يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد

41.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55912

⸱

أغسطس 1, 2017

 ,  , 
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه المخطوطة طرق لتطبيق تقنية ميكروأري الببتيد على التنميط خصوصية الأجسام المضادة التي تعترف هيستونيس والتعديلات بعد متعدية لها.

الملخص

يتم دراسة التعديلات بعد متعدية (بتمس) على البروتينات هيستون على نطاق واسع لدورها في تنظيم هيكل الكروماتين والتعبير الجيني. وقد سهل الإنتاج الضخم وتوزيع الأجسام المضادة المحددة ل هيستون بتمس إلى حد كبير البحث على هذه العلامات. كما هيستون الأجسام المضادة بتم هي الكواشف الرئيسية للعديد من الكروماتين تطبيقات الكيمياء الحيوية، تحليل دقيق للخصوصية الأجسام المضادة ضروري لتفسير البيانات دقيقة والتقدم المستمر في هذا المجال. يصف هذا البروتوكول خط أنابيب متكامل لتصميم وتصنيع واستخدام ميكروأرس الببتيد لتنميط خصوصية الأجسام المضادة هيستون. يتم تسهيل جوانب التصميم والتحليل من هذا الإجراء من قبل أرينينيا، مفتوحة المصدر وتفاعلية حزمة البرامج التي قمنا بتطويرها مؤخرا لتبسيط تخصيص صيغ الطباعة ميكروأري. وقد استخدمت هذه الأنابيب لفحص عدد كبير من المتاحة تجاريا وتستخدم على نطاق واسع هيستون بتم أنتيبوديs، والبيانات التي تم إنشاؤها من هذه التجارب متاحة بحرية من خلال قاعدة بيانات خصوصية هيستون الأجسام المضادة على الانترنت وتوسيعها. ما وراء الهستونات، المنهجية العامة الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على نطاق واسع لتحليل الأجسام المضادة بتم محددة.

المقدمة

يتم تعبئة الحمض النووي الجيني بشكل أنيق داخل النواة النواة النواة النواة مع بروتينات هيستون لتكوين الكروماتين. وحدة فرعية من الكروماتين تكرار هو نوكليوسوم، والذي يتكون من 147 زوجا قاعدة من الحمض النووي ملفوفة حول جوهر أوكتامريك من البروتينات هيستون - H2A، H2B، H3، و H4 1 . وينظم الكروماتين على نطاق واسع في يوكروماتين معبأة فضفاضة ومجالات هيتيروكروماتين معبأة بإحكام. درجة ضغط الكروماتين ينظم المدى الذي يمكن للأجهزة البروتين الوصول إلى الحمض النووي الأساسي لتنفيذ العمليات الأساسية الحمض النووي مثل النسخ المتماثل، والنسخ، وإصلاح.

المنظمين الرئيسيين للوصول الجينوم في سياق لونين هي بتمس على الذيل غير المهيكلة والنطاقات الأساسية للبروتينات هيستون 2 ، 3 . هيستون بتمس وظيفة مباشرة من خلال التأثير على بنية لونين 4 وغير مباشر ثروغح تجنيد بروتينات القارئ والمجمعات الجزيئات المرتبطة بها التي لديها إعادة عرض لونين، الأنزيمية، والأنشطة السقالات 5 . دراسات على وظيفة هيستون بتم على مدى العقدين الماضيين تقترح بأغلبية ساحقة هذه العلامات تلعب الأدوار الرئيسية في تنظيم مصير الخلية، والتنمية الكائن الحي، ومرض بدء / التقدم. مدعوم من التقدم في تكنولوجيا الطيف الكتلي المستندة إلى البروتين، تم اكتشاف أكثر من 20 بتمس هيستون فريدة من نوعها على أكثر من 80 مخلفات هيستون متميزة 6 . ومن الجدير بالذكر أن هذه التعديلات غالبا ما تحدث في توليفات، وتمشيا مع فرضية "هيستون كود"، العديد من الدراسات تشير إلى أن البروتينات القارئ تستهدف مناطق منفصلة من الكروماتين من خلال الاعتراف مجموعات محددة من هيستون بتمس 7 ، 8 ، 9 . والتحدي الرئيسي الذي سيتحرك إلى الأمام هو تعيين وظائف إلى غربسبب قائمة هيتمون بتمس وتحديد كيفية تركيبات محددة من هيستون بتمس أوركسترات وظائف ديناميكية المرتبطة بالكروماتين.

