Method Article

ميكروتيسويس 3D للعلاج عن طريق الحقن بالتجدد وفحص المخدرات الفائق

DOI:

10.3791/55982

⸱

October 4th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول تلفيق ميكروكريوجيلس ماكروبوروس 3D مطاطا من خلال دمج ميكروفابريكيشن مع تكنولوجيا كريوجيلاتيون. عند تحميل مع الخلايا، يتم إنشاء ميكروتيسويس 3D، الذي يمكن أن يسهل حقن فيفو في تيسير العلاج التجديدي أو تجميعها في صفائف لفحص المخدرات الفائق في المختبر .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لترقية الثقافة التقليدية 2D خلية إلى خلية 3D ثقافة، أدمجنا ميكروفابريكيشن مع تكنولوجيا كريوجيلاتيون لإنتاج ماكروبوروس microscale كريوجيلس (ميكروكريوجيلس)، التي يمكن تحميلها مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا لتشكيل ميكروتيسويس ثلاثي الأبعاد. وهنا، نقدم البروتوكول اختﻻق ميكروتيسويس ثلاثية الأبعاد متعددة الاستخدامات والتطبيقات الخاصة بهم في العلاج بالتجدد وفحص المخدرات. الحجم والشكل يمكن السيطرة عليها ميكروكريوجيلس يمكن أن تكون ملفقة في صفيف رقاقة إلكترونية، التي يمكن حصادها قبالة رقاقة كناقلات تحميل الخلية الفردية للعلاج عن طريق الحقن بالتجدد أو تكون زيادة مجمعة على شريحة في صفائف ميكروتيسوي 3D للفائق فحص المخدرات. نظراً لطبيعة هذه كريوجيلس microscale مرونة عالية، يحمل ميكروتيسويس 3D إينجيكتابيليتي كبيرة للعلاج مينيملي الخلية عن طريق حماية الخلايا من قوة القص الميكانيكية أثناء الحقن. وهذا يضمن بقاء الخلية المحسنة والتأثير العلاجي في طراز الاسكيمية أطرافهم الماوس. وفي الوقت نفسه، يسهل الجمعية صفائف ميكروتيسوي ثلاثية الأبعاد في شكل موحد 384-multi-كذلك استخدام مرافق المختبرات المشتركة والمعدات، تمكين المخدرات الفائق الفرز على هذا النظام الأساسي في ثقافة الخلية 3D تنوعاً.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن الحصول الخلية التقليدية والثقافة على مسطح ثنائي الأبعاد (2D) السطوح، مثل طبق ثقافة أو لوحات متعددة جيدا، لا يكاد السلوكيات خلية قريبة من دولهم الأصلية. خلاصة دقيقة من ميكرونفيرونمينتس الخلوية الأصلية، التي تشمل مختلف أنواع الخلايا ومصفوفات خارج الخلية النشطة بيولوجيا العوامل القابلة للذوبان في أبنية ثلاثية الأبعاد (3D)1،2،3 ،4، أمر أساسي لبناء بيوميميكينج الأنسجة في المختبر للتطبيقات في الطب التجديدي، وهندسة الأنسجة، البيولوجيا الأساسية للبحث والمخدرات اكتشاف5،6،7 ،،من89.

بدلاً من ثقافة الخلية 2D، ثقافة الخلية 3D يستخدم على نطاق واسع للنهوض بالمحاكاة البيولوجية الجزئية المعمارية والسمات الوظيفية للخلايا المزروعة في المختبر. أسلوب ثقافة شعبية 3D خلية إلى خلايا الكلية إلى الماغنيسيوم7،،من89،10. يمكن حقن الماغنيسيوم الخلوية للأنسجة المصابين مع الاحتفاظ الخلوية المحسنة والبقاء على قيد الحياة بالمقارنة مع حقن الخلايا المتفرقة. ومع ذلك، أحجام كروي غير موحدة والإصابات الميكانيكية حتمية تفرضها قوة القص السوائل في الخلايا أثناء الحقن يؤدي إلى خلية الفقراء الآثار العلاجية11،،من1213. وبالمثل، جعلت الأصيل غير التماثل أثناء تجميع الماغنيسيوم ترجمتها إلى 3D يستند إلى الخلية الفائق المخدرات فحص التحدي10.

أسلوب آخر لثقافة خلية ثلاثية الأبعاد تحقق مع تقديم المساعدة الحيوية، التي عادة ما تقوم بتغليف الخلايا في الهلاميات المائية مائي أو السقالات المليئة بالثغرات. أنه يسمح بمرونة أكبر في تشييد أبنية ثلاثية الأبعاد. للعلاج، وعادة ما يتم تسليم الخلايا مغلفة في السقالات الجزء الأكبر إلى جسم الحيوان عن طريق غرس الجراحية، والغازية والصدمة، ومن ثم تقيد ترجمة واسعة للسرير. من ناحية أخرى، تمكن الهلاميات المائية المائية العلاج مينيملي عن طريق حقن الخلايا التي علقت في حل السلائف المائية إلى الهيئات الحيوانية، مما يسمح جيلاتيون في الموقع عن طريق-الحرارية، الكيميائية أو الانزيمية كروسلينكينج11. ومع ذلك، كما يتم تسليم الخلايا بينما السلائف المائية لا تزال في حالة مائي، كما تعرضوا للقص الميكانيكية أثناء الحقن. ليس ذلك فقط، يمكن أن تفرض crosslinking الكيميائية أو الانزيمية أثناء جيليشن في الموقع من المائية أيضا الضرر للخلايا داخل. لفحص المخدرات، وثقافات ساعدت مادة بيولوجية الخلية تواجه مشاكل مع الاتساق وقابلية التحكم والإنتاجية. استخدام الهلاميات المائية، الخلايا عادة ما تشارك خلال جيليشن، التي قد تؤثر على العملية بقاء الخلية ووظيفتها. جيليشن خلال بذر الخلية كما يعوق استخدام معظم المعدات الفائق، منذ المائية قد تحتاج إلى أن تبقى على الجليد لمنع جيليشن قبل الخلية البذر، وربما جام المائية الاستغناء عن النصائح، وعادة ما تكون ضعيفة للغاية لضمان الدقة الفرز الفائق. يمكن فصل السقالات شكلت قبل يحتمل أن تكون إجراءات تصنيع مادة بيولوجية من الثقافة الخلية، ولكن معظم المنتجات المستندة إلى سقالة متاحة كالمواد السائبة مع أقل نسبيا من الناتج14.

للتغلب على بعض أوجه قصور أساليب 3D الثقافة الحالية، قمنا بتطوير تكنولوجيا ميكروفابريكيشن-كريوجيلاتيون المتكاملة لاختلاق رقاقة صفيف ميكروكريوجيل الجاهزة للاستخدام وسهلة الاستخدام15. في هذا البروتوكول، ويتم تحديد الجيلاتين لتجسيد تقنية تصنيع ميكروكريوجيل كما متوافق حيويا، والقابلة للتحلل، وفعالة من حيث التكلفة، وأي تعديل آخر مطلوب لمرفق خلية. يمكن أيضا استخدام البوليمرات الأخرى من المصادر الطبيعية أو الاصطناعية للتصنيع، استناداً إلى التطبيق. عن طريق هذه التكنولوجيا، ونحن اختﻻق ميكروكريوجيلس المنمنمة ومرونة عالية مع حجم يمكن السيطرة عليها، والشكل والتخطيط. عند تحميل مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، ويمكن تشكيل ميكروتيسويس 3D لمختلف التطبيقات. تمكين هذه الميزات الفريدة إينجيكتابيليتي المرجوة وحماية الخلايا والاحتفاظ بموقع الموجه بعد الحقن في فيفو لتعزيز الآثار العلاجية. ليس ذلك فقط، يمكن معالجتها في ميكروكريوجيلس كذلك لتشكيل المصفوفات ميكروتيسوي 3D متوافقة مع معدات المختبرات المشتركة وأدوات لتحقيق ثقافة الخلية الفائق للكشف عن المخدرات تنوعاً وفحوصات الخلوية الأخرى. هنا، نحن التفصيل عملية تصنيع ميكروكريوجيلس وما بعد المعالجة ميكروتيسويس ثلاثي الأبعاد الفردية أو صفائف ميكروتيسوي ثلاثي الأبعاد لاثنين من التطبيقات الهامة وخلية العلاج وفحص المخدرات، على التوالي10،15 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التجارب على الحيوانات يتبع صارمة بروتوكول أقرته "لجنة أخلاقيات الحيوان" في مركز التحليل البيولوجية الطبية، جامعة تسينغهوا. إطار موافقة "لجنة الأخلاقيات"، الأنسجة الدهنية البشرية تم الحصول عليها من "قسم للجراحة التجميلية لبكين الاتحاد المستشفى" بموافقة مستنيرة من المرضى-

1-تلفيق 3D ميكروكريوجيلس

  1. ، تصميم وتصنيع رقائق الصفيف ميكروستينسيل
    1. استخدام برمجيات تجارية لتصميم صفائف من الهندسات محددة، مثل الدوائر والأشكال البيضاوية، ومثلثات أو البرسيم 14، تبعاً للطلب اللاحق.
      ملاحظة: تشير إلى المادة 2 من البروتوكول للطب التجديدي، والمادة 3 بروتوكول لفحص المخدرات للحصول على تفاصيل التصميم.
    2. استيراد التصميم الليزر النقش البرمجيات المصاحبة لالة النقش الليزر. باستخدام إعدادات الليزر وفقا لتوصيات مصنع لالة النقش الليزر، الليزر-نقش تصميم المستوردة إلى بولي (ميثيميثاكريلاتي) (البولي ميثيل ميثا اكريلات) أوراق.
    3. تغسل رقائق ميكروستينسيل الصفيف مع المياه لتنظيف الحطام من النقش الليزر. الجافة الصفيف ميكروستينسيل الرقائق في 60 ° C. مخزن في حقيبة مختومة في درجة حرارة الغرفة لمدة أشهر.
  2. تصنيع رقائق الصفيف ميكروكريوجيل
    1. ميكروستينسيل 4 مكان مجموعة رقائق على علبة عينة وإدراج في البلازما أنظف. أغلق باب نظافة وتشغيل مضخة فراغ لمدة 2 دقيقة، ثم تشغيل الطاقة الترددات اللاسلكية كحد أقصى (18 ث) لعلاج رقائق الصفيف ميكروستينسيل في البلازما أنظف ل 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لزيادة هيدروفيليسيتي-
      2. منزوع
    2. الجيلاتين ز 0.06 إضافة إلى 1 مل من الماء لتشكل 6% (wt/المجلد) الجيلاتين السلائف الحل (ما يكفي لجعل رقائق 5). الحارة في 60 درجة مئوية في حمام مائي إلى أن يحل على نحو كاف. تبني على الجليد للحد الأدنى 5
    3. إضافة 3 ميليلتر من جلوتارالديهيدي إلى حل السلائف الجيلاتين بتركيز 0.3% نهائي. مزيج دقيق.
    4. ماصة 200 ميليلتر السلائف الحل مع جلوتارالديهيدي على السطح العلوي للرقاقة الصفيف ميكروستينسيل.
      ملاحظة: 200 ميليلتر كاف لشريحة 75 مم × 25 مم بغض النظر عن التصميم. زيادة مقدار التناسب عندما يتم زيادة المساحة السطحية لرقاقة.
    5. يدوياً بتوزيع الحل بالتساوي على الرقاقة بإلغاء الخلفي والمنصوص عليها بقضيب زجاج عازمة 2 إلى 3 مرات.
      ملاحظة: يمكن ملء كل الصغرى-جيدا على رقاقة ميكروستينسيل مع الحل السلائف نظراً لطبيعتها ماء بعد المعالجة بالبلازما.
    6. فورا بوضع رقاقة السلائف-الحل-ملء صفيف في ثلاجة-20 درجة مئوية ح 16 عن كريوجيليشن-
    7. ضبط ليوفيليزير إلى-40 درجة مئوية للحد الأدنى 30 مكان رقائق الصفيف بعد كريوجيليشن في ليوفيليزير وليوفيليزي رقائق الصفيف ح 2 في فراغ.
      ملاحظة: ميكروكريوجيلس الجيلاتين مع ماكروبوريس مترابطة يتم تشكيلها لأن الجليد الذي تشكل خلال سوبليميس كريوجيليشن في ليوفيليزير.
    8. انتقل إلى الباب 2 لعلاج الاسكيمية الحرجة أطرافهم (CLI) والباب 3 لفحص المخدرات الفائق.

2. حصاد "ميكروكريوجيلس الفردية" إلى ميكروتيسويس 3D "النماذج القابلة للحقن" لعلاج CLI

  1. ميكروكريوجيلس الفردية حصاد
    1. تصميم صفائف (75 مم × 25 مم) 600 الدوائر، وكل منها 400 ميكرون القطر، في البرمجيات التجارية للبناء ميكروتيسوي 3D القابلة للحقن. استخدام البولي ميثيل ميثا اكريلات من 300 ميكرون سمك لتصنيع الرقائق الصفيف ميكروستينسيل مفصلة في الفرع 1-1-
    2. تلفيق ميكروكريوجيل صفيف رقائق كما في القسم 1.2.
    3. تلفيق مجموعة PDMS القاذف Pin مع نفس التصميم كما هو الحال في خطوة 2.1.1 من الطباعة الحجرية الناعمة القياسية 16 ، 17-
    4. تراكب رقاقة مجموعة ميكروكريوجيل على رأس الصفيف PDMS القاذف Pin، محاذاة كل ميكروكريوجيل مع دبوس قاذف في الصفيف. اضغط على رقاقة الصفيف ميكروكريوجيل نحو الصفيف دبوس القاذف لدفع ميكروكريوجيلس من أصل ميكروويلس بدبابيس بارزة في الصفيف دبوس PDMS القاذف لحصاد ميكروكريوجيلس الفردية.
    5. الحصاد في ميكروكريوجيل في المياه وجمعها مع معونة مصافي الخلية. استخدام مصفاة واحدة لجمع ميكروكريوجيلس من شريحة واحدة (أي، ميكروكريوجيلس 600)-
    6. ميكروكريوجيلس الغسيل مع نأبه 0.1 م 4 على الجليد لمدة 20 دقيقة إخماد أي بقايا ألدهيد uncross-مرتبط. استخدم 5 مل من 0.1 متر نأبه 4 لكل شريحة. تجاهل نأبه 4 وتغسل مع منزوع 5 مل من الماء لمدة 15 دقيقة من 3 إلى 5 مرات، في كل مرة.
    7. تجاهل المياه من مصفاة الخلية وجمع ميكروكريوجيلس في مجموعة واحدة كل مصفاة الخلية ووضع كتلة واحدة في طبق بتري 35 ملم واحد استخدام الملاقط منحنى. إضافة 50-70 ميليلتر منزوع الماء لكل مجموعة وتغطي غطاء طبق بيتري. اضغط برفق طبق بيتري على الطاولة إلى مستوى من جميع ميكروكريوجيلس، حيث أن ميكروكريوجيلس لا يكذبون على رأس ميكروكريوجيل أخرى لتشكيل المونولاير ميكروكريوجيلس على سطح طبق بيتري.
      8. تجميد
    8. ميكروكريوجيلس المقطوع في-20 درجة مئوية ح 4 إلى 16 قبل ليوفيليزينج منهم 2 ح (راجع الخطوة 1.2.7). تخزين ميكروكريوجيلس في فراغ في درجة حرارة الغرفة حتى استخدامها مرة أخرى.
  2. وصف ميكروكريوجيلس
    1. تقييم المسام ميكروكريوجيلس عن طريق فحص التصوير بالمجهر الإلكتروني (SEM).
      1. إيموبيليزي ميكروكريوجيلس المقطوع والمجففة بالتبريد على حامل عينة بالشريط اللاصق المزدوج الجانب ومعطف مع الذهب المغطى الرش ل 90 ثانية، قبل التصوير بواسطة SEM 11. تقييم وتحليل توزيع لأقطار مسام في ميكروكريوجيل من سبع صور SEM مختلفة باستخدام برنامج تحليل الصور-
    2. تزن كتلة واحدة من 600 ميكروكريوجيلس المجففة بالتبريد في طبق بتري 35 ملم الوزن الجيلاتين المجففة ميكروكريوجيلس (GMs). إضافة 60 ميليلتر منزوع الماء إلى مجموعة ميكروكريوجيلس المجففة بالتبريد، وانتظر لمدة 30 ثانية ميكروكريوجيلس بالكامل امتصاص المياه والانتفاخ. وزن ميكروكريوجيلس منتفخة. نسبة تضخم
      1. تحديد التوازن والمساميه ميكروكريوجيلس، كالنسبة الوزن من تورم ميكروكريوجيلس ميكروكريوجيلس الجيلاتين المجففة ونسبة الوزن للمياه الذي عقد في ميكروكريوجيلس ميكروكريوجيلس رطب، على التوالي 13-
    3. إينجيكتابيليتي قدر من ميكروكريوجيلس باستخدام مضخة حقنه لبرمجة المتكاملة مع قوة رقمية قياس 14.
      1. وصمة عار 600 قطعة من ميكروكريوجيلس تريبان الأزرق وتعليق في 600 ميليلتر 15% جيلاتين الحل لتحقيق توزيع متجانس. تحميل 1 مل ميكروكريوجيل تعليق في حقنه 1 مل. حقن الخليط من خلال إبرة 27-قياس تعلق بحقنه 1 مل باستخدام مضخة الحقن لبرمجة في معدل التدفق من 1 مل/دقيقة
      2. الحقن في الوقت الحقيقي رصد القوة بالقوة الرقمية قياس الاختبار وارسم منحنى القوة-الزمن. بعد الحقن، مراقبة سلامة ميكروكريوجيلس تحت مجهر.
        ملاحظة: منطقة الميكونج الكبرى معلقة في محلول الجيلاتين 15% (wt/المجلد) يمكن بسلاسة حقن وبقيت سليمة بعد حقن.
    4. تميز التحلل ميكروكريوجيلس.
      1. أولاً، قياس وزن كتلة واحدة من 600 ميكروكريوجيلس المجففة بالتبريد في طبق بتري 35 ملم كوزن جاف. ثم تزج 600 ميكروكريوجيلس المجففة بالتبريد في 2 مل 0.025% (المجلد/المجلد) التربسين/يدتا-
        2. ميكروكريوجيلس
      2. جمع من الحل باستخدام مصفاة خلية عند نقاط زمنية مختلفة (أي، 10، 20، 30، 40، 50 و 60 و 70 دقيقة). الحل الفتيل الزائد بعيداً مع أنسجة. قياس وزن ميكروكريوجيلس في نقاط زمنية مختلفة وحساب درجة التدهور، كالنسبة وزن ميكروكريوجيل عند نقطة معينة وقت لمن ميكروكريوجيل في الساعة صفر-
  3. Autoloading الخلايا في ميكروكريوجيلس لنموذج ثلاثي الأبعاد ميكروتيسويس
    1. تعقيم ميكروكريوجيلس من الخطوة 2.1.8 بنظام التعقيم أكسيد الإيثيلين مع التعرض لغاز 12 h تليها ح 12 ولﻵﻻت تحت فولت تيار مترددالعراقية هذه.
      2. اختر
    2. البشرية المستمدة من الدهنية stromal الخلايا الوسيطة (همسكس) لتلقي علاج اللكتات الدماغية الماوس. عزل الخلايا بالإجراءات التالية كما سبق ذكره 18-
      3. متوسطة
    3. همسكس الثقافة في النمو الذي يحتوي على 2% مصل بقرى الجنين (FBS)، 10 نانوغرام/مل عامل النمو المشتقة من الصفيحات bb (PDGF-bb)، 1 X الأنسولين ترانسفيرين السيلينيوم (البحث عن) الديكساميتازون -8 م 10، 10، 10 عامل نمو البشرة من نانوغرام/مليلتر (لو) -4 م حمض الأسكوربيك 2-الفوسفات والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين في DMEM/F12. مرور الخلايا في نسبة 1:3 عندما المتلاقية. استخدام خلايا سن 3 إلى 5 في التجارب التالية.
    4. حصاد همسكس مع التربسين والتحديد الكمي لعدد الخلايا باستخدام دائرة عد فوخس-روزنتال وريسوسبيند بكثافة 8 × 10 6 خلايا/مل في المتوسطة النمو همسكس.
    5. ماصة 60 ميليلتر همسكس تعليق على أحادي الطبقة من 600 ميكروكريوجيلس مع قطر 400 ميكرون في طبق 35 ملم من الفرع 2-1. يتم امتصاص الخلايا تلقائياً في مسامية الصغرى-هياكل ميكروكريوجيلس-
    6. المحافظة على في دائرة هوميديفيد واحتضان في 37 درجة مئوية ح 2 السماح بإرفاق الخلايا. بعد 2 ساعة حضانة، إضافة 2 مل الثقافة المتوسطة. تغيير في المتوسط كل يومين. الثقافة محملة همسكس ميكروكريوجيلس لمدة يومين لتشكيل 3D ميكروتيسويس-
    7. بعد 2 أيام استزراع، "الماصة؛" ميكروكريوجيلس همسكس-تحميل 100 كل بئر على لوحة 96-جيدا، وإضافة ميليلتر 120 ريسازورين العامل الحل أعد وفقا للشركة المصنعة ' s تعليمات إلى كل بئر. احتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية. الأسفار
      1. كشف من ريسازورين استقلاب خلايا قابلة للحياة في قارئ ميكروسكوبية مع الطول موجي ضوء إثارة من 560 نانومتر وانبعاث الضوء الطول الموجي 590 نانومتر. إنشاء منحنى قياسي من عدد الخلايا مقابل الأسفار باستخدام همسكس أن اقحم عدد الخلايا من شدة الأسفار للتجربة المقبلة وفقا لبروتوكول مجموعة 13-
    8. تقييم عدد من همسكس في ميكروكريوجيلس من اليوم 0 يوم 4 باستخدام ريسازورين كما هو موضح في الخطوة 2.3.7 من اليوم 0 يوم 4-
    9. وصمة عار الخلايا في ميكروكريوجيلس مع تمييع 1: 500 من كالسين صباحا وتمييع 1: 250 من يوديد Propidium (المعروف تلطيخ يعيش الميت) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ومراقبة تحت مجهر الأسفار أو مجهر الأسفار [كنفوكل]-
  4. حقن ميكروتيسويس 3D في فيفو للعلاج من المبادرة القطرية في طراز الماوس
    1. إنشاء اللكتات الحرجة الاسكيمية من الإناث بالب/ج الفئران عارية كما ذكرت 11 ، 19 لتحديد التأثير العلاجي 3D العلاج القائم على ميكروتيسوي-
    2. نقل ميكروتيسويس من الخطوة 2.3.6 استخدام ماصة 5 مل إلