Method Article

بروتوكول لعدة خروج المغلوب الجيني في ماوس الأورغانويدات المعوية الصغيرة باستخدام كريسبر-كونكاتيمر

DOI:

10.3791/55916

⸱

July 12th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wellcome Trust - Medical Research Council Stem Cell Institute, University of Cambridge, 2Department of Genetics, University of Cambridge, 3Department of Pathology, Yonsei University College of Medicine

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer
Posted by JoVE Editors on 1/02/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer. There was a typo in step 3.3 of the Protocol.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول خطوات لاستنساخ متعددة رنا دليل واحد في دليل واحد ناقلات الحمض النووي الريبي المتجهات، والتي هي ذات فائدة خاصة في خلق ضربات قاضية متعددة الجينات باستخدام تقنية كريسبر / Cas9. ويظهر توليد ضربات قاضية مزدوجة في أورغانويدز الأمعاء باعتبارها تطبيق محتمل لهذه الطريقة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تحسنت التكنولوجيا كريسبر / Cas9 إلى حد كبير جدوى وسرعة الدراسات فقدان وظيفة التي هي أساسية في فهم وظيفة الجينات. في حقيقيات حقيقيات أعلى، يمكن للجينات بارالوغوس أن تخفي النمط الظاهري المحتمل عن طريق تعويض فقدان الجين، مما يحد من المعلومات التي يمكن الحصول عليها من الدراسات الجينية التي تعتمد على الجينات المفردة الجينية واحدة. قمنا بتطوير رواية، طريقة الاستنساخ السريع لالمرنا الحمض النووي الريبي (غرنا) كونكاتيمرز من أجل خلق متعددة الجينات خروج المغلوب بعد جولة واحدة من ترنسفكأيشن في الماوس أورغانويدس الأمعاء الصغيرة. استراتيجيتنا تسمح ل كونكاتيمريزاتيون تصل إلى أربعة غرناس الفردية في ناقلات واحدة عن طريق إجراء واحد غولدن غيت خلط رد فعل مع أوليغوس الحمض الريبي النووي الذواب صلب وناقلات ريتروفيرال مصممة مسبقا. وهذا يسمح إما خروج المغلوب في وقت واحد لمدة تصل إلى أربعة جينات مختلفة، أو زيادة كفاءة خروج المغلوب بعد استهداف الجين واحد من قبل غرناز متعددة. في هذا البروتوكول، نعرض بالتفصيلكيفية استنساخ بكفاءة متعددة غرناس في ناقل الفيروس كريسبر-كونكاتيمر ريتروفيرال وكيفية تحقيق إليكتروبوراتيون كفاءة عالية في أورغانويدز المعوية. على سبيل المثال، نبين أن خروج المغلوب في وقت واحد من اثنين من أزواج من الجينات ترميز المنظمين السلبي من مسار الإشارات ونت (Axin1 / 2 و Rnf43 / Znrf3) يجعل أورغانويدات الأمعاء مقاومة لانسحاب عوامل النمو الرئيسية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نهج الوراثة العكسي هو طريقة تستخدم على نطاق واسع للتحقيق في وظيفة الجين. على وجه الخصوص، وفقدان وظيفة الدالات، حيث ان تعطيل الجينات يسبب التغيرات المظهرية، تلعب دورا رئيسيا في بناء فهمنا للعمليات البيولوجية. تمثل الطريقة كريسبر / Cas9 أحدث التطورات في تكنولوجيا هندسة الجينوم، وقد أحدثت ثورة في الممارسة الحالية لعلم الوراثة في الخلايا والكائنات الحية. Cas9 هو إندوكلياز الموجهة من الحمض النووي الريبي الذي يربط تسلسل الحمض النووي محددة مكملة ل غرنا ويولد كسر مزدوج حبلا (دسب). هذا دسب المجندين آلات إصلاح الحمض النووي أنه في غياب قالب الحمض النووي لإعادة التركيب مثلي، وإعادة ليغات حبلا الحمض النووي خفض عن طريق الخطأ المعرضة غير متماثلة نهاية الانضمام، والتي يمكن أن تؤدي بالتالي إلى إدراج أو حذف النوكليوتيدات (ق) مما تسبب الطفرات فرمشيفت 1 .

سهولة كبيرة وبراعة من كريسبر / Cas9 أبرأوتش جعلت أداة جذابة للغاية لشاشات خروج المغلوب الجينوم على نطاق واسع تهدف إلى كشف وظائف الجينات غير معروف 2 ، 3 . ومع ذلك، فإن نهج خروج المغلوب الجيني واحد من استخدام محدود إذا بارالوغس متعددة مع وجود وظائف زائدة عن الحاجة. وهكذا، قد لا يكون تخثر جين واحد كافيا لتحديد وظيفة هذا الجين نظرا لتعويض ممكن من قبل بارالوغوز مما أدى إلى القليل أو عدم وجود تغيير المظهري 4 . ولذلك فمن المهم أن تدق المعادلات بالتوازي من خلال تقديم ناقلات الحمض النووي الريبي متعددة تستهدف مختلف الجينات بارالوغوس من أجل التغلب على تأثير التعويض الجيني.

لتوسيع استخدام كريسبر / Cas9 إلى خروج المغلوب الجيني خوارزمية، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة استنساخ سريعة، من خطوة واحدة لاستنساخ ما يصل إلى أربعة غرناس قبل صلب إلى ناقلات الفيروس الوعائي واحد 5 . العمود الفقري، واسمه كريسبر-كونكاتيمر، ويستندعلى البلازميد مسف ريتروفيرال تحتوي على تكرار غرنا أشرطة الكاسيت. كل كاسيت يحتوي على اثنين من مواقع الاعتراف مقلوب من نوع إيس انزيم تقييد بس الأول، والتي يمكن استبدالها بشكل لا رجعة فيه من قبل غرنا صلب أوليغو مع المتراكمة مطابقة باستخدام غولدن غيت خلط خلط رد فعل في أنبوب واحد 6 . وتتكون طريقة الاستنساخ هذه من دورات متكررة من الهضم والربط التي تسمح بالتجمع المتزامن لشظايا الحمض النووي المتعددة من خلال استغلال تسلسل متراكمة مختلفة ولدت من قبل بس I. تفرد هذا الإنزيم هو، على سبيل المثال، القدرة على إجراء تخفيضات غير المتماثلة خارج الاعتراف بها تسلسل؛ وبالتالي، يمكن لكل كاسيت يكون تسلسل مختلف مع يتدلى مخصصة المرافقة الموقع الأساسية BBS الأول وبهذه الطريقة، كل gRNA يمكن استنساخ في وضع واتجاه محدد من ناقلات متسلسل.