الأجسام المضادة هي الكواشف لينكبين للكشف عن هيستون بتمس. وعلى هذا النحو، فقد تم تطوير أكثر من 1000 هيستون من الأجسام المضادة المتمثلة في هيتمون تجاريا لاستخدامها في أبحاث الكيمياء الحيوية للكروماتين. مع التطور السريع لتكنولوجيا تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية، وتستخدم هذه الكواشف على نطاق واسع من قبل المحققين الفردية وعلى نطاق واسع إبيجنوميكس "خارطة الطريق" المبادرات (على سبيل المثال ، إنكود و بوبرينت) في تشيب-سيق (الكروماتين مناعي إلى جانب الجيل القادم التسلسل ) لتوليد خرائط المكانية عالية الدقة لتوزيع هيستون بتم على نطاق الجينوم 10 ، 11 . ومع ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة أن خصوصية الأجسام المضادة هيستون بتم يمكن أن تكون متغيرة للغاية، وأن هذه الكواشف تظهر غير صالحة ( مثل ، أحادي أو ثنائي أو ثلاثي ميليليسين) 12 و 13 و 14 و 15 ، 16 ، 17 ، 18 . لذلك، مراقبة الجودة الصارمة من هيستون بتم-الكواشف الأجسام المضادة محددة ضروري لتفسير البيانات التي تم إنشاؤها بدقة مع هذه الكواشف القيمة.

تكنولوجيا ميكروأري تمكن الاستجواب في وقت واحد من الآلاف من التفاعلات الجزيئية في إنتاجية عالية، استنساخه، وتصغيرها الشكل. لهذا السبب، تم إنشاء مجموعة متنوعة من منصات ميكروأري لتحليل البروتين الحمض النووي 19 ،"> 20 والبروتينات البروتين 21 ، والتفاعلات الببتيد البروتين 22. في الواقع، وقد ظهرت ميكروأرس الببتيد هيستون كمنصة اكتشاف بالمعلومات للبحوث الكيمياء الحيوية لونين، مما يتيح التنميط الإنتاجية العالية للكتاب، محايات، وقراء هيستون بتمس 15 ، 23 ، 24 ، وأيضا لتحليل هيستون خصوصية الأجسام المضادة 17 ، 25. أبعد من تطبيقها في الكروماتين والبحوث علم الوراثة، صفائف الببتيد هيستون لها فائدة محتملة كاختبار التشخيص / النذير لذئبة الحمامية الجهازية وأمراض المناعة الذاتية الأخرى حيث المضادة للالتهابات، يتم إنشاء الأجسام المضادة لونين 26 ، 27 .

هنا، نحن تصف خط أنابيب المتكاملة التي وضعناها لتصميم، تلفيق، و كيوريجين هيبتون ميكروأرس هيستون لتوليد ملامح خصوصية للأجسام المضادة التي تعترف هيستونيس و بتمس بهم. ويسهل خط الأنابيب من قبل أرينينيا، مفتوح المصدر، وتطبيق البرمجيات التفاعلية التي قمنا بتطويرها مؤخرا، والذي يدمج مراحل التصميم والتحليل من التجارب ميكروأري 28 . تعمل أرينينيا بشكل أفضل في غوغل كروم. باختصار، يتم استخدام طابعة ميكروأري الاتصال الروبوتية لإيداع مكتبة من البيوتين هيتون الببتيدات مترافق البيوتين في مواقف محددة على شرائح المجهر الزجاج ستريبتافيدين المغلفة. صفائف يمكن بعد ذلك أن تستخدم في شكل مقايسة تنافسية ومتوازية لاستجواب التفاعلات الأجسام المضادة-حاتمة ( الشكل 1 ). تتكون مكتبة الببتيد من مئات من الببتيدات الاصطناعية الفريدة التي تؤوي بتمس (ليسين أسيتيلاتيون، ليسين / أرجينين مثيلة، و سيرين / ثريونين فسفوريلاتيون) وحدها وفي توليفات ذات صلة مستمدة إلى حد كبير من مجموعات بروتيوميكس. طرق لتوليف الببتيد والتحقق من صحة مفصلة في مكان آخر 23 . يتم تخزين البيانات التي تم إنشاؤها من جهودنا الحالية هيستون بتم الكشف عن الأجسام المضادة باستخدام هذه المنصة مجموعة على الموارد على شبكة الإنترنت العامة، وهيستون هيتيون الأجسام المضادة قاعدة بيانات (www.histoneantibodies.com). ومن الجدير بالذكر أن هيستون الببتيد ميكروأرس ملفقة مع الاختلافات من هذا البروتوكول كما استخدمت على نطاق واسع لتوصيف نشاط هيستون بتم القارئ المجالات 8 و 29 و 30 و 31 و 32 و 33 و 34 و 35 و 36 و 37 ومؤخرا إلى ملف هيستون بتم الكاتب و الممحاة الأنشطة 24 .

/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
الشكل 1: رسم كاريكاتوري من الإجراء تدريجي لفحص الأجسام المضادة على هيستون الببتيد ميكروأري. الببتيدات هيستون البيروكسيديز الإيواء تعريف التعديلات بعد متعدية (الدوائر الحمراء والزرقاء) هي شارك في طباعة مع البيوتين فلوريسئين على الزجاج المغلفة ستريبتافيدين. يتم تصور التفاعلات الإيجابية كما مضان أحمر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تثبيت وتشغيل أرينينيا

  1. تحميل وتثبيت أوراكل صندوق الظاهري من www.virtualbox.org.
  2. تحميل وفك ضغط الجهاز الظاهري أرينينيا (فم) من http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
  3. فتح مربع الظاهري وإضافة أرينينيا فم عن طريق النقر على 'آلة'، 'إضافة'، وحدد arrayninja.vbox من المجلد حيث تم حفظ أرينينيا فم.
  4. بدء أرينينيا عن طريق تحديده داخل المربع الظاهري والنقر على السهم الأخضر "بداية".
  5. سوف مربع الظاهري فتح نافذة جديدة وعرض رسالة مفادها أن فم يمكن الوصول إليها عن طريق التنقل في متصفح الويب إلى لوكالهوست: 2080.60. ملاحظة: نسخة حاوية من أرينينيا متاح أيضا عبر hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/

2. تصميم شريحة الصفيف والمصدر تخطيط لوحة

  1. تحت عنوان "تخطيط تخطيط الشريحة" على واجهة أرينينيا، انقر على الرابط الذي يتوافق مع الطابعة ميكروأري المستخدمة.
    ملاحظة: تم برمجة أرينينيا لمحاكاة الحركة الروبوتية من اثنين من الطابعات ميكروأري تستخدم عادة (انظر الجدول1). التوافق مع أرايرز أخرى يمكن تكوين عند الطلب.
  2. انقر داخل مربع الحوار "تحميل لوحة"، واكتب "فارغة"، وانقر على "إدخال". انظر الشكل 2 للحصول على لقطة من وحدة تصميم أرينينيا.
  3. ضبط القطر بقعة إلى 275 ميكرون وتباعد البقعة إلى 375 ميكرون. ضبط الإعدادات المتبقية (لوحة كتل / صف لوحة، مجموع الصفوف الصف، مكررات، وميزات في ص، صفائف سوبر، سوبيرا الهراء؛ انظر الشكل 2 ) لتخصيص كيف ستظهر الميزات على الشريحة ميكروأري.
    ملاحظة: يتم تحديد قطر بقعة من حجم دبوس ميكروأري. كما يتم تعديل هذه الإعدادات، سيتم تحديث الشريحة الكرتون في الوقت الحقيقي. استخدام هذا الكرتون لمعاينة كيف كل إعداد هو تعديل تخطيط الشريحة النهائية.
  4. بعد الانتهاء من تخطيط الميزات على الشريحة، الماوس فوق كل ميزة فريدة من نوعها وأدخل معرف ميزة في مربع الحوار المنبثقة.
    ملاحظة: يمكن أن تتكون معرفات الخصائص من أرقام أو أحرف أو مجموعات. هذا مطلوب فقط للميزات الفريدة، ولن يظهر مربع حوار عند تحديد النسخ المتماثلة.
  5. بعد تعيين جميع الميزات الفريدة لمعرف، انقر على "ملء". أدخل اسما لتخطيط الشريحة وانقر على "طباعة اللوحة" لحفظها. سيتم فتح صفحة جديدة لعرض عدد من لوحات مصدر 384 جيدا اللازمة لتصنيع تصميم الشريحة المختارة وجدول رسم الخرائط الموقع الفعلي لكل ميزة ليتم تحميلها في لوحة المصدر (ق).
    ملاحظة: تذكر هذا الاسم، حيث سيتم استخدامه لتذكير هذا التصميم عند تحليل البيانات ميكروأري (انظر القسم 6.2). النقر على "طباعة لوحة الخاص بك" يحفظ تخطيط داخل أرينينيا.

figure-protocol-1
الشكل 2: أرينينيا وحدة التصميم. لقطة شاشة من يظهر أرينينيا وحدة التصميم في خط منقط. تظهر لوحة التحكم (أعلى) كافة المعلمات التي يمكن تغييرها على طابعة ميكروأري. كما يتم تعديل هذه المعلمات، صورة الكرتون من تخطيط الشريحة (أسفل اليسار) التحديثات في الوقت الحقيقي. بعد تعيين تخطيط، يمكن للمستخدم الماوس على البقع الفردية لإدخال المعرفات ميزة فريدة من نوعها. أرينينيا يبني من هذا إدخال المستخدم خريطة موقف كل ميزة في لوحة المصدر (ق) (أسفل اليمين) اللازمة لافتعال تخطيط الشريحة ميكروأري المحدد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تصنيع ميكروأرس

