأسلوب، كان من الممكن لتقييم الترجمة النشطة خلال وقت قصير أرملة (مثلاً 5 دقائق) خلال الالتصاق الخلوي استخدام جسم محددة موجهة ضد بوروميسين في الخلايا التي استكملت بالمضادات الحيوية لفترات 5-دقيقة في نقاط زمنية مختلفة خلال عملية التصاق الخلية⁵. دقة هذا الفحص يعتمد على أجسام مضادة محددة للغاية الموجهة ضد مجموعة بوروميسيلاتيد. ويوفر اكتشاف ببتيد بوروميسيلاتيد إيممونوفلوريسسينت إعادة تقسيم سوبسيلولار عامة مرناً المترجمة حديثا، التي يمكن قياسها كمياً بدقة كبيرة باستخدام نظم التصوير [كنفوكل] أيضا.

ومن ثم، يقدم هذا الأسلوب خيار المناسب لعدد كبير من المختبرات التي تدرس آليات تنظيمية متعدية الجنسيات المشاركة في العمليات مثل تحبيب العصبية^6،،من^{1314، 15}ومورفوجين مرناً التعريب والترجمة خلال التنمية^16،17. وأيضا مناسب تماما لدراسة الترجمة المترجمة أو المجزأة أثناء الأحداث البيولوجية السريعة، مثل الهجرة الخلية أو الالتصاق أو الغزو، أو لمجرد تقييم العلاج بالعقاقير التي قد تسبب التغييرات متعدية^{5، 7 , 18}-وعموما، يسمح هذا الأسلوب لتصور الأحداث الترجمة المترجمة أو التي تسيطر عليها بطريقة سريعة ودقيقة وفعالة من حيث التكلفة.

1-"تحديد شروط بوروميسيليشن"

ملاحظة: هذا الأسلوب توضح هذه المقالة الطريقة المستخدمة لتقييم الترجمة المترجمة خلال عملية التصاق الخلايا لجنة نهر الميكونج--5 ⁵. كما يمكن أن يتم بوروميسيليشن في أي خلية، من المهم تحسين شروط بوروميسيليشن خطوط خلية معينة لاستخدامها، لأن شروط المعاملة ليست متطابقة لكل خط الخلية من حيث تركيز بوروميسين والمطلوب وقت الحضانة. لإظهار كيفية تعريف هذه الشروط، يعاملون ثلاثة خطوط الخلايا مثال (أي، هيلا، لجنة نهر الميكونج--5، وهوه-7) مع زيادة تركيزات بوروميسين لاحتضان مختلف الأوقات ( الشكل 1).

1. تنمو من الخلايا في صفيحة 24-جيدا في 0.5 مل من المناسب استكمال الثقافة المتوسطة ح 16 قبل الاختبار. البذور 30,000 لجنة نهر الميكونج-5 خلايا أو خلايا هيلا 50,000 50,000 هوة-7 خلايا كل بئر. تأكد لتجنب تجاوز التقاء 60-70% (الشكل 1A).
2. -6 إعداد الأنابيب مع 1.5 مل من خلية كاملة الثقافة المتوسطة مع زيادة تركيزات بوروميسين (0، 5، 10، 15، 20، و 30 ميكروغرام/مل). قبل الحارة في 37 درجة مئوية.
3. لكل تركيز بوروميسين المتوسطة (أعد الخطوة 1.2)، نقل 0.5 مل من كل أنبوب إلى 6 أنابيب جديدة وإضافة سيكلوهيكسيميدي بتركيز 50 ميكروغرام/مل نهائي لجميع الأنابيب الجديدة 6. قبل الحارة في 37 درجة مئوية.
تغيير
4. المتوسطة مع 0.5 مل من إكمال الثقافة المتوسطة (الصف 1 و 2). بالنسبة للصف الثالث، إضافة 0.5 مل متوسطة ثقافة كاملة وتستكمل مع 50 ميكروغرام/مل من سيكلوهيكسيميدي ( الشكل 1B).
   ملاحظة: تم إنشاء معاملة سيكلوهيكسيميدي كأفضل لمراقبة سلبية للبروتين بوروميسيليشن نظراً لقدرته على منع استطالة الترجمة. لأنه يتطلب إدماج بوروميسين استطالة الترجمة، سيكلوهيكسيميدي في المعاملة يؤدي إلى فقدان بوروميسيلاتيد البروتين إشارات ^{5 ، 18}-
5. احتضانها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية (5% CO ₂)-
6. إضافة 0.5 مل الوسط بوروميسين إعدادها في الخطوة 1.2 للصف الثاني للحصول على تركيزات نهائية من 0 و 2.5، 5، 7.5، 10 و 15 ميكروغرام/مل، على التوالي، في أعمدة أ، ب، ج، د، هاء وواو. في الوقت نفسه، إضافة 0.5 مل بوروميسين إلى سيكلوهيكسيميدي تكمل المتوسطة (الخطوة 1.3) في الصف الثالث ( الشكل 1).
7. احتضانها لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (5% CO ₂)-
8. إضافة 0.5 مل الوسط بوروميسين إعدادها في الخطوة 1.2 للصف الأول للحصول على تركيزات نهائية من 0.0 و 2.5، 5، 7.5، 10 و 15 ميكروغرام/مل ( الشكل 1).
9. احتضانها لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (5% CO ₂)-
10. يغسل كل من الصفوف 1 إلى 3 مع 1 مل من المثلج 1 X مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) 5 دقائق بعد الإضافة من بوروميسين إلى الآبار للصف الأول (يغسل مرتين). إضافة ميليلتر 75 من المخزن المؤقت X Laemmli 1 (4% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، 4% 2-mercaptoethanol، 0.120 HCl تريس م الأس الهيدروجيني 6.8، والغليسيرول 0.004% بروموفينول الأزرق، و 10 في المائة) للحصول على كامل الخلية ليساتيس لكل شرط.
11. تشغيل 10% الحزب الديمقراطي الصربي-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) باستخدام 1/3 عينات المعدة لتقييم إدماج بوروميسين.
    1. تحديد مستوى إدماج بوروميسين بتحليل لطخة غربية لاستخدام جسم مضاد بوروميسين المضادة (د 10 12) المخفف بنسبة 1:25,000 في جسم الابتدائي الحضانة المخزن المؤقت (2% ألبومين المصل البقري (BSA)) 430 ملم كلوريد الصوديوم، 10 مم تريس الأس الهيدروجيني 7.4 و 0.01 ٪ أزيد الصوديوم).
       ملاحظة: تظهر الصور التمثيلية المقابلة لمقتطفات خط خلية مختلفة كما هو موضح في الخطوة 1 كأمثلة في الشكل 2-