وكدليل على المبدأ، أثبتنا استخدام هذه الاستراتيجية فيالماوس أورغانويدز المعوية عن طريق تعطيل في وقت واحد اثنين من أزواج من المنظمين السلبية بارالوغوس من مسار ونت من قبل جولة واحدة من إليكتروبوراتيون 5 .

خلال السنوات القليلة الماضية، وضعت العديد من المجموعات الأخرى استراتيجيات مماثلة على أساس متعددة ناقلات التعبير الحمض النووي الريبي التي شيدت باستخدام البوابة الذهبية خلط 7 لتحقيق خروج المغلوب متعددة الجينات في أنظمة نموذجية مختلفة، مثل خطوط الخلايا البشرية 8 ، 9 ، الزرد 10 والإشريكية القولونية 11 - في البروتوكولات الخاصة بهم، يتم استنساخ غرناس أولا في ناقلات وسيطة الفردية ومن ثم تجميعها معا في منتج نهائي واحد. على النقيض من ذلك، فإن الميزة الرئيسية لاستراتيجيتنا كريسبر-كونكاتيمر هو راحة واحدة بس الأول خلط، خطوة الاستنساخ. مثل غيرها من المراسلات غرنا، طريقة لدينا يجعل ممكنا إما خروج المغلوب في وقت واحد لمدة تصل إلى أربعةوجينات مختلفة أو زيادة كريسر خروج المغلوب كفاءة بعد استهداف واحد أو اثنين من الجينات مع غرناس متعددة ( الشكل 1 ).

في هذا البروتوكول، ونحن تصف بالتفصيل كل خطوة في توليد ناقلات كريسبر-كونكاتيمر، من تصميم غرنا إلى رد فعل غولدن غيت وتأكيد الاستنساخ الناجح. ونحن نقدم أيضا بروتوكول كفاءة عالية لترنسفكأيشن من كريسبر-كونكاتيمرز في الماوس أورغانويدس الأمعاء الصغيرة عن طريق إليكتروبوراتيون والتجارب انسحاب عامل النمو اللاحق.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم غرنا ل كريسبر-كونكاتيمر ناقلات

ملاحظة: الهدف من هذا القسم هو شرح كيفية اختيار أفضل استراتيجية استهداف وكيفية تصميم غرناس تحتوي على متراكب محددة لناقلات كريسبر-كونكاتيمر.

  1. تصميم غرناس ضد الجينات ذات الفائدة باستخدام أداة تصميم كريسبر غرنا من الاختيار. انظر جدول المواد على سبيل المثال.
    ملاحظة: عند استهداف زوج من الجينات بارالوغوس، على الرغم من أنه من الممكن لتصميم غرنا واحد في الجين، فإنه من المستحسن تصميم اثنين من غرناس لكل الجينات لزيادة فرص تحقيق خروج المغلوب مزدوجة ( الشكل 1 ).
  2. تأكد من أن gRNAs لا يحتوي الموقع الاعتراف BBS I باستخدام أداة رسم خرائط التقييد (انظر جدول المواد للحصول على مثال).
  3. إضافة محددة المتجهات كريسر-كونكاتيمر ناقلات إلى كل قليل، كما هو مبين في الجدول 1 .
"فو: كيب-together.within-بادج =" 1 "فو: كيب-ويث-next.within-بادج =" ألويس "> كاسيت 1 كاسيت 2 كاسيت 3 كاسيت 4 تسلسل (5'-3 ') CACCGG [gRNA1] GT ACCGG [gRNA2] G CCGG [gRNA3] ACACCGG [gRNA4] GTT تسلسل (5'-3 ') TAAAAC [RC-gRNA1] CC AAAAC [RC-gRNA2] C AAAC [RC-gRNA3] CTAAAAC [RC-gRNA4] CCG

الجدول 1: يتدلى لكل كاسيت من كريسبر-كونكاتيمر ناقلات.

2. استنساخ غرناس في كريسبر-كونكاتيمر ناقلات

  1. الفسفرة و الصلب من أوليغوس
    ملاحظة: توضح هذه الخطوة كيف tس أنيل أعلى وأسفل خيوط لكل غرنا أوليغو وكيفية فوسفهوريلات غاياتهم في رد فعل واحد.
    1. إعداد خليط التفاعل ل أوليغوس فسفوريلاتينغ والصلب أعلى وأسفل خيوط على الجليد، وفقا للتعليمات أدناه.
      ملاحظة: جميع أوليغوس يمكن تجميعها في رد فعل واحد. على سبيل المثال، في حالة ناقلات 4 غرنا-كونكاتيمر، تجمع معا 8 أوليغوس.
    2. ل 3 كونكاتيمرز، واستخدام 3.0 ميكرولتر غرنا حبلا أعلى (1.0 ميكرولتر من كل غرنا؛ 10 ميكرومتر، 1 ميكرولتر / غرنا)، 3.0 ميكرولتر غرنا حبلا السفلي (1.0 ميكرولتر من كل غرنا؛ 10 ميكرومتر، 1 ميكرولتر / غرنا)، 2.0 ميكرولتر T4 دنا يغاز العازلة (10X)، 1.0 ميكرولتر T4 بنك، وإضافة H 2 O يصل إلى إجمالي حجم 20.0 ميكرولتر.
    3. مزيج جيدا عن طريق بيبتينغ وتشغيل هذا في ثيرمويكلر باستخدام الإعدادات التالية: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، منحدر وصولا الى 25 درجة مئوية عند 0.3 درجة مئوية / دقيقة، وعقد في 4 درجات مئوية.
  2. بس أنا خلط رد الفعل
    ملاحظة: في هذا القسم، يتم دمج ما قبل صلب أوليغوس الحمض الريبي النووي النقال في الموقف المناسب من ناقلات كوناكاتيمر في خطوة واحدة عن طريق تناوب دورات الهضم والربط.
    1. تمييع خليط التفاعل 1: 100 في الدناز / ريبونوكلياز خالية من المياه لتوليد 3 و 4 ناقلات غنا-كونكاتيمر.
      ملاحظة: عند استنساخ 2 غرنا-كونكاتيمرز هذه الخطوة ليست هناك حاجة.
    2. تجميع بس الأول خلط رد فعل على الجليد، وفقا للتعليمات أدناه. تضمين عنصر تحكم سلبي يحتوي فقط على المتجه.
    3. استخدام 100 نغ كريسبر-كونكاتيمر ناقلات، 10.0 ميكرولتر خليط أولي، 1.0 ميكرولتر بسا التي تحتوي على تقييد انزيم العازلة (10X)، 1.0 ميكرولتر دت (10 ملم)، 1.0 ميكرولتر أتب (10 ملم)، 1.0 ميكرولتر بس I، 1.0 ميكرولتر T7 ليغاز ، و H 2 O تصل إلى إجمالي حجم 20.0 ميكرولتر.
    4. مزيج جيدا عن طريق بيبتينغ وتشغيل هذا في ثيرمويكلر باستخدام الإعدادات التالية: تشغيل 50 دورات لاستنساخ 3 و 4 غرنا-كونكاتيمرز و 25 دورات لمدة 2 غرنا-كونكاتيمرز، على حد سواء في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 21 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وعقد في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم 4 درجة مئوية إلى الأبد.
  3. العلاج بالطبقة الخارجية
    ملاحظة: ينصح بشدة هذه الخطوة لأنها تزيد من كفاءة الاستنساخ عن طريق إزالة أي آثار الحمض النووي الخطي.
    1. علاج بس الأول خلط رد الفعل مع نوكلياز النووي الحمض النووي (انظر جدول المواد ) على النحو التالي.
    2. خذ 11.0 ميكرولتر ربط مزيج من الخطوة السابقة (2.2.3)، إضافة 1.5 ميكرولتر عازلة اكسونوكلياز (10X)، 1.5 ميكرولتر أتب (10 ملم)، 1.0 ميكرولتر دنا نوكلياز، وإحضار الحجم الإجمالي إلى 15.0 ميكرولتر بالماء. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تليها 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: هذه الخطوة يزيل أي الحمض النووي الخطي المتبقية في الخليط، وبالتالي يزيد من كفاءة الاستنساخ.
    3. استخدام 2 ميكرولتر من خليط التفاعل للتحول إلى كومب كيميائياخيمة E. كولاي البكتيريا بواسطة صدمة الحرارة 12 .
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن تخزين التفاعل لمدة تصل إلى أسبوع واحد في -20 درجة مئوية.
  4. تقييد الهضم
    ملاحظة: والهدف من هذه الخطوة هو تقييم عن طريق تقييد الهضم نجاح إجراء الاستنساخ.
    1. لتأكيد وجود إدراجات غرنا في ناقلات كريسبر-كونكاتيمر، واختيار 4-8 المستعمرات البكتيرية مع حلقة تطعيم، وتنمو كل استنساخ في 4 مل من لب المتوسطة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في شاكر المداري. استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة مينيبريب البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (انظر جدول المواد ).
    2. هضم ~ 200 نانوغرام من الحمض النووي مع 10 U إوكر I + 5 U بغل الثاني في رد فعل 10 ميكرولتر من قبل احتضان ذلك في 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات في حاضنة البكتيريا. تضمين خليط التفاعل منفصلة مع ناقلات الأصلي المقابلة كسيطرة إيجابية لمقارنة الحجم.
      ملاحظة: ثيسوف تأكيد ما إذا كانت جميع كونكاتيمرز موجودة، لأن هذين الإنزيمات تقييد سوف تكدس كل كونكاتيمرز. هذه هي الأحجام المتوقعة لكل كونكاتيمر: 2 غرنا-كونكاتيمر (800 بب)، 3 غرنا-كونكاتيمر (1.2 كبب)، و 4 غرنا-كونكاتيمر (1.6 كبب).
    3. تشغيل ردود الفعل الهضم على هلام الاغاروز 1٪ في 90 V لمدة 20 دقيقة تقريبا.
    4. تصور هلام باستخدام ترانزيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية. تحديد الحيوانات المستنسخة مع حجم إدراج الصحيح من خلال ضمان نمط الفرقة يطابق واحد من ناقلات الأصلي وأن كل جزء لديه الحجم المتوقع باستخدام سلم الحمض النووي.
    5. هضم المستنسخات المختارة مع 5 U بس I في 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات في حاضنة البكتيريا. تضمين مزيج رد فعل منفصل مع ناقلات الأصلي المقابلة كعنصر تحكم.
      ملاحظة: هذه الخطوة الهضم إضافية هي التأكد من أن غرناس تم استنساخها في المكان المناسب، وبالتالي فقدت كل بس مواقع الاعتراف I.
    6. تشغيل ردود الفعل الهضم جراوهو 1٪ هلام الاغاروز في 90 V لمدة 20 دقيقة تقريبا. النظر في الصحيح فقط ناقلات التي لا قطع بواسطة بس الأول لأنها تحتوي فقط غرناس.
  5. تسلسل ناقلات
    ملاحظة: والهدف من هذه الخطوة هو تأكيد وجود تسلسل الحمض النووي الريبي في تلك النواقل التي تم تحديدها على النحو الصحيح عن طريق تحليل الهضم تقييد.
    1. تأكيد ناقلات متزامنة إيجابية من قبل سانجر التسلسل 13 باستخدام الاشعال التالية:
      إلى الأمام: تساغكتغتاكاكتاغ (لفحص أول غرنا كاسيت)
      Linker1_Forward: غاكتاغاغاتغاكاكا (لفحص ثاني غرنا كاسيت)
      Linker2_Reverse: غغتاغتكغاكغتاغت (لفحص الكاسيت غرنا الثاني)
      Linker2_Forward: أككتاسغتغسغاكتاسك (لفحص الكاسيت الثالث غرنا)
      Linker3_Reverse: تكتكتكتاغاتكاغتكتكات (لفحص الكاسيت الثالث غرنا)
      عكس: أغغغغاغكاكاغ (لفحص غرنا الماضيكاسيت)
    2. تحقق من وجود كل غرنا من خلال البحث تسلسلها في التسلسل يقرأ.

3. ترنسفكأيشن من أورغانويدز المعوية بواسطة إليكتروبوراتيون

ملاحظة: يرجى ملاحظة أن هذا الإجراء يقوم على البروتوكول الذي نشره فوجي وآخرون . في عام 2015، مع التكيف للماوس الصغيرة الثقافات الأمعاء العضوي 14 .

  1. قبل Electroporation لل
    ملاحظة: يصف هذا القسم كيفية إعداد أورغانويدس الأمعاء الماوس قبل إليكتروبوراتيون عن طريق إزالة جميع المضادات الحيوية ووسائل الإعلام مكيفة من وسط ثقافتهم. وهذا سيمنع الآثار السامة المحتملة أثناء إليكتروبوراتيون.
    1. في يوم 0 من إجراء ترنسفكأيشن، أورغانويدس تقسيم في نسبة 1: 2.
      ملاحظة: يمكن الحصول على الثقافات العضوي المعوية عن طريق أداء العزلة كريبت وفقا للبروتوكولات التي أنشئت سابقا 15 . يرجى الرجوع إلى الجدول 2 لجميع تركيبات الوسائط.
      1. عند تقسيم أورغانويدس إليكتروبوراتيون، البذور ما لا يقل عن 6 بئر من لوحة 48 جيدا في ترنسفكأيشن.
      2. البذور أورغانويدز في 20 ميكرولتر الطابق السفلي مصفوفة قطرات وتنمو في وينر + نيك المتوسطة (ونت + إغف + نوجين + R- سبوندين + نيكوتيناميد) عند 37 درجة مئوية، و 5٪ كو 2 في حاضنة ترطيب (كما هو موضح سابقا 15 ) .
    2. في يوم 2، تغيير المتوسطة عن طريق استبدال وينر + نيك مع 250 ميكرولتر من إن (إغف + نوجين) + CHIR99021 (جليكوجين سينثاس كيناز -3 مثبط) + Y-27632 (روك المانع)، دون المضادات الحيوية (انظر الجدول 2 ).
      ملاحظة: في جميع الخطوات، وكمية المتوسطة المضافة إلى كل بئر من لوحة 48 جيدا هو 250 ميكرولتر.
    3. في يوم 3، تغيير المتوسطة عضوي ل إن + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25٪ الخامس / الخامس ثنائي ميثيل سلفوكسيد (دمسو)، دون المضادات الحيوية.
  2. إعداد الخلايا
    ملحوظة:هنا نحن تصف كيفية تقسيم أورغانويدز في مجموعات الخلايا الصغيرة عن طريق التفكك الميكانيكية والكيميائية. هذه الخطوات حاسمة لنجاح الإجراء.
    1. في يوم 4، وتعطيل القباب مصفوفة القبو باستخدام تلميح ماصة 1 مل ونقل أورغانويدز إلى أنبوب 1.5 مل. تجمع محتويات أربعة آبار من لوحة 48 جيدا في أنبوب.
    2. كسر ميكانيكيا أورغانويدز في شظايا صغيرة عن طريق بيبتينغ صعودا وهبوطا مع ماصة P200 حوالي 200 مرة. أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة، 5 دقائق في 600 × ز.
    3. إزالة المتوسطة و ريسوسبيند بيليه في 1 مل من خلية البروتين الصف المؤتلف المؤتلف الصف (انظر جدول المواد). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة أقصاها 5 دقائق ثم تحقق من انخفاض 50 ميكرولتر من العينة تحت المجهر الضوئي مقلوب مع الهدف 4x.
      ملاحظة: مجموعات من 10 - 15 خلايا مرغوبة، وهذا يزيد من بقاء الخلية بعد إليكتروبوراتيون.
    4. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب ملزم منخفضة 15 مل ووقفالتفكك بإضافة 9 مل من وسط القاعدية دون المضادات الحيوية (انظر الجدول 2 ). أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة، 5 دقائق في 600 x ج، ثم تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه في 1 مل من انخفاض المصل المتوسطة (انظر جدول المواد ).
    5. عد عدد الخلايا مع غرفة بوركر واستخدام الحد الأدنى من 1 × 10 5 خلايا لكل رد فعل إليكتروبوراتيون. إضافة 9 مل انخفاض المصل المتوسطة إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة، 3 دقائق في 400 × ز.
  3. Electroporation لل
    ملاحظة: تقدم الأقسام التالية تعليمات حول كيفية تنفيذ إليكتروبوراتيون وجعل أورغانويدس استرداد بعد ذلك.
    1. إزالة كل من طاف و ريسوسبيند بيليه في حل إليكتروبوراتيون (انظر جدول المواد ). إضافة ما مجموعه 10 ميكروغرام من الحمض النووي لتعليق الخلية وإضافة حل إليكتروبوراتيون إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر والحفاظ على الخلية دنخليط على الجليد. استخدام كريسبر-كونكاتامر ناقلات في تركيبة مع البلازميد التعبير Cas9 (على سبيل المثال أدجين # 41815) في نسبة 1: 1.
      ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الكلي للحمض النووي المضافة أقل من أو يساوي 10٪ من حجم التفاعل الكلي.
    2. وتشمل مزيج ترنسفكأيشن منفصلة تحتوي على البلازميد غفب لتقييم كفاءة ترنسفكأيشن (على سبيل المثال بمف-غفب، أدجين # 11153، أو أي عامة غمب معربا عن البلازميد).
    3. إضافة خليط الحمض النووي الخلية إلى كوفيت إليكتروبوراتيون ووضعه في غرفة إليكتروبوراتور. قياس مقاومة عن طريق الضغط على الزر المناسب على إليكتروبوراتور والتأكد من أنه هو 0.030-0.055 Ω. أداء إليكتروبوراتيون وفقا للإعدادات المبينة في الجدول 3 .
      ملاحظة: إذا كانت قيمة المعاوقة تقع خارج النطاق المسموح به، اضبط حجم الحل في كوفيت.
    4. إضافة 400 ميكرولتر من العازلة إليكتروبوراتيون + Y-27632 إلى كوفيت ومن ثم نقل كل إلى أنبوب 1.5 مل. Incubaتي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا لاسترداد وبعد ذلك تدور لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق في 400 x ز.
    5. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه في 20 ميكرولتر / حسنا من مصفوفة الطابق السفلي. البذور حوالي 1 × 10 4 إلى 1 × 10 5 خلايا لكل بئر في لوحة 48 جيدا وإضافة إن + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25٪ الخامس / الخامس دمسو المتوسطة. احتضان عند 37 درجة مئوية.
    6. في يوم 5، تغيير المتوسطة إلى إن + CHIR99021 + Y-27632، والتحقق من كفاءة ترنسفكأيشن من خلال مراقبة التعبير غفب ( الشكل 2 ). إبقاء أورغانويدس عند 37 درجة مئوية وتحديث إن + CHIR99021 + Y-27632 المتوسطة بعد 2 أيام.
    7. في يوم 9، تغيير المتوسطة إلى وينر + نيك + Y-27632 واحتضان عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: Y-27632 يمكن إزالتها بعد 7-10 أيام (يوم 16-19).
بورينغ النبض نقل النبض
الجهد االكهربى 175V 20V
طول النبض 5 ميللي ثانية 50msec
نبض الفاصل الزمني 50msec 50msec
عدد النبضات 2 5
معدل التسوس 10٪ 40٪
قطبية + +/-

