ويصف هذه المخطوطة في المختبر ovule زراعة أسلوب يتيح تصوير خلية يعيش نبات زيجوتيس والأجنة. ويستخدم هذا الأسلوب لتصور ديناميات داخل الخلايا أثناء الاستقطاب الزيجوت وتحديد مصير الخلية في وضع الأجنة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في معظم النباتات المزهرة، الزيجوت والجنين مخفية في أعماق نسيج الأم، وهكذا منذ فترة طويلة كان لغزا لكيف تتطور بشكل حيوي؛ على سبيل المثال، كيف اقحه نمطين لإنشاء محور الجسم وكيف يحدد الجنين مصائر خلية مختلفة أثناء تكوين الجهاز. ويصف هذه المخطوطة في المختبر ovule ثقافة أسلوب القيام بتصوير خلية يعيش وضع zygotes والأجنة من نبات التمويل. المتوسط زراعة محسنة يسمح zygotes أو الأجنة في وقت مبكر أن تنمو لتصبح نباتات خصبة. عن طريق الجمع بين ذلك مع جهاز صفيف ميكروبيلار poly(dimethylsiloxane) (PDMS)، يعقد في ovule في المتوسطة السائل في نفس الموضع. هذا التثبيت أمر حاسم لمراقبة ovule نفسه تحت مجهر لعدة أيام من شعبة زيجوتيك إلى أواخر مرحلة الجنين. يمكن استخدام التصوير تعيش الخلية الناتجة لرصد ديناميات الاستقطاب الزيجوت، مثل الهجرة النووية وإعادة ترتيب سيتوسكيليتون، وأيضا توقيت انقسام الخلايا ومواصفات مصير الخلية أثناء الزخرفة الجنين في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، يمكن دمج هذا النظام زراعة ovule مع العلاجات مثبط لتحليل آثار العوامل المختلفة على وضع الجنين والتلاعبات البصرية مثل انقطاع الليزر لدراسة دور خلية خلية الاتصال.
المقدمة
خطة الهيئة الأساسية للكائن الحي يتطور من اقحه أحادي الخلية. في معظم النباتات المزهرة، يولد شعبة زيجوتيك قمي وخلية القاعدية، التي تتطور إلى تبادل لإطلاق النار والجذر، على التوالي1. ولذلك، من المهم أن نفهم كيف يتم تشكيل هيئة النبات أثناء امبريوجينيسيس، ولكن لم يكن هناك أداة فعالة لمراقبة ديناميات zygotes الحية والأجنة مباشرة نظراً لتطورها في أعماق الزهرة. في العديد من أنواع مونوكوت، مثل الذرة والأرز، وأسلوب إخصاب في الأنابيب قد المنشأة2،3. في هذا الأسلوب، عزل الحيوانات المنوية والخلايا البيض تنصهر فيها كهربائياً أو كيميائيا، والخلية التي تم إنشاؤها يمكن أن تتطور إلى مصنع خصبة. وم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد من "مستنبت Ovule في المختبر"
- جعل الوسط السائل لثقافة أوفولي في المختبر (" المتوسطة N5T ") الذي يحتوي على 1 x Nitsch القاعدية الملح المخلوط، 5% (w/v) تريهالوسي ثنائي هيدرات، 0.05 % (w/v) 2-(ن-morpholino) حمض اثانيسولفونيك (مس)-كوه (5.8 درجة الحموضة)، و 1 x Gamborg ' حل فيتامين s-
- ضبط درجة الحموضة إلى 5.8 مع كوه.
- تعقيم المتوسطة بالتعقيم (121 درجة مئوية، 20 دقيقة)، أو التصفية فإنه من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: يمكن تخزين متوسطة معقمة عند 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أشهر.
2. إعداد الجهاز الصفيف ميكروبيلار PDMS
- قطع الجهاز ميكروبيلار PDMS سكين أو ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام هذا النظام زراعة ovule، يمكن تتبع هذا الأسلوب المعيشة ديناميات الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين. وهذا يعد إنجازا لأنه كانت هناك لا تقنية لتصور في الوقت الحقيقي سلوك الزيجوت والأجنة، التي كانت مخبأة في عمق النسيج الأم. الشكل 3 ألف و التكميلي فيديو 1 تبين أن تتراكم microtubules (MTs) في اقحه الشباب كحلقة عرضية في منطقة سوبابيكال10. ويحتفظ هذا الخاتم مليون طن بينما اقحه الغضروفي في اتجاه قمي. بعد الانتهاء من است.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويدخل هذه المخطوطة بسيطة في المختبر ovule زراعة بروتوكول فعال للاستخدام في تصوير خلية يعيش وضع zygotes والأجنة.
قد تحتاج إلى تصميم الجهاز PDMS الأمثل وفقا لمرحلة الجنين. كان الجهاز المتقدمة أول مجموعة ميكروكاجي لضبط الاتجاه وتحديد الموقف من البويضات9، وثم تم بناء جهاز ميكروبيلار فخ البويضات أكثر كفاءة8. وعلاوة على ذلك، ميكروبيلارس أرق وأخف من ميكروكاجي، وبالتالي لا تمنع التوسع ovule أثناء المراقبة الطويلة الأجل. يمكن أن تعقد هذا الجهاز م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
أجريت في المعهد من تحويلي بيو-الجزيئات (WPI-إيتبم) من جامعة ناغويا مجهرية في هذا العمل وتدعمه "شبكة العلوم النباتية المتقدمة اليابان". هذا العمل كان تدعمها المنح من اليابان وكالة العلوم والتكنولوجيا (مشروع ايراتو T.H. وم) ومن "الجمعية اليابانية" "تعزيز العلوم": معونات "البحث العلمي" في "مجالات مبتكرة" (غ. JP24113514، JP26113710، JP15H05962، و JP15H05955 م، ونص. JP16H06465 و JP16H06464 و JP16K21727 ل T.H)، معونات للعلماء الشباب (ب، غ. JP24770045 و JP26840093 م)، ومعونات "البحوث الاستكشافية" الصعبة (رقم JP16K14753 عن م).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| خليط الملح القاعدي Nitsch | Duchefa | N0223 | |
| تريهالوز ثنائي هيدرات | واكو بيور كيميكال | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg ' محلول فيتامين | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| طبق زجاجي 35 مم | ماتسونامي D111300 | ||
| زجاج 35 مم طبق ثقافة | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 & 26 مم زجاج منزلق | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 & مرات 18 مم زجاج | منزلق إبرة C018181 | ||
| (مقياس 0.40 مم) | Terumo | NN-2719S | |
| غمر متوسط Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | نيكون | A1RsiMP (1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | يوكوجاوا الكهربائية | إنها معدات مخصصة ، وبالتالي فإن رقم الكتالوج غير متاح. | |
| CV1000 | يوكوجاوا الكهربائية | CV1000-SP84 |
المراجع
- Natesh, S., Rau, M. A. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994). ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