2. في سيلولو مترجمة "ترجمة التصور"

ملاحظة: استخدمت الأسلوب الموصوفة هنا لتقييم الترجمة المترجمة داخل سايكس في لجنة نهر الميكونج-5 الخلايا أثناء عملية الالتصاق ⁵. على الرغم من أن لجنة نهر الميكونج-5 خلايا تستخدم هنا، يمكن استخدام خطوط الخلايا الأخرى بنفس المنهجية الموضحة في الخطوة 2، 1-

1. خلية إعداد-
   1. 5 MRC فصل الخلايا باستخدام 0.25% التربسين/2.21 ملم حمض الإيثيلين (يدتا) في هانك ' s حل متوازن الملح (حبس). بيليه الخلايا بالطرد المركزي (5 دقائق في 200 س ز) في أنبوب 15 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي، وتعليق عليها في دولبيكو ' s التعديل النسر المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) في 40,000 خلايا/مل بعد فرز الأصوات بدائرة عد.
   2. احتضان خلايا معلقة في 37 درجة مئوية تحت دوران لطيف باستخدام المدورة أنبوب لمدة 20 دقيقة للحفاظ عليها في التعليق.
      ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة للسماح للانفصال الكامل من المجمعات التصاق المحورية.
   3. مل 2 لوحة علقت لجنة نهر الميكونج-5 خلايا (40,000 خلايا/مل) في اثنين 35 ملم الزجاج-أسفل الأطباق. استخدام الطبق أسفل الزجاج 35 ملم الأولى للانزيم بوروميسيليشن (راجع الخطوة 2.1.5) واستخدام الثاني كعنصر تحكم سلبية (راجع الخطوة 2.1.6)-
   4. إبقاء الخلايا في 37 درجة مئوية (5% CO ₂) لمدة 55 دقيقة للسماح للالتصاق الخلوي وتشكيل SIC.
   5. بوروميسين إضافة إلى المتوسطة في الأطباق أسفل الزجاج 35 ملم (مقايسة) استخدام تركيز المعرفة مسبقاً في قسم 1. استخدام لعلاج الخلايا لجنة نهر الميكونج--5، 10 ميكروغرام/مل بوروميسين لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (5% CO ₂)-
   6. كعنصر سلبي، إضافة سيكلوهيكسيميدي إلى الطبق 35 ملم الزجاج-السفلي الثاني 40 دقيقة بعد زرع الخلايا إلى ما قبل تعاملهم مع 50 ميكروغرام/مل سيكلوهيكسيميدي ( الشكل 2). ثم إضافة 15 دقيقة بعد إضافة سيكلوهيكسيميدي، بوروميسين إلى متوسط استخدام في نفس الوقت تركيز والحضانة كما هو الحال في الخطوة 2.1.5 (مثلاً، استخدام 10 ميكروغرام/مل من بوروميسين لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (5% CO ₂) للجنة نهر الميكونج-5)-
   7. يغسل كل لوحة مرتين مع 2 مل من المثلج 1 X برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا مع 1 مل من 4% فورمالدهايد (مخففة في برنامج تلفزيوني X 1) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      تنبيه: بارافورمالدهيد يجب أن يقتصر استخدامها في غطاء كيميائية.
2. إيمونوستينينج.
   1. بعد التثبيت بارافورمالدهيد، يغسل ثلاث مرات مع 2 مل من 1 X PBS واحتضانها في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-تريتونكس-100 (0.5 في المائة) لمدة 20 دقيقة في RT الخلايا بيرميبيليزي-
   2. لمنع جسم غير محدد ملزم، كتلة العينة مع 500 ميليلتر PBS – جيش صرب البوسنة (1%) لمدة 20 دقيقة في الرايت
   3. تغسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%)، واحتضان مع 300 ميليلتر من 1:12,500 بوروميسين المضادة الأجسام المضادة (د 10 12) المخفف في برنامج تلفزيوني X 1 ح 1 في الرايت
   4. أغسل 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%)، واحتضان مع 300 ميليلتر من الماوس المضادة مترافق مفتش إلى فلوروفوري (هنا، 488 نانومتر) المخفف في برنامج تلفزيوني لتصور البروتينية بوروميسيلاتيد ومع فالويدين مترافق إلى فلوروفوري آخر (هنا، 555 نانومتر) أن تصور واكتين. احتضانها ح 1 في الرايت
   5. يغسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%)، وثم احتضانها لمدة 5 دقائق في RT في 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%) وتستكمل مع 1 ميكروغرام/مل 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)-
   6. يغسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%)، ويغسل مع 2 مل من 1 X PBS. منع الخلايا من التجفيف بحفظ العينة في 2 مل 1 X برنامج تلفزيوني أثناء الحصول على الصور-