الجدول 3: إعدادات إليكتروبوراتيون.

4. عامل النمو الانسحاب

ملاحظة: هنا هو مثال على كيفية إجراء تجربة انسحاب عامل النمو عند ضرب المنظمين السلبي للمسار ونت في أورغانويدز المعوية.

  1. 10-14 أيام بعدr إليكتروبوراتيون، تقسيم أورغانويدس في نسبة 1: 3 في لوحة 48 جيدا بعد الخطوات المذكورة أعلاه (3.2.1 - 3.2.2).
  2. ريسوسبيند بيليه العضوي في 20 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي والسماح لها ترسيخ عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم، تراكب 250 ميكرولتر من عامل النمو المحروم المتوسطة (على سبيل المثال إن) لاختبار ما إذا كان خروج المغلوب من الجينات المستهدفة قد تحققت 5 .
  3. تقسيم أورغانويدز تحت ظروف عامل حرمان النمو لمدة لا تقل عن 2 - 3 الممرات لمعرفة الفرق في البقاء على قيد الحياة بين الأنواع البرية السيطرة ويلديب (وت) أورغانويدس متحولة 5 ، 15 .
    ملاحظة: لا ينبغي أن يكون أورغانويدس ويلدتيب قادرة على البقاء على قيد الحياة في النمو عامل المحرومين المتوسطة على ممرين، في حين أن خطوط متحولة يجب أن تكون قادرة على النمو.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل تأكيد وجود العدد الصحيح من إدراج الحمض الريبي النووي النقال في ناقلات كونكاتيمر، يتم تنفيذ تقييد الهضم مع الإنزيمات ( إكور I + بغل الثاني) يرافق كل غرنا معربا عن أشرطة (كل حجم كاسيت هو ~ 400 نقطة أساس، الشكل 1 ). على سبيل المثال، عند إنشاء 4 غرنا- ناقل متزامن، وحجم المتوقع من الفرقة السفلى في هلام الاغاروز حوالي 1.6 كيلوبايت. أي الفرقة أقل من هذا يشير إلى أن ليس كل من 4 أشرطة غرنا يتم إدراجها في ناقلات ( الشكل 2A ). وبالإضافة إلى ذلك، فمن المستحسن دائما للتحقق من أن جميع بس اعترفت مواقع الاعتراف I والانزيم لا قطع ناقلات ( الشكل 2B ).

مرة واحدة وقد تم تأكيد يبني، ويمكن تسليمها إلى أورغانويدس الأمعاء الماوس عن طريق إليكتروبوراتيون لتحقيق أوبتيمالتر مستويات كفاءة ترنسفكأيشن (تصل إلى 70٪)، كما هو مبين من قبل السيطرة غفب ( الشكل 3 ).

وأخيرا، لاختبار وظيفيا كفاءة هذه الاستراتيجية، تم تربيتها أورغانويدز المعوية ترانزفكتد مع Cas9 وناقلات كونكوماتر ضد Axin1 / 2 و Rnf43 / Znrf3 في إن (R- سبوندين الانسحاب) و إن + IWP2 (R- سبوندين و ونت الانسحاب، IWP2 : مثبط النيص، 2.5 ميكرومتر) وسائل الإعلام لمدة لا تقل عن 3 مقاطع ( الشكل 4 ). في حين مات أورغانويدز وت ترانزفكتد تحت كلا الظروف، نجا Axin1 / 2 عضلات المغلوب خروج المغلوب في كلاهما بسبب تفعيل المصب من مسار ونت؛ بالإضافة إلى ذلك، Rnf43 / Znrf3 متحولة أورغانويدز البقاء على قيد الحياة في غياب R- سبوندين ولكن لا يمكن البقاء على قيد الحياة في وجود IWP2، والذي يسبب نضوب ونت أن ينشط المسار. مجتمعة، هذه الملاحظات تبين أن خروج المغلوب من هذه أزواج من بارالوغوز ممكن من خلال توليد روقال انه يتوقع النمط الظاهري عضوي. وقد نشرت تفاصيل هذه النتائج في علم الأحياء التنموي 5 .

figure-results-1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لل كريسبر-كونكاتيمر مع 4 كاسيت. مخطط من 4 غرنا-متناظرة ناقلات مع كل 400 بب الكاسيت التي تحتوي على المروج U6، واثنين من مقلوب المتكررة بس I المواقع (كما أشار بب) وسقالة غرنا في هذا النظام. خلال رد فعل خلط، يتم استبدال المواقع BBS I بشظايا gRNA مع مطابقة يتدلى، وبالتالي فقدت. يتم عرض مواقع ملزمة من الاشعال التسلسل للتحقق من الإدراج الصحيح من أوليغوس الحمض الريبي النووي النقال من قبل الأسهم الزرقاء. فود = التمهيدي إلى الأمام، ريف = التمهيدي العكسي، وصلة 1/2/3 = مناطق رابط 1/2/3. يرجى جلعق هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: أنماط الهضم ممثل المتجهات كونكاتموتر. ( A ) الهضم المزدوج من 3 و 4 ناقلات غنا-كونكاتيمر مع إكور الأول و بغل الثاني. يتم وضع علامة على نمط الهضم الصحيح من قبل علامة خضراء، في حين يتم وضع علامة على ناقلات مع 1 أو 2 غرنا الإدراج عن طريق الصليب الأحمر. حارة 1 يظهر الهضم من 4 غرنا-كونكاتيمر ناقلات الوالدين تستخدم السيطرة الإيجابية (ملحوظ ب "+")؛ وبالمثل، يظهر حارة 5 الهضم من 3 غرنا-كونكاتيمر ناقلات الوالدين، تميزت ب "+". ( B ) الهضم مع بس الأول، والتي تبين الحجم الصحيح من ناقلات كوناكاتيمر عسر الهضم (المشار إليها من قبل القراد الأخضر). يتم استخدام الهضم من ناقلات المتزامنة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي التي فقدت بس I المواقع باعتبارها السيطرة الإيجابية d تم وضع علامة "+". الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: صورة الممثل من أورغانويدس المعوية إليكتروبوراتد بنجاح. ترنسفكأيشن من البلازميد غفب هو مفيد لتقييم كفاءة ترنسفكأيشن. ما يقرب من 24 ساعة بعد إليكتروبوراتيون، أورغانويدز تحتوي على عدد قليل من الخلايا مرئية بالفعل، وإذا كان الإجراء إليكتروبوراتيون ناجحة، وتصل إلى 70٪ منهم يعرض مضان الأخضر. بف = حقل مشرق، غفب = البروتين الفلورسنت الأخضر. شريط مقياس = 2000 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ether.within الصفحات = "1"> figure-results-4
الشكل 4: صور الممثل من أورغانويدس الأمعاء متحولة. خروج المغلوب من المنظمين السلبية للمسار ونت Axin1 و Rnf43، جنبا إلى جنب مع بارالوغوز، يجعل أورغانويدز الأمعاء مقاومة للحرمان عامل النمو. على وجه الخصوص، أكسين 1/2 عضلات المغلوب خروج المغلوب (Axin1 / 2 كو) يمكن أن تنمو في غياب كل من R- سبوندين (إن: إغف + نوجين) و ونت (إن + IWP2: إن + النيص الشيوع)، في حين أن Rnf43 / Znrf3 متحولة العضوية (R & Z كو) يمكن البقاء على قيد الحياة إلا في غياب R- سبوندين (بالإنكليزية). في المقابل، يمكن أورغانويدز وت البقاء على قيد الحياة فقط في حالة ثقافة السيطرة، وينر + نيك (ونت + إغف + نوجين + R- سبوندين + نيكوتيناميد). مقياس الحانات = 1،000 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوسط القاعدي تعليقات
تخزين في 4 درجات مئوية لمدة 4 أسابيع
وسط زراعة الخلايا 500 مل انظر جدول المواد
L- الجلوتامين 100X 5 مل
وكيل التخزين المؤقت 1 M 5 مل انظر جدول المواد
البنسلين الستربتومايسين 100x 5 مل
وينر + نيك (ونت + إغف + نوجين + R-سبوندين + نيكوتيناميد)
تخزين في 4 درجات مئوية لمدة 2 أسابيع
الوسط القاعدي تصل إلى 50 مل
الملحق الخلايا العصبية خالية من مصل (50X) 1 مل انظر جدول مااستنباط مواد
الملحق الخلايا العصبية خالية من مصل (100x) 500 ميكرولتر انظر جدول المواد
n-أسيتيلسيستين (500 ملي) 125 ميكرولتر
الماوس إغف (100 ميكروغرام / مل) 25 ميكرولتر
ماوس نوجين (100 ميكروغرام / مل) 50 ميكرولتر
R-سبوندين مكيفة المتوسطة 5 مل
Wnt3a مكيفة المتوسطة 25 مل
نيكوتيناميد (1 م) 250 ميكرولتر
إن + تشير + Y-27632 (إغف + نوجين + تشير + Y-27632)
تخزين في 4 درجات مئوية لمدة 2 أسابيع
بسال المتوسط ​​ث / س البنسلين الستربتومايسين تصل إلى 20 مل
الملحق الخلايا العصبية خالية من مصل (50X) 400 ميكرولتر انظر جدول المواد
الملحق الخلايا العصبية خالية من مصل (100x) 200 ميكرولتر انظر جدول المواد
n-أسيتيلسيستين (500 ملي) 50 ميكرولتر
الماوس إغف (100 ميكروغرام / مل) 10 ميكرولتر
ماوس نوجين (100 ميكروغرام / مل) 20 ميكرولتر
Y-27632 (10 ميكرومتر) 20 ميكرولتر
CHIR99021 (8 ميكرومتر) 10 ميكرولتر
إن (إغف + نوجين)
تخزين في 4 درجات مئوية لمدة 4 أسابيع
الوسط القاعدي تصل إلى 50 مل
الملحق الخلايا العصبية خالية من مصل (50X) انظر جدول المواد
الملحق الخلايا العصبية خالية من مصل (100x) 500 ميكرولتر انظر جدول المواد
n-أسيتيلسيستين (500 ملي) 125 ميكرولتر
الماوس إغف (100 ميكروغرام / مل) 25 ميكرولتر
ماوس نوجين (100 ميكروغرام / مل) 50 ميكرولتر
بادج = "1" فو: كيب-ويث-next.within-بادج = "ألويس">

الجدول 2: تكوين وسائل الاعلام العضوي.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، ونحن بالتفصيل جميع الخطوات اللازمة لتوليد كريسبر-كونكاتيمرز وتطبيق كريسبر-كونكاتيمرز في أورغانويدس الأمعاء الماوس من أجل ضرب في وقت واحد من جينات متعددة. وكما ذكر سابقا، فإن لهذه الاستراتيجية عدة مزايا، مثل سرعتها وكفاءتها العالية وفعاليتها من حيث التكلفة.

من أجل تنفيذ الإجراء بأكمله بنجاح، وهناك عدد قليل من الجوانب الهامة للنظر فيها. أولا، من الضروري أن جميع أوليغوس الحمض الريبي النووي النقال هي صلبة بشكل صحيح وفوسفهوريلاتد، لأنها تمثل المواد انطلاق لاستنساخ بس الأول استنساخ أنه في حد ذاته هو فعال جدا. ثانيا، عندما إليكتروبوراتينغ أورغانويدز، والمزيد من الخلايا المستخدمة في حالة، وارتفاع كفاءة ترنسفكأيشن أقصى قدر ممكن. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أيضا أنه بعد تفكك الخلية، وتغلب مجموعات الخلايا الصغيرة على خلايا واحدة.

ومع ذلك، فمن الممكن أن تواجه المهنيةيمس عند محاولة إما الاستنساخ أو ترنسفكأيشن للمرة الأولى. في حالة وجود مشاكل أثناء الاستنساخ غرنا، فمن المستحسن لمضاعفة التحقق من تسلسل أولي غرنا، وإذا كان ذلك صحيحا، حدد المستعمرات البكتيرية إضافية للفحص تقييد الهضم. إذا كفاءة ترنسفكأيشن وبقاء الخلية منخفضة بعد إليكتروبوراتيون، ثم فإنه من المستحسن لتكرار بروتوكول باستخدام المزيد من الخلايا في حالة والحد من الوقت من تفكك الخلية إلى 3 دقائق.

على الرغم من أن توليد كريسبر-كونكاتيمرز هو رخيصة نسبيا وسهلة، وأداء شاشات وراثية أكبر نطاقا في أورغانويدس ليس، كما هو مقيد من حيث التكاليف المرتبطة الثقافة العضوية وطبيعة كثيفة العمالة. ومن الجدير بالذكر في هذه الحالة أن طريقة كريسبر-كونكاتيمر هي أيضا متوافقة مع خطوط الخلايا، مثل HEK293 والخلايا الجذعية الجنينية الماوس.

بغض النظر عن النظام الخلوي، عيب محتمل آخر من هذا sتراجي يمكن أن تصادف عندما تهدف إلى خروج المغلوب في وقت واحد من ثلاثة أو أربعة جينات مختلفة. على سبيل المثال، سيكون لكل غرنا كفاءة استهداف مختلفة، والتغيرات في ضرب جميع الجينات في نفس الوقت يمكن أن تكون منخفضة نسبيا، لهذا السبب، فإنه من المستحسن لتوظيف نظام كونكاتيمر لتوجيه أكثر من غرنا واحد ضد نفس الجين.

وقد اقترحت استراتيجيات بديلة على أساس مماثل على غولدن غيت خلط على مر السنين لتوليد ناقلات الحمض الريبي النووي النقال متعددة 7 ، 8 . ومع ذلك، في طريقة لدينا فمن الممكن لتجميع مباشرة غرناس متعددة في ناقلات فيروسات واحدة في جولة واحدة من الاستنساخ، مما يجعلها مناسبة لتوليد المكتبات غرنا لاستهداف المعادلات.

لدينا كريسبر-كونكاتيمر بنيت في مسكف العمود الفقري ناقلات الفيروس العكسي. وهكذا، يمكن أن تستخدم الحمض النووي الريبي التي تحتوي على الموروث الفيروسي لتوليد خطوط الخلايا مستقرة أن أوفيركسريس غرناس. عندما يقترن نظام Cas9 محرض، يمكن للمرء أن يؤدي محرضات قاضات المحاكاة باستخدام نظامنا.

باختصار، هنا نحن تصف كيفية استنساخ ما يصل إلى أربعة غرناس مختلفة في نفس ناقلات في خطوة واحدة وكيفية تطبيق هذه الاستراتيجية لثقافة عضوي مع كفاءة ترنسفكأيشن عالية. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم اقتراحات مفيدة لتحقيق أقصى قدر من فرص النجاح في جميع أنحاء الإجراء بأكمله.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف. المؤلفين لا تضارب المصالح المعلن عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر كريستوفر هيندلي على القراءة الحرجة للمخطوطة. آم مدعوم من ونتساب (ماري كوري إتن)، آ-R. بدعم من مجلس البحوث الطبية (مرك)، و بك. و آرإم بدعم من زمالة السير هنري ديل من ويلكوم ترست والجمعية الملكية [101241 / Z / 13 / Z] والحصول على الدعم من خلال منحة أساسية من ويلكوم ترست ومركز موارد المهاجرين إلى ويلكوم الثقة - مرك كامبريدج الخلايا الجذعية معهد .

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أداة تصميم CRISPR محسنةFeng Zhangأداة تصميم CRISPR gRNA ؛ http://crispr.mit.edu/
أداة رسم خرائط تقييدWebcutter 2.0
T4 PNK (بولي نوكليوتيدات كيناز) نيوإنجلاند بيولابزM0201L
T4 DNA ligase عازلةنيو إنجلاند BiolabsM0202S
T7 DNA LigaseNew England BiolabsM0318L
DTT (dithiothreitol)PromegaP1171
ATP (أدينوسين ثلاثي الفوسفات) NewEngland BiolabsP0756S
FastDigest BbsI (BpiI)Thermo FisherFD1014
Tango buffer (مخزن مؤقت لإنزيم التقييد المحتوي على BSA)Thermo FisherBY5
BglIIنيو إنجلاند بيولابزR0144
EcoRIنيو إنجلاند بيولابزR0101
نوكلياز خارجي آمن للبلازميدكامبيوE3101K
التدوير الحراريالأنظمة الحيوية التطبيقية4359659
10G بكتيريا الإشريكية القولونية المختصةكامبريدج بيوساينس60108-1
طقم البلازميد الصغيرQiagen12125
جهاز طرد مركزي دقيق على الطاولةEppendorfUY-02580-01
حلقات التلقيح MicrospecPLS5
حاضنة البكتيرياSanyoMIR-262
مرق Luria-Bertani (LB)Sigma-AldrichL3522
AgaroseSigma-AldrichA4718
جهاز الرحلان الكهربائي لجل الاغاروزBioneerA-7020
Advanced DMEM / F12 (وسط زراعة الخلايا)Invitrogen12634-034
Glutamax (L-Glutamine) 100xInvitrogen35050-068
HEPES 1 M (عامل تخزين مؤقت)Invitrogen15630-056
Penicillin-Streptomycin 100xInvitrogen15140-122
B27 (الخلية العصبية مكمل خال من المصل) مكمل غذائي 50xInvitrogen17504-044
N2 (مكمل خال من مصل الخلايا العصبية) 100xInvitrogen17502-048
n-Acetylcysteine 500 مليسيجما ألدريتشA9165-5G
ماوس EGF 500 & مايكرو ؛ جم / ملInvitrogen BiosourcePMG8043
Mouse Noggin 100 & micro ؛ جم / ملPeprotech250-38
نيكوتيناميد 1 MSigmaN0636
R-Spondin متوسطمكيف n.a.n.a.أنتجفي المنزل من خلايا HEK293 ، لمزيد من التفاصيل انظر Sato and Clevers 2013
Wnt المتوسط المكيفn.a.n.a.Producedفي المنزل من خلايا HEK293 ، للحصول على التفاصيل انظر Sato and Clevers 2013
Y-27632 10 & micro ؛ MSigma-AldrichY0503-1MG
مصفوفة BD Matrigel القياسيةBD Biosciences356231
48 بئر لوحةGreiner Bio One677980
CHIR99021Sigma-AldrichA3734-1MG
IWP-2أنظمة توجيه الخلاياSM39-10
TrypLE (البروتياز المؤتلف)Invitrogen12605-010
Opti-MEM (متوسط مصل مخفض)تقنيات الحياة51985-034
كوفيت التثقيب الكهربائي 2 مم فجوةNepaGeneEC-002S
أنابيب منخفضة الربط 15 ملSigma-AldrichCLS430791
B & uuml; ركر' s غرفةSigma-AldrichBR719520-1EA
NEPA21 Super ElectroporatorNepaGeneجهة اتصال المورد
بروتين LoBind أنابيب منخفضة الارتباطThermo Fisher10708704
BTXpress عازلة التثقيب الكهربائيهارفاردجهاز هارفارد 45-0805
DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد)AppliChemA3672
لمجموعة ؛ http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).">Mali, P., et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  2. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nat Biotech. 32 (3), 267-273 (2014).">Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. -P., Velasco-Herrera, M. D. C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nat Biotech. 32 (3), 267-273 (2014).
  3. A Genome-Wide CRISPR Library for High-Throughput Genetic Screening in Drosophila Cells. J Genet Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).">Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A Genome-Wide CRISPR Library for High-Throughput Genetic Screening in Drosophila Cells. J Genet Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
  4. Molecular mechanisms of paralogous compensation and the robustness of cellular networks. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 322 (7), 488-499 (2014).">Diss, G., Ascencio, D., DeLuna, A., Landry, C. R. Molecular mechanisms of paralogous compensation and the robustness of cellular networks. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 322 (7), 488-499 (2014).
  5. Simultaneous paralogue knockout using a CRISPR-concatemer in mouse small intestinal organoids. Dev Biol. 420 (2), 1-7 (2016).">Andersson-Rolf, A., Merenda, A., Mustata, R. C., Li, T., Dietmann, S., Koo, B. -K. Simultaneous paralogue knockout using a CRISPR-concatemer in mouse small intestinal organoids. Dev Biol. 420 (2), 1-7 (2016).
  6. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).">Ran, F. A., Hsu, P. P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  7. Golden gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS ONE. 4 (5), (2009).">Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS ONE. 4 (5), (2009).
  8. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Sci Rep. 4 (5), 5400(2014).">Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Sci Rep. 4 (5), 5400(2014).
  9. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), 1-11 (2014).">Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), 1-11 (2014).
  10. Multiplex Conditional Mutagenesis Using Transgenic Expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).">Yin, L., et al. Multiplex Conditional Mutagenesis Using Transgenic Expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
  11. CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS Synth Biol. 4 (9), 987-1000 (2015).">Cress, B. F., Toparlak, O. D., et al. CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS Synth Biol. 4 (9), 987-1000 (2015).
  12. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).">Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  13. Automated Sanger dideoxy sequencing reaction protocol. FEBS Letters. 233 (2), 432-436 (1988).">Zimmermann, J., Voss, H., Schwager, C., Stegemann, J., Ansorge, W. Automated Sanger dideoxy sequencing reaction protocol. FEBS Letters. 233 (2), 432-436 (1988).
  14. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nat. Protoc. 10 (10), 1474-1485 (2015).">Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nat. Protoc. 10 (10), 1474-1485 (2015).
  15. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765(2014).">Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR ConcatemerGene KnockoutMouse OrganoidsElectroporationgRNA CloningGolden Gate ShufflingWnt SignalingAxin1 2Rnf43 Znrf3Plasmid Digestion

Related Articles