  1. إعداد لوحة المصدر
    1. استخدام الخريطة التي تم إنشاؤها مع أرينينيا في القسم 2.5 لإنشاء لوحة مصدر 384 جيدا (ق).
      ملاحظة: وصف مفصل من الببتيدات الاستعلام على هذا المنبر يمكن العثور عليها في أي مكان آخرs = "كريف"> 17.
    2. إيداع 1 - 2 ميكرولتر من كل ميزة (على سبيل المثال ، الببتيد هيستون الببتيد البيروكسيديز) في البئر الصحيح من لوحة مصدر 384 جيدا (ق).
      ملاحظة: عادة ما تودع الببتيدات هيستون البيروكسيديز من 200 - 400 ميكرومتر حلول الأسهم، وهو ما يعادل 10 إلى 25 أضعاف الفائض المولي من الببتيد لمواقع ملزمة ستريبتافيدين في بقعة صفيف واحد. ويحسب ذلك باستخدام المعادلة:
      figure-protocol-2
      حيث V هو حجم تسليمها من قبل دبوس، [ P ] هو تركيز الميزة التي يجري طباعتها، N A هو رقم أفوغادرو، و S هو مساحة سطح بقعة. C هو تغطية الشريحة، وأعرب عن عدد من جزيئات ستريبتافيدين لكل وحدة المساحة مضروبا في ثلاثة (متوسط ​​عدد المواقع المتاحة ستريبتافيدين ملزمة). يتم الحصول على V و C من قبل الشركة المصنعة المعنية. ميزات أخرى قدتتطلب تركيزات مختلفة اعتمادا على حجم جزيء حيوي حيث الازدحام قد يكون مصدر قلق. وينبغي اختبار مجموعة من تركيزات الطباعة لكل نوع جديد من الميزات تجريبيا لتحديد تركيز الطباعة الأمثل.
    3. تمييع كل ميزة 10 أضعاف مع 1X الطباعة العازلة تستكمل مع 1٪ ألبومين المصل البقري (بسا). تدور لوحة المصدر (ق) في 500 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: ويوصى بإدراج البيوتين المسمى فلوريسئين (5 ميكروغرام / ميكرولتر) في المخزن المؤقت الطباعة باعتبارها السيطرة على اكتشاف وكمساعدة البصرية لتسهيل المحاذاة صفيف المناسبة أثناء التحليل (انظر الشكل 4 ).
  2. بروتوكول الطباعة ( الشكل 3A - B ).
    1. إعداد المصفاة عن طريق إفراغ حاوية جمع النفايات وملء حاوية الحل غسل وحاوية مرطب مع الماء المقطر العقيمة.
    2. أدخل المعلمات uسيد لتصميم الشريحة في أرينينيا (القسم 2 والشكل 2 ) في برنامج التحكم طابعة ميكروأري.
    3. باستخدام برنامج التحكم الطابعة ميكروأري، تعيين إجراء الغسيل لغسل 1 ثانية مع الغمر واحد. تعيين إعدادات ما بعد غسل لإعادة تراجع دبابيس 5 مرات بعد كل غسل. تعيين الرطوبة إلى 60٪.
      ملاحظة: قد يختلف تكوين غسل الأمثل اعتمادا على الطابعة ميكروأري المستخدمة. قد يختلف التكوين الأمثل تراجع دبوس بعد غسل اعتمادا على الطابعة ميكروأري المستخدمة.
    4. إدراج الشرائح فونكتيوناليزد (على سبيل المثال ، والزجاج ستريبتافيدين المغلفة) في بلاتينس الركيزة ووضع جميع بلاتنس في المصعد الصوانى. إدراج لوحة المصدر (ق) في حامل لوحة (ق) ومكان في المصعد لوحة المصدر.
    5. انقر فوق "طباعة". مراقبة عملية الطباعة لبضع جولات من ترسب ميزة لضمان جميع إعدادات غسل وتراجع صحيحة. عند اكتمال تشغيل الطباعة، قم بإزالةلوحات الركيزة من المصل.
      ملاحظة: عندما تدير الطباعة الكبيرة تحظر الانتهاء من خطوات حجب في غضون يوم واحد، يمكن أن تحضن الشرائح المطبوعة في غرفة ترطيب في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. احتضان الشرائح بجانب كوب صغير من الماء داخل صندوق من الورق المقوى مختومة مع غلاف بلاستيكي.
    6. منع الشرائح مع العازلة حظر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الخلط.
    7. غسل الشرائح 2 × 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الفوسفات مخزنة المالحة (بس)، ودرجة الحموضة 7.6 مع الخلط. تجفيف الشرائح عن طريق الغزل في الطرد المركزي الشريحة ميكروأري لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: لمعالجة عدد كبير من الشرائح في آن واحد، يمكن أن تستخدم عالية الإنتاجية المجهر الشريحة غسل الغرفة، والسماح 50 الشرائح ليتم غسلها في موازاة ذلك.
    8. للشرائح المصممة لتكون مقسمة بالشمع، انتقل إلى القسم 4.1. لجميع التصاميم الأخرى، مخزن الشرائح في 4 درجات مئوية محمية من الضوء والرطوبة.
      ملاحظة: الببتيدات هيستون البيروكسيديز المطبوعةمستقرة لمدة 6 أشهر على الأقل عند تخزينها بهذه الطريقة.

4. تقسيم شرائح ميكروأري

  1. مسعور الشمع القلم ( الشكل 3C )
    1. تطبيق الشمع حول المناطق التي تحتوي على ميزات باستخدام القلم الشمع. السماح الشمع للهواء الجاف لمدة 5 دقائق قبل الشروع في القسم 5.
      ملاحظة: بعد الحجب، يمكن أن تكون البقع صفيف من الصعب جدا لتصور عن طريق العين. تصميم الشريحة من أرينينيا يمكن طباعتها على نطاق واستخدامها كدليل لتطبيق الشمع.
  2. سيليكون طوقا ( الشكل 3D )
    1. قشر الفيلم واضحة من الجزء الخلفي من مجموعة طوقا ووضع الجانب لاصق أسفل على الشريحة ميكروأري.
    2. أمسك الحشية في مكانها لمدة 5 ثوان قبل الانتقال إلى القسم 5.
  3. الشمع بصمة ( الشكل 3E )
    1. للشرائح المصممة لتكون مقسمة بالشمع، طباعة شريحة اختبار على الزجاج العادي باستخدام 10٪ بسا. استخدام هذه الشريحة اختبار لتحسين الشمع إمبرينتر أدلة أو مجموعة إعدادات لضمان جميع الميزات ستكون داخل غرف الشمع العفن.
    2. تسخين ميكروأري الشمع إمبرينتر إلى 85 درجة مئوية حتى يتم ذاب كل الشمع تماما، ما يقرب من 30 دقيقة.
    3. إدراج الشريحة مع الجانب المطبوعة التي تواجه أسفل ودفع الشريحة على طول الطريق إلى الدليل الصحيح على ميكروأري السلب. سحب ما يصل ذراع لجلب القالب في اتصال مع سطح الشريحة. عقد لمدة 2 ثانية.
      ملاحظة: يمكن تغيير الوقت عقد لتحقيق أقصى سماكة الحدود الشمع.
    4. إزالة بسرعة الشريحة وتفحص بصريا الحدود الشمع لضمان جميع الآبار المغلقة وأن الحدود ليست سميكة بحيث أنها تنتهك على البقع. تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية محمية من الرطوبة والضوء.
      ملاحظة: يمكن زيادة وقت الانتظار أو انخفاض للحصول على حدود سمكا أو أرق.

figure-protocol-3
الشكل 3: تصنيع ميكروأري. (A) هيستون الببتيد ميكروأري تلفيق على شرائح المجهر المغلفة ستريبتافيدين باستخدام طابعة ميكروأري الاتصال. (ب) ميكروأرز ملفقة مع 3 الرهانات من 48 × 48 شبكة من ميزات الببتيد. فصل (C) 3 سوبرايس مع القلم الشمع مسعور، (D) 2 الرهانات مع لاصق السيليكون، و (E) 48 الرهائن مع بصمة الشمع. كل ميكروأرس أظهرت ملفقة باستخدام 25 × 75 مم المجهر الشرائح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. تهجين هيستون بتم الأجسام المضادة مع ميكروأري الببتيد

  1. إعداد العازلة التهجين (بس، ودرجة الحموضة 7.6، 5٪ بسا، 0.1٪ توين -20).
  2. موازنة الشريحة في المخزن المؤقت التهجينوذلك باستخدام سفينة التهجين. تغطية تماما الشريحة بأكملها في العازلة التهجين واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية على شاكر المداري في سرعة منخفضة.
  3. إعداد حل يحتوي على المخفف هيستون بتم الأجسام المضادة في التهجين العازلة.
    ملاحظة: في المثال البيانات، تم تخفيف كل من الهيستون الأجسام المضادة # 1 والجسم المضاد رقم 2 1: 1000 في المخزن المؤقت التهجين. ويوصى مجموعة التخفيف مماثلة لتلك المستخدمة ل إمونوبلوتينغ كنقطة انطلاق.
  4. احتضان الصفيف مع حل الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. إزالة الحل الأجسام المضادة وغسل صفيف 3 مرات لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع برنامج تلفزيوني الباردة، ودرجة الحموضة 7.6.
  5. إعداد 1: 5،000 - 1: 10،000 التخفيف من الفلورسنت صبغ مترافق الأجسام المضادة الثانوية في العازلة التهجين.
  6. احتضان مصفوفة مع حل الأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية وغسل الشريحة ميكروأري 3 مرات لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.6. غطسميكروأري في أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على برنامج تلفزيوني 0.1X، ودرجة الحموضة 7.6 لإزالة الملح الزائد في درجة حرارة الغرفة. تجفيف الشريحة في الطرد المركزي الشريحة ميكروأري في درجة حرارة الغرفة.
  7. مسح الشريحة مع ماسح ضوئي ميكروأري في 25 ميكرون قرار أو أعلى، بعد بروتوكول المسح الضوئي ميكروأري الماسح الضوئي الصانع الموصى بها.
    ملاحظة: إذا فلوريسئين المسمى التتبع البيوتين موجود، مسح كل من القناة الخضراء (على سبيل المثال: 488 نانومتر، م: 509 نانومتر) والقناة التي تتوافق مع الأجسام المضادة الثانوية صبغ مترافق الفلورسنت، وعادة الحمراء (على سبيل المثال: 635 نانومتر، م : 677 نانومتر). الهدف من المسح هو الحصول على ملفات .tif قناة واحدة يمكن دمجها في ملف .png واحد (كما هو موضح في القسم 6.1).

6. تحليل البيانات ميكروأري باستخدام أرينينيا

  1. إعداد صورة ميكروأري المدمجة
    ملاحظة: الهدف من هذا القسم هو إنشاء ملف صورة. ينغ الذي يدمج ملفين .tif أحادية القناة (تم الحصول عليها في القسم 5). هذههو تنسيق الصورة الوحيدة المتوافقة مع وحدة تحليل أرينينيا. تمثل الإرشادات التالية إحدى الطرق الممكنة للحصول على ملف صورة مدمج. ومع ذلك، تتوفر حلول أخرى (على سبيل المثال ، إيميجيج مجانية).
    1. من سطر الأوامر في محطة باش لجهاز كمبيوتر مع إيماجيماجيك مثبت، انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على ملفات .tif قناة واحدة ونسخ / لصق الخطوات التالية، وضرب 'إدخال' بين كل خطوة (6.1.4 - 6.1 0.7).
      ملاحظة: يجب استبدال أسماء الملفات بأحرف كبيرة (على سبيل المثال ، RED_CHANNEL) باسم ملف الصور الشريحة ميكروأري.
    2. إذا لزم الأمر، أولا عكس الصور باستخدام الأمر "تحويل INPUT.tif -negate OUTPUT.tif". هذا مطلوب إذا كان الماسح الضوئي يحفظ ملفات .tif مع إشارة باللون الأبيض والخلفية باللون الأسود.
      1. كونفيرت -depth 16 RED_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel غب -evaluate سيت 0 -delete 0 out.png 2> error.file.
      2. التحويلإرت - العمق 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel رب -evaluate سيت 0 -delete 0 outa.png 2> error.file.
      3. كونفيرت-ديبث 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel رغ -evaluate سيت 0 -delete 0 outB.png 2> error.file.
      4. كونفيرت out.png outa.png outB.png -set colourspace رغف -combine merged.png.
        ملاحظة: سيتم حفظ ملف باسم 'merged.png' في نفس المجلد مثل ملفات .tif الأصلية.
  2. قياس البيانات باستخدام أرينينيا
    1. فتح أرينينيا وانقر على وصلة طابعة ميكروأري المناسبة تحت عنوان "لتحديد الصور التي لديها لوحة المصدر المعروفة." اكتب اسم تصميم الشريحة المحفوظة (الخطوة 2.5) في مربع الحوار "لوحة التحميل" وانقر على "إدخال". انظر الشكل 4 للحصول على لقطة من وحدة تحليل أرينينيا.
    2. انقر على "اختيار ملف" وانتقل إلى وحدد الملف "merged.png" الذي تم إنشاؤه في القسم 6.1. الصورة المدمجةe تحميل فضلا عن شبكة لتخطيط الشريحة.
    3. استخدام المتزلجون في الجزء السفلي من لوحة التحكم أرينينيا لضبط التباين والسطوع، ومنتصف.
      ملاحظة: هذه التعديلات هي لأغراض التصور فقط وليس لها تأثير على القياس الكمي.
    4. حدد "الدقة" وأدخل القيمة التي تتطابق مع دقة الصورة الممسوحة ضوئيا. استخدام "الجانب الهامش" و "الهامش العلوي" لتحريك الشبكة إلى محاذاة مع البقع على الصفيف. ضبط حسب الحاجة للحصول على الشبكة كما محاذاة بشكل وثيق على كل بقعة ممكن.
    5. انقر فوق 'سبوت سيك' وانتظر حتى يعود الزر إلى اللون الرمادي الأصلي.
      ملاحظة: هذا يمكن أن يتكرر عدة مرات إلى مركز الدوائر الشبكة على بقع الفردية. وظيفة البحث يريح الشبكة نحو كل بقعة لضبط محاذاة.
    6. تغيير قيمة "سوبر صفائف" إلى "1" للعمل على كل لوحة صفيف فرعي بشكل فردي (إذا رغبت في ذلك). إذا كنت تستخدم 4x 12 الشمع بصمة تخطيط الشريحة ( الشكل 3E )، استخدم "إيبين" "جبين" و "سوبا" الضوابط لإيقاف الميزات لتحليل أي مزيج المطلوب من 4 × 12 الآبار. على سبيل المثال، لتحليل أعلى اليسار وأعلى يمين الآبار كما مكررات لبعضها البعض، أدخل "1 4" في إيبين، "1 1" في جبين و "1 4" في سوبا. اضغط على "إنتر".
    7. مرر الماوس فوق النقاط الفردية لعرض هوية هذه الميزة.
    8. انقر فوق "تبديل التكبير" لمراجعة الميزات بعناية أكبر. حدد النقاط المرجعية الخلفية عن طريق الضغط على مفتاح 'R' في حين أن الماوس هو أكثر من بقعة. سيتم إبراز النقاط المرجعية باللون البرتقالي.
      ملاحظة: في وضع "تبديل الزوم"، يتم عرض صورة مكبرة للميزة أن الماوس قد انتهت في الزاوية اليمنى العليا. ونوقشت مناقشة مفصلة لخصائص التصحيح الخلفية الإضافية في أرينينيا في أماكن أخرى 28 .
    9. تبديل البقع (مع متنوعة على نطاق واسع مورفولوجيا بقعة أو الحطام التي من شأنها أن تؤثر على كمية دقيقة) عن طريق الضغط على مفتاح 'A' في حين تحوم الماوس فوق البقع المصابة. ستتحول البقع المعطلة إلى اللون الأبيض.
    10. انقر على "تعبئة" متبوعا ب "إرسال" لتحديد النقاط.
      ملاحظة: سيتم فتح علامة تبويب جديدة وعرض الرسم البياني الشريطي للبيانات تطبيع لألمع متوسط ​​البقعة. يحتوي الجدول أدناه الرسم البياني الشريطي على قيم البيانات المعيارية و الخام. يمكن نسخ هذا الجدول إلى جدول بيانات للأرشفة وإجراء مزيد من التحليل.

figure-protocol-4
الشكل 4: أرينينيا وحدة التحليل. يتم عرض لقطة شاشة وحدة تحليل أرينينيا. لوحة التحكم (أعلى اليسار) يظهر كل المعلمات التي يمكن تعديلها لتصور الصفيف، والعثور على البقع، ومحاذاة شبكة فوقصورة صفيف. يؤدي تحريك مؤشر الماوس فوق إحدى الميزات إلى عرض التكبير / التصغير (أعلى اليسار) ويعرض نافذة منبثقة تحتوي على معلومات التعريف المرتبطة بهذه الميزة (أسفل). النقاط المرجعية المختارة لتصحيح الخلفية هي البرتقال. الميزات التي سيتم استبعادها من التحليل المصب هي بيضاء. أرينينيا يحتوي على ميزة البحث القائم على النص الذي يسلط الضوء على ميزات مطابقة باللون الأصفر، كما هو مبين في المثال ل H4K16. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد تم استخدام هذا البروتوكول لتصميم وتصنيع منصة ميكروأري الببتيد لتحليل هيستون بتم الضد خصوصية. الصفيف يستعلم مكتبة من أكثر من 300 ميزات الببتيد فريدة من نوعها (20 - 40 بقايا في الطول) تمثل العديد من مجموعات معروفة من بتمس وجدت على الأساسية والبروتينات هيستون البديل 38 . وقد كان هذا خط أنابيب العمود الفقري لفحص العديد من الأجسام المضادة هيستون بتم المستخدمة على نطاق واسع والمتاحة تجاريا، ومجموعات البيانات الكاملة متوفرة على...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

موثوقية الأجسام المضادة في تطبيقات البحوث الطبية الحيوية أمر بالغ الأهمية 46 ، 47 . هذا صحيح بشكل خاص في الكيمياء الحيوية لونين نظرا لموقف الأجسام المضادة كأدوات رئيسية لغالبية التقنيات المتقدمة لتوصيف وفرة وتوزيع هيتمون بتمس. بروتوكول المعروضة هنا تفاصيل خط أنابيب الأمثل لتصميم وتصنيع، واستخدام ميكروأرس الببتيد لتحليل خصوصية هيستون بتم الضد. وقد تم استخدام هذا الخط لفحص عدد كبير من الأجسام المضادة هيستون بتم المتاحة تجاري...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل في جزء من معهد بحوث فان أندل ومنحة بحثية من المعاهد الوطنية للصحة (CA181343) ل سبر

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
صفيف الطباعة العازلةPPB
BSAOmnipure2390
مجهر زجاجي مطلي بالستربتافيدين GreinerBio-one439003-25
مادة البولي بروبيلين 384 لوحة البئرGreiner Bio-one784201
البيوتين والفلورسينSigma53608
طابعة المصفوفات الدقيقةAushon2470Aushon 2470 طابعة Microarray
الاتصال طابعة المصفوفات الدقيقةآلات الجيناتOmniGrid 100OmniGrid Microarray
Printer PBSInvitrogen14190
Blocking BufferArrayItSBB
قلم الشمع الكارهة للماءVector LabsH-4000ImmEdge حاجز مسعور PAP القلم
السيليكون حشيةGrace Bio-labs622511
وعاء التهجينThermo Scientific267061أو وعاء مماثل
للأجسام المضادة الثانوية المترافقة بصبغة الفلورسنتLife TechnologiesA-21244Alexa Fluor 647 (مضاد للأرانب)
الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بصبغة الفلورسنتLife TechnologiesA-21235Alexa Fluor 647 (مضاد للماوس)
الشمع ImprinterArrayItMSI48
Tween-20Omnipure9490
Microarray ScannerInnoScan1100ALأو ما يعادلها من الماسح الضوئي المصفوفات الدقيقة
EipTitan Histone Peptide MicroarrayEpicypher112001
AbSurance Pro Histone Peptide MicroarrayMillipore16668
MODified Histone الببتيد صفيفنشط الشكل13001
هيستون كود الببتيد المصفوفات الدقيقة JPTHis_MA_01
الشمعرويال أوكالخليالشمعلطابعة الشمع
المرطب Microarray الشرائح التهجين غرفةVWR97000-284
عالية الإنتاجية المجهر غرفة غسيل الشريحةArrayItHTW
المجهر جهاز طرد مركزي منزلقVWR 93000-204
جسم مضاد 1Abcam8898
جسم مضاد 2Millipore07-473
ببتيد هيستون بيوتينيلEpiCypher12-0001مثال على الببتيد. تتوفر ببتيدات مماثلة مع تعديلات مختلفة من عدة مصادر تجارية.
ImageMagickhttps://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinjahttps://rothbartlab.vai.org/tools/
شرائح

المراجع

  1. van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 627-643 (2014).
  4. Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311 (5762), 844-847 (2006).
  5. Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
  6. Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159 (2), 458(2014).
  7. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  8. Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19 (11), 1155-1160 (2012).
  9. Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40 (7), 897-903 (2008).
  10. Stunnenberg, H. G., Hirst, M. International Human Epigenome Consortium. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167 (5), 1145-1149 (2016).
  11. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  12. Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  13. Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6 (2), 256-263 (2011).
  14. Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49(2016).
  15. Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
  16. Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160(2015).
  17. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  18. Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489(2012).
  19. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4 (3), 393-411 (2009).
  20. Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726(2013).
  21. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
  22. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289 (5485), 1760-1763 (2000).
  23. Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the "histone code" . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
  24. Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
  25. Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33 (7), 305-313 (2008).
  26. Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  27. Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. "On silico" peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18 (9), 1434-1440 (2012).
  28. Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
  29. Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4 (1), 148-158 (2013).
  30. Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49 (3), 571-582 (2013).
  31. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27 (11), 1288-1298 (2013).
  32. Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11296-11301 (2013).
  33. Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (38), 15277-15282 (2013).
  34. Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6 (2), 325-335 (2014).
  35. Kim, H. -S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6 (5), 892-905 (2014).
  36. Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7 (1), 113-126 (2014).
  37. Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16 (12), 3195-3207 (2016).
  38. Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87 (6), 3129-3133 (2015).
  39. Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24 (5), 432-437 (2010).
  40. Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276 (27), 25309-25317 (2001).
  41. Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21 (2), 365-367 (2011).
  42. Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17 (6), 691-707 (2007).
  43. Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30 (12), 2933-2946 (2010).
  44. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  45. Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6 (4), 283-290 (2010).
  46. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  47. Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518 (7537), 27-29 (2015).
  48. Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11 (8), 834-840 (2014).
  49. Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
  50. Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  51. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ArrayNinja
تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.