3. الحصول على الصور إيممونوفلوريسسينت

ملاحظة: المنهجية التالية التي يمكن استخدامها مع أي نظام التصوير المتاحة تجارياً [كنفوكل].

1. تحديد المناسبة لكل فلوروفوري لزيادة النطاق الديناميكي للقياس الكمي-
   ملاحظة: الممثل الكمي يمكن يمكن الحصول عليها إلا إذا تجنب التشبع بكسل ويتم ضبط عتبة إشارة بشكل صحيح. يمكن أن تكون هذه الإعدادات الحصول على تحقيقها عن طريق تعديل قوة الليزر، الجهد العالي (HV)، بعناية، والإزاحة. عامل
   1. ضبط التكبير/التصغير (5 X) وعدد وحدات البكسل (512 × 512) لتحسين حجم بكسل-
      ملاحظة: هذا ينبغي أن يكون على الأقل 2.3-مرات أصغر من الدقة البصرية، ووفقا لنظرية نايكست.
   2. تقلل من سرعة المسح الضوئي (12.5-20 المايكروثانيه بيكسل) واستخدم في المتوسط (2-3 مرات) لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء طبقاً للإعدادات المذكورة أعلاه-
2. يدوياً تحديد المناسبة أعلى وأسفل الطائرات التركيز على طول محور "ع" مع حجم الخطوة المثلى (0.4 ميكرومتر في شريحة).
   ملاحظة: يتم تحديد الطائرة حجم الخطوة القرار المحوري مقسوماً على 2، 3، وفقا لنظرية نايكست. عادة، تكون الطبقات 20-25 اللازمة لتغطية عمق الخلية بأكملها من الخلايا ملتصقة.
3. الحصول على صورة [كنفوكل] من خلية واحدة كاملة مع 60 X Apo خطة نفط غمر هدفا (1.42 الفتحة العددية)-

4. تحديد حجم الصورة إيمونوفلوريسسينت

1. التصميم لتخصيب.
   1. فتح صورة المقابلة لطبقة z-الطائرة من الفائدة من ملف البيانات خلية المكتسبة باستخدام برنامج إيماجيج (مجانية متاحة في http://fiji.sc)-
   2. رسم خط باستخدام أداة خط الرسم (شريط الأدوات → على التوالي) عبر مناطق الخلية حيث يتم رغبت القياس الكمي. تعديل عرض الخط بالنقر المزدوج فوق " على التوالي؛ " سوف بلغ متوسط قيم الكثافة من خلال عرض السطر (تعيين الساعة 8 في الشكل 3).
      ملاحظة: خط أرق من المفضل تجنب تداخل الإشارات من هياكل مختلفة-
   3. بعد أن يتم تعيين بشكل صحيح في السطر، الشخصية كثافة إشارة على طول محور العزم (شريط القوائم → تحليل → ارسم الشخصية)-
      ملاحظة: سيتم فتح نافذة جديدة يظهر ملف تعريف المقابلة لشدة الإشارة لكل بكسل للقناة المحددة (محددة fluorophore) على طول الخط للمقطع z-الطائرة المحدد.
      1. تكرار هذه العملية لكل قناة المقابلة fluorophore المستخدمة (أي، واحد التحديد الكمي ل 488، واحد 568، وواحدة ل 405)-
         ملاحظة: قيمة كثافة إشارة سوف دائماً يكون أمرت بعد اتجاه خط مرسومة.
   4. للحصول على قيم الرمادي تحجيم العددية لكل بكسل للشخصية المقابلة كوانتيفيكاتيونس طبقة z-الطائرة المحدد، قم بنسخ البيانات الشخصية (شريط القوائم في إطار الصورة → نسخة) ولصقها في أي برنامج جدول بيانات.
   4.1.1-4.1.4
   5. تكرار الخطوات لكل قسم z-الطائرة من الصورة [كنفوكل] المكتسبة وكل قناة حيث المطلوب هو التحديد الكمي-
      ملاحظة: يمكن تجميع التحديد الكمي لطبقات z-طائرة مختلفة للحصول على تقييم عام لإثراء الإشارات الخاصة بحساب قيمة المبلغ لكل بكسل على طول الخط لكل طبقة z-الطائرة. هذا النوع من تجميع يتحقق إلا إذا كان الخط الذي رسمته متطابقة لكل طبقة z-الطائرة المدرجة في القيم الوسطية.
   6. كأسلوب بديل لتحديد مقدار كامل الخلية من قنوات مختلفة مع عدد كبير من الطبقات، استخدام الماكرو تسمى ستاكبروفيليداتا (انظر الملف التكميلي)-
      ملاحظة: هذا الماكرو يمكن الوصول إليها بحرية في https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt ويمكن أن تستخدم على النحو التالي:
      1. لصق الماكرو إلى ملف نصي وحفظ عليه.
      2. فتح ملف الصورة الذي يحتوي على كافة الطبقات [كنفوكل] من الخلية.
      3. رسم خط، كما هو موضح في الخطوة 4.1.2، فتح نافذة جديدة لاستيراد الماكرو (شريط القوائم → الإضافات → وحدات الماكرو → تشغيل) واختر الملف النصي المحفوظ مسبقاً المقابلة إلى الماكرو ستاكبروفيليداتا ثم انقر " فتح. "
         ملاحظة: بعد استيراد الماكرو، نافذة جديدة تسمى " نتائج " سيتم فتح وكل التقدير الكمي على طول محور العزم سيتم سرد لكل طبقة z-الطائرة وقناة موجودة في ملفات الصورة.
      4. نسخ البيانات لكل قناة (شريط القوائم → تحرير → نسخة) للحصول على تمثيل رسومي الشخصية المقابلة كوانتيفيكاتيونس إشارة. لصقها في أي برنامج جدول بيانات. حساب قيمة المبلغ لكل قناة لكل بكسل على طول الخط لكل طبقة z-الطائرة. استخدام هذه القيم لإنشاء تمثيل رسومي مماثلة لتلك المعروضة في الشكل 3-
2. التحديد الكمي للإشارات في مكان مخصص منطقة الخلوية أو وحدة التخزين-
   1. فتح ملف الصورة باستخدام برنامج إيماجيج-
   2. رسم مجالاً للدلالة على مجال الاهتمام باستخدام الدالة شكل هندسي (شريط الأدوات → " المستطيل، " " البيضاوي، " أو " المضلع ")-
      ملاحظة: سيتم تحديد قيمة القياس الكمي للمنطقة المقابلة للنموذج مرسومة.
   3. ضبط مستوى العتبة لتجنب أي إشارة خلفية (شريط القوائم → "ضبط الصورة" → العتبة)؛ سوف تظهر نافذة جديدة لتمثيل كثافة بكسل في نموذج الرسم البياني. قم بتغيير القيم تضمين/استبعاد البيكسلات في التحديد الكمي باستخدام شريط التمرير. حدد عتبة أن يلغي الحمراء بكسل خارج الخلية، كما سلط الضوء على اللون الأحمر بكسل ستدرج في التحديد الكمي-
   4. تعريف معلمات القياس لقياس الإشارات بكسل داخل المنطقة المحددة، دون إشارة خلفية (شريط القوائم → تحليل → تعيين قياسات)، وتأكد من التحقق من " الحد الأقصى لعتبة " " "كثافة المتكاملة" " مربعات-
   5. قياس القيم الكمية للمنطقة المحددة (شريط القوائم → تحليل → التدبير).
      ملاحظة: ستقدم إشارة كثافة الكمي في نافذة جديدة تحت " إينتدين " الهوية، الذي يمثل نتاج قيم رمادي متوسط وعدد وحدات البكسل داخل المنطقة المحددة.
   رسم
   6. منطقة التي تضم الخلية بأكملها باستخدام شكل هندسي (شريط الأدوات → " المستطيل، " " البيضاوي، " أو " المضلع ") والمضي قدما في خطوات 4.2.3-4.2.5 للحصول على قيمة المقابلة للإشارة الإجمالية. حساب نسبة الإشارة داخل المنطقة المحددة عبر إشارة كاملة للحصول على النسبة المئوية للإشارة ضمن مجال الاهتمام.
   كرر الخطوات 4.2.2-4.2.6 للحصول على التقدير الكمي لحجم الخلية لكل طائرة z
   7. . التكيف مع شكل هندسي حسب الحاجة.
   8. نسخ/لصق البيانات التي تم الحصول عليها من " نتائج " windows لكل طبقة z-الطائرة إلى جدول بيانات لتصوير رسومي والعثور على قيمة متوسط.

لدقة مراقبة أحداث الترجمة باستخدام إدراج بوروميسين، من الأهمية بمكان لتحديد الظروف المثلى لكل خط الخلية لأنه يظهر كل بوروميسين مختلفة إدماج حركية (الشكل 1)9،11 ،،من1218. ومن ثم، للتحقق من صحة إدراج بوروميسين، من الضروري التعامل مع خط الخلية المطلوب مع مجموعة موحدة من التركيزات المتزايدة بوروميسين (1.0 و 2.5، 5.0، 7.5، 10.0 و 15.0 ميكروغرام/مل) لفترات مختلفة من الوقت (دقيقة 5 و 10). تقييم الترجمة المترجمة أو استجابة مبكرة للعلاج من تعاطي المخدرات، فترة حضانة أقصر المفضل (مثلاً، أقل من 5 دقائق)، كما أنه يسمح للتقييم المباشر للأحداث متعدية الجنسيات التي أعقبت مباشرة علاج محدد. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تكون قابلة للكشف بسهولة إشارة بوروميسين لكن ينبغي أيضا تجنب نقطة التشبع (الشكل 2). كما هو مبين في الشكل 2 (لوحات اليسار)، بتركيز بوروميسين مقبول 7.5 10.0 ميكروغرام/مل 5 لجنة نهر الميكونج والحلة، بينما يقترح 5.0 7.5 ميكروغرام/مل من بوروميسين هوة-7. تحسين المعلمات التجريبية بالغ الأهمية نظراً لأن الهدف من هذا الأسلوب هو لا تمنع تماما جميع استطالة متعدية الجنسيات في لحظة بدء بل الوسم سينثيتيزيد ببتيد سلاسل حديثا أثناء الترجمة للكشف عن حدة الاختلافات في الترجمة. هذه المرحلة الأولية في البروتوكول لا ينبغي توافر بوروميسين المهملة، مفرطاً ووقت المعالجة الموسعة سوف يتسبب في عواقب غير مرغوب فيها الرئيسية. كما لاحظت في الشكل 2 (حق الألواح)، سوف تولد الخلايا المعالجة لمدة 10 دقيقة مع تركيز عالية بوروميسين معظمها أصغر بوروميسيلاتيد البروتينية (مثلاً، هوة-7, 7.5 ميكروغرام/مل أو أكثر لمدة 10 دقائق). وسوف منتشر البروتينية أصغر هذه أكثر سرعة في الخلية، والتي قد تتداخل مع دقة تقييم التعريب سوبسيلولار. ثمة مشكلة أخرى أن proteolysis زيادة تحدث عند العلاج بوروميسين المفرط19. ولوحظ في لجنة نهر الميكونج-5 والحلة الخلايا يعالج من 10 دقيقة، مما أظهر إشارة انخفاض كثافة حضور 10 أو 15 ميكروغرام/مل من بوروميسين هذه النتيجة. كل من هذه الظواهر مضللة إذا كان إدراج بوروميسين يقيمها الفلورة لأنه يمنع زيادة نشر التصور الدقيق من ترجمة التعريب، بينما يقلل التدهور الناجم عن بوروميسين إلى حد كبير الكشف عن حساسية. يتم تجنب هذه الآثار غير المرغوب فيها بسهولة بتحديد أفضل الظروف التجريبية، بشكل صحيح كما هو موضح في القسم 1 من البروتوكول.

بينما تصور إدماج بوروميسين، من المهم أيضا لتنفيذ الضوابط المناسبة. كما هو موضح في الشكل 3 ألف، يمكن حظر إدراج بوروميسين كفاءة بإضافة 50 ميكروغرام/مل سيكلوهيكسيميدي، مركب معروفة لتمنع الترجمة الاستطالة20 ومن ثم إدراج بوروميسين. ويبين الشكل 3B، مما يدل على أن العلاج سيكلوهيكسيميدي كفاءة منع معظم الإشارة المقابلة لإدماج بوروميسين في ملتصقة لجنة نهر الميكونج-5 خلايا هذا السلوك. وفي الواقع، بينما يمكن تصور الببتيدات بوروميسيلاتيد في الخلايا تعامل مع بوروميسين فقط، تم الكشف عن إشارة ضعيفة في الخلايا التي تعامل أيضا مع سيكلوهيكسيميدي تحت ظروف المصبوغة مطابقة. وبدلاً من ذلك، آخر المضادات الحيوية (أنيسوميسين) يمكن أن تستخدم أيضا كعنصر سلبي، كما أنه لديه القدرة على منع النشاط ترانسفيراز بيبتيديل5 ولقد ثبت أن تكون فعالة مثل سيكلوهيكسيميدي في عرقلة إدماج بوروميسين5 ،18

وبعد الحصول على الصور إيمونوفلوريسسينت، فمن الممكن لتقييم التعريب العام من بوروميسيلاتيد البروتينية تناظر حديثا سينثيتيزيد البروتينات (الشكل 4). يتم تحديد طبقات الصورة في أعماق مختلفة داخل خلايا ملتصقة، السماح بكثافة إشارة في مقصورات سوبسيلولار تقييم في الطائرات خلية مختلفة. على هذا النحو، فمن الممكن للمقارنة بين رد فعل بوروميسيليشن مترجمة في الجزء السفلي من الخلية (الشكل 4 أ)، في منتصف الخلية (الشكل 4 باء)، أو الجزء العلوي من الخلية (الشكل 4). يقع قليلاً فوق هياكل التصاق الوليدة وماتوراتينج، ولوحظت سايكس معظمها في وسط الخلية. كما هو متوقع، يتم الكشف عن بوروميسيليشن الشديد في سايكس، مما يدل على أن الترجمة مرناً معزولة لهذه الهياكل سوبسيلولار. وكما ذكر سابقا، فمن الممكن مقارنة كثافة إشارة على طول محور المطلوب. هذه المقارنة غير ممكنة إلا إذا كان لا تقم بتضمين الصور المكتسبة مشبعة بكسل، التي تظهر باللون الأحمر في صورة درجات الرمادي (الأفرقة الثانية من الأعلى) الحصول عليها باستخدام المجهر تشغيل البرمجيات. يمكن استيراد هذه الصور إلى البرنامج إيماجيج للقياس الكمي وتحليل كثافة بكسل طول محور معين. تحديد حجم بكسل يمكن أن تمثل بيانيا (الفريق الأوسط) لتوضيح كثافة بكسل نسبي في مواقف معينة على طول المحور. إلقاء نظرة فاحصة على الإدراج في لوحات العلوي يبين حدود SIC-أكتين (باللون الأحمر) وإشارة خضراء داخل الهيكل الذي يتوافق مع الأحداث ترجمة نشطة للغاية، التي هي أثري داخل هذه الهياكل (القسم السفلي). على الرغم من أن هذا الأسلوب الكمي ليس أفضل طريقة لتحديد النسبة المئوية الدقيقة لمجموع الترجمة التي تحدث في هذه الهياكل، وهو بصريا الزاخر بالمعلومات عن طريق السماح للتقييم السريع لكثافة إشارة وهو تقريب جيد توزيع الإشارات في جميع أنحاء الخلية.

للحصول على توزيع كمية للإشارة في جميع أنحاء الخلية كلها، يجب استخدام أسلوب آخر. كما هو موضح في الشكل 5، هو إحدى الخطوات الرئيسية للدلالة على مجالات الاهتمام التي تحتاج إلى القياس الكمي لكل طائرة z يؤلف ملفات الصور [كنفوكل]. يمكن تحقيق هذه المهمة باستخدام أداة رسم مختلفة الموجودة في إيماجيج. باستخدام هذا الأسلوب، من الممكن تحديد مجال واحد أو مجالات متعددة، التي يمكن ثم مقارنة، وطرح، أو حتى تحويلها برمجياً. الصعوبات الرئيسية: (ط) إيجاد ظروف التصوير المثلى التي تجنب التشبع بكسل والإشارات الخلفية، التي قد تشوه قيمة الكمية من الإشارات التي تم الحصول عليها، و (الثاني) إنشاء المعايرة المثلى من العتبة في إيماجيج. وعلى افتراض أن كل من هذه الشروط الأمثل، هذا الأسلوب الكمي استنساخه بدرجة عالية بينما لا تزال تبقى سهلة لتنفيذ. قبل الحصول على الصور، من المهم أيضا تحديد حدود السفلي والعلوي من z-طائرات الخلية المختارة للقياس الكمي بعناية. وفي الحالة المعروضة في الشكل 4، يناظر القسم السفلي القرار الحد الأقصى للهدف، والتي غالباً ما تشمل تلويث fluorescence زائل، التي يمكن أن تقلل نسبة إشارة الهيئة SIC/خلية. وكما ذكر سابقا، سايكس وتشارك في تشكيل موقع التصاق والنضج؛ ولذلك، تقع هياكل SIC قليلاً أعلاه حديثا تشكيل مجمعات الالتصاق، الذي يستبعد fluorescence زائل من الطبقات الأسفل. وهكذا، إشارة بوروميسيليشن SIC زمنياً بالكاد مرئية في الأجزاء السفلية، بينما يمكننا أن وضوح obsتؤدي في الجزء الأوسط، شرح زيادة نسبة الجسم SIC/خلية إشارة في منطقة المتوسط مقارنة بالطائرات السفلي أو العلوي.

الشكل 1. التمثيل التجريبي بوروميسين العلاج الأمثل هو موضح في القسم 1.
(أ) تمثيل 24-جيدا للخلايا التي تبذر في التجربة (الخطوة 1، 1). (ب) التمثيل التخطيطي للخطوة 1.4 يبين التغيير المتوسطة في الصفوف 1 و 2 لوحة 24-جيدا، وإضافة سيكلوهيكسيميدي (التايوانية) لكل بئر من الصف الثالث لتركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل. (ج) التمثيل التخطيطي لمعاملة بوروميسين في الصفوف الثانية والثالثة (خطوة 1.6) 15 دقيقة بعد الخطوة 1، 4. (د) التمثيل التخطيطي لمعاملة بوروميسين في الصف الأول (الخطوة 1.8) 5 دقائق بعد الخطوة 1، 6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 2. تحديد الشروط المثلى لإدماج بوروميسين.
استخراج تحليل لطخة غربية لكامل الخلية من (أ)لجنة نهر الميكونج--5، المحتضنة هوة-7 (ب) ، (ج) هيلا خلايا، ومع تزايد تركيزات بوروميسين (0 و 2.5، 5، 7.5، 10 و 15 ميكروغرام/مل) لمدة 5 دقائق (لوحات اليسار) أو 10 دقيقة (يمين لوحات). تم اكتشاف الببتيدات بوروميسيلاتيد استخدام جسم مضاد ضد بوروميسين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3. تثبيط بوروميسيليشن باستخدام cycloheximide.
(أ) لطخة غربية يظهر تأثير سيكلوهيكسيميدي على الإنزيم بوروميسيليشن 5-مين. إدراج الكفاءة في لجنة نهر الميكونج--5، هوة-7، وخلايا هيلا عقب موك (PBS 1 X) أو العلاج سيكلوهيكسيميدي. (ب) صورة [كنفوكل] يظهر تأثير سيكلوهيكسيميدي على إدماج بوروميسين. لجنة نهر الميكونج-5 خلايا تم قبل التعامل مع برنامج تلفزيوني (صورية) أو سيكلوهيكسيميدي لمدة 15 دقيقة وثم تستكمل مع 10 ميكروغرام/مل بوروميسين + برنامج تلفزيوني 1 X (اللوحة اليمنى) أو تم الكشف عن 10 ميكروغرام/مل من بوروميسين + 50 ميكروغرام/مل من سيكلوهيكسيميدي (اللوحة اليمنى) للبروتينات بوروميسيلاتيد 5 كحد أدنى استخدام جسم مضاد ضد بوروميسين (أخضر). واو-أكتين تم الكشف عن استخدام فالويدين (أحمر)، وكانت ملطخة النواة DAPI (أزرق). إدراج في الحق تناظر تكبير 2.5 x من مربع أبيض. أشرطة = 10 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4. التحديد الكمي للنشاط متعدية الجنسيات في سايكس في ملتصقة لجنة نهر الميكونج-5 خلايا.
(أ-ج) صورة [كنفوكل] الممثل ملتصقة لجنة نهر الميكونج-5 الخلايا تعامل مع 10 ميكروغرام/مل بوروميسين لمدة 5 دقائق. تتوافق مع الصور المعروضة أسفل (A)والأوسط (ب)، وأجزاء (ج) العلوي من الخلية. تظهر لوحات العلوي البروتينات بوروميسيلاتيد الكشف عن استخدام جسم مضاد ضد بوروميسين (أخضر). واو-أكتين تم الكشف عن استخدام فالويدين (أحمر)، وكانت ملطخة النواة DAPI (أزرق). إدراج في الحق تناظر تكبير 2 x من مربع أبيض. أشرطة = 10 ميكرومترات. لوحات الأوسط إظهار غياب مشبعة بكسل، الذي سيكون قد أبرزت باللون الأحمر. لوحات أقل إظهار تمثيل رسومي لإثراء البروتين بوروميسيلاتيد في زنزانة MRC 5 ملتصقة بمقارنة كثافة إشارة بوروميسين (الأخضر)، واكتين (أحمر)، وأشار إلى DAPI (أزرق) على طول محور الخلية بالسهم الأبيض. (د-و) تتوافق مع الصور المعروضة 4.4 × إدراج التكبير من سايكس الواردة في (أ-ج). التقدير الكمي ويبين الحدود SIC (قمم حمراء: أكتين)، فضلا عن الترجمة المترجمة داخل سايكس (الأخضر قمم: بوروميسين) في أدنى (د)، الأوسط (ه)، والمناطق (و) العلوي من الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5. كامل الخلية إشارة التحديد الكمي للبروتينات بوروميسيلاتيد في الخلايا ملتصقة من لجنة نهر الميكونج-5.
(أ) تحديد الإشارة داخل مناطق مختلفة من الطبقة السفلي z-الطائرة من خلية ملتصقة بلجنة نهر الميكونج-5. (اللوحة اليمنى) تحديد منطقة (ط) تغطي مجموع الخلية للحصول على قيمة كمية المقابلة لمجموع الإشارات الخلوية لهذه الطبقة z-الطائرة. (لوحة الأوسط) اختيار منطقة الخلوية المقابلة للنواة والجزء هيولى لا يتضمن سيك (ثانيا). (اللوحة اليمنى) التصور للمنطقة المقابلة سيكس (الثالث) بطرح القيمة التي تم الحصول عليها من المجال الثاني من القيمة التي تم الحصول عليها في الخلية كلها (منطقة أنا). أشرطة = 10 ميكرومترات. (ب) القيم الكمية بكسل لكل منطقة يتم المسرودة في الجدول للصورة التي تصور اختيار منطقة في (أ)، متبوعاً برسم يظهر النسبة (%) من الإشارات التي وجدت في سايكس- (ج) تحديد الإشارة داخل مناطق مختلفة من طبقة z-الطائرة منتصف خلية MRC 5 ملتصقة. (اللوحة اليمنى) تحديد المنطقة (ط) تغطي مجموع الخلية للحصول على قيمة كمية المقابلة لمجموع الإشارات الخلوية لهذه الطبقة z-الطائرة. (لوحة الأوسط) اختيار منطقة الخلية المقابلة للنواة والجزء هيولى لا يتضمن سيك (ثانيا). (اللوحة اليمنى) التصور للمنطقة المقابلة سيكس (الثالث) بطرح القيمة التي تم الحصول عليها للمجال الثاني من القيمة التي تم الحصول عليها في الخلية كلها (منطقة أنا). (د) قيم بكسل الكمي لكل منطقة يتم المسرودة في الجدول للصورة التي تصور اختيار منطقة في (ج)، متبوعاً برسم يظهر النسبة (%) من الإشارات وجدت في سيكس. (ه) تحديد الإشارة داخل مناطق مختلفة من الطبقة العليا z-الطائرة من خلية ملتصقة بلجنة نهر الميكونج-5. (اللوحة اليمنى) تحديد المنطقة (ط) تغطي مجموع الخلية للحصول على قيمة كمية المقابلة لإشارة خلية الإجمالي لهذه الطبقة z-الطائرة. (الفريق الأوسط) تحديد منطقة الخلية المقابلة للنواة والجزء هيولى لا يتضمن سايكس (ثانيا). (اللوحة اليمنى) التصور للمنطقة المقابلة سايكس (الثالث) بطرح القيمة التي تم الحصول عليها للمجال الثاني من القيمة التي تم الحصول عليها في الخلية كلها (منطقة أنا). (و) قيم بكسل الكمي لكل منطقة هي المسرودة في الجدول للصورة التي تصور اختيار منطقة في (ه)، متبوعاً برسم يظهر النسبة (%) من الإشارات وجدت في سايكس- (ز) قيم القياس الكمي لكافة الطبقات z-الطائرة من الخلية المعروضة أعلاه، بما في ذلك واحدة المحسوبة لطائرات z في A (z = 1)، ج (z = 9)، والإلكترونية (z = 19)، التي يتم تمييز باللون الأحمر في الجدول. (ح) تمثيل رسومي للنسبة المئوية للإشارات الموجودة في سايكس في جميع أنحاء حجم الخلية بأكملها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.