التقليدية البلازما هلام (سغي) التجارب تتطلب جهاز معقد والاستهلاك الكيميائي عالية. يعرض هذا العمل بروتوكولا يصف طريقة منخفضة التكلفة لفصل شظايا الحمض النووي ضمن إطار زمني قصير.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في الوقت الحقيقي تتبع فصل جزء من الحمض النووي عن طريق الهاتف الذكي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لوح هلام الكهربائي (سغي) هو الأسلوب الأكثر شيوعا لفصل شظايا الحمض النووي. وبالتالي، فإنه يطبق على نطاق واسع في مجال البيولوجيا وغيرها. ومع ذلك، فإن بروتوكول سغي التقليدية مملة جدا، وتستغرق التجربة وقتا طويلا. وعلاوة على ذلك، فإن استهلاك المواد الكيميائية في تجارب سغي عالية جدا. هذا العمل يقترح طريقة بسيطة لفصل شظايا الحمض النووي على أساس رقاقة سغي. يرصد رقاقة بواسطة آلة الحفر. وتستخدم صفائح من البلاستيك لأطوال موجات الإثارة والانبعاث للإشارة البصرية. يتم جمع إشارة مضان من العصابات الحمض النووي عن طريق الهاتف الذكي. للتحقق من صحة هذه الطريقة، تم فصل 50، 100، و 1،000 بب الحمض النووي سلالم. وتظهر النتائج أن سلم الحمض النووي أصغر من 5000 بب يمكن حلها في غضون 12 دقيقة ومع ارتفاع القرار عند استخدام هذه الطريقة، مشيرا إلى أنه هو بديل مثالي لطريقة سغي التقليدية.
المقدمة
هلام الكهربائي بلاطة (سغي) هو الأسلوب الأكثر فعالية ل فصل الحمض النووي جزء 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 وبالتالي فهو يعتبر أداة تنوعا في التحليلات البيوكيميائية والبيولوجية 6 ، 7 ، 8 . ومع ذلك، تشير العديد من التجارب أن سغي مقيدة بالمشاكل الأربعة التالية: (1) عمليات الفصل تستغرق عدة ساعات، وحتى أيام. (2) استهلاك المواد الكيميائية مرتفع جدا. (3) فإنه يتطلب جهاز معقد (على سبيل المثال، 2D الكهربائي الخلية، الكهربائي الكهربائي امدادات الطاقة، ونظام التصوير هلام). (4) نظام التصوير هلام يمكن أن نلاحظ فقط شظايا الحمض النووي فصل عندما يتم الانتهاء من التجربة. وعلاوة على ذلك، إيثيديوم بروميد (إتبر)، والذي يشيع استخدامه في سغي 9 ،أس = "كريف"> 10، هو الطفرات والسرطان 11 ، 12 . وهكذا، يجب دائما أن ترتديه قفازات عند تسليم المواد الهلامية التي تحتوي على إيتبر.
الشعيرات الدموية الكهربائي (سي) لديها العديد من المزايا 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 مقارنة مع سغي، مثل التشغيل التلقائي، وفصل وقت قصير، وانخفاض الاستهلاك. ومع ذلك، فإن أداة سي مكلفة للغاية. لذلك، للتغلب على تلك القيود، وقد تم تطوير نظام ( الشكل 1 ) لفصل الحمض النووي. مثل هذا النظام لا يمكن إلا أن يقلل كثيرا من استهلاك المواد الكيميائية وانقاذ على سغي وقت التجربة (<8 دقيقة)، ولكن يمكن أيضا إجراء تتبع في الوقت الحقيقي من عملية فصل الحمض النووي في هلام الاغاروز عن طريق الهاتف الذكي. باتباع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول، والطلاب شولد تكون قادرة على تصميم وتصنيع رقاقة سغي، وإعداد هلام الاغاروز في رقاقة، وإنشاء نظام سغي بسيط مع الهاتف الذكي، وتسجيل عملية الهجرة الحمض النووي في هلام الاغاروز.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التصميم الأساسي لل سغي رقاقة
- استخدام أي البلاستيك الشفاف، مثل البولي ميثيل ميثاكريلات (بمما) أو البولي.
ملاحظة: ويتجلى رقاقة سغي في الشكل 1B . تتكون رقاقة سغي من ثقوب اسطوانية لعازلة تب، وقنوات فصل الحمض النووي، واثنين من الممرات جزءا لا يتجزأ من الثقوب للقطب. - تصنيع صفائف من قنوات سغي في كتلة بمما باستخدام آلة النقش بالليزر.
ملاحظة: المعلمات الهندسية للرقاقة تعتمد على حجم الحمض النووي لفصلها. على سبيل المثال، المعلمات قناة الأمثل لل رقاقة سغي هي 2.5 مم × 4.0 مم × 90 مم (العرض × عمق x طول) إذا كان جزء من الحمض النووي أصغر من 1000 نقطة أساس. - استنادا إلى تصميم سغي، افتعال أمشاط لخلق الآبار في رقاقة لتحميل عينة الحمض النووي.
2. إعداد جل الاغاروز
- إعداد 0.5 × تب عن طريق خلط 10 × تب (1 × تب =89 ملي تريس، 89 ملي حمض البوريك، و 2 ملي إدتا. ودرجة الحموضة 8.4) والماء المقطر في نسبة 1:19.
- إعداد 1.0٪ هلام الاغاروز لفصل 100-بب الحمض النووي سلالم.
ملاحظة: تركيز الاغاروز في المخزن المؤقت تب 0.5X يعتمد على أحجام شظايا الحمض النووي ليتم فصلها. - وضع 0.1 غرام من الاغاروز في قارورة وإضافة 10 مل من العازلة تب 0.5X.
ملاحظة: يجب أن يكون حجم الحل الذي تم تحضيره أقل من 1/3 من قدرة القارورة. - ختم قارورة مع فيلم الحافظة ومن ثم تسخين الاغاروز / المخزن المؤقت في الميكروويف (المتوسطة، 1.0 دقيقة). قبل وضع القارورة في الميكروويف، وجعل بعض الثقوب في الفيلم الحافظة في حالة حدوث انفجار.
- صب 2.7 مل من حل الاغاروز ذاب في 4 قنوات من رقاقة سغي. وضع مشط في حل الاغاروز لإنشاء الآبار.
ملاحظة: سوف الحل أغاروس ذاب يبرد إلى حالة هلام في درجة حرارة الغرفة 3 دقائق في وقت لاحق. - إزالة المشط من زإلس وإضافة 0.9 مل من العازلة تب 0.5X لتغطية هلام.
3. تشغيل الكهربائي في رقاقة سغي
- بدوره على مصدر ضوء ليد ووضع 425 إلى 505 نانومتر ممر الموجة فوق مصدر الضوء.
- مزيج 14.4 ميكرولتر من سلم الحمض النووي 100 بي بي و 1.6 ميكرولتر من سيبر الخضراء باستخدام فورتيكسر.
- تحميل 4 ميكرولتر من الخليط في كل بئر من هلام الاغاروز في رقاقة سغي ( الشكل 2 ).
- وضع القطب في الممرات اثنين من رقاقة سغي.
- وضع 550 إلى 700 نانومتر ممر الموجة فوق رقاقة سغي.
- قم بتشغيل مصدر الطاقة. ضبط الجهد الكهربائي إلى 180 فولت (20 فولت / سم). بدوره على الهاتف الذكي لتسجيل عملية فصل جزء الحمض النووي ( الشكل 3 ).
- عندما يتم الانتهاء الكهربائي 10 دقيقة في وقت لاحق، إيقاف مصدر الطاقة وضوء ليد.
- تنظيف رقاقة سغي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشكل 4 ، الشكل 5 ، والشكل 6 تمثل نتيجة نموذجية بعد الكهربائي للهلام من 50، 100، و 1،000 السلالم الحمض النووي بب. بعد التجربة، تم فصل شظايا الحمض النووي بشكل جيد. وعلاوة على ذلك، تم فصل نفس العينات في 4 قنوات من رقاقة سغي، والتي تبين أن شظايا الحمض النووي من نفس الحجم تتحرك نفس المسافة في كل تجربة.
ويمكن تقييم أداء فصل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويستخدم على نطاق واسع أغاروس هلام الكهربائي لفصل الحمض النووي، رنا، والبروتين. يقترح هذا العمل طريقة جديدة لتحل محل بروتوكول هلام الكهربائي التقليدية. النتائج تثبت أن 50، 100، و 1000 بب الحمض النووي سلالم يمكن فصلها جيدا في مثل هذا الجهاز تجميعها صغيرة. ميزة كبيرة من هذا الأسلوب هو أنه ليس فقط يمكن فصل الأحماض النووية مع القليل من استهلاك المواد الكيميائية، ولكن يمكن أيضا تسجيل عملية الفصل. على الرغم من أن شظايا الحمض النووي تبدو واسعة في الشكل 2 ، يم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ونحن نقدر الامتنان الدعم من مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (رقم 21205078) وصندوق البحوث لبرنامج الدكتوراه للتعليم العالي في الصين (No.20123120110002). وقد حظي هذا العمل بدعم جزئي من البرنامج الوطني للبحوث والتنمية الرئيسية في الصين (2016YFB1102303)، وبرنامج البحوث الأساسية الوطنية للصين (973Program؛ 2015CB352001)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (61378060).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10 وأقات. TBE | بكين Solarbio للعلوم & التكنولوجيا المحدودة | T1051 | |
| سلم الحمض النووي 50 نقطة أساس | تاكارا بيو إنك. | 3421A | |
| سلم الحمض النووي 100 نقطة أساس | تاكارا بيو إنك. | 3422A | |
| 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي | تاكارا بيو إنك. | 3426 أ | |
| سيبر جرين | تاكارا بيو إنك | 5760A | |
| شركة Agarose | Sigma-Aldrich |
المراجع
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
- Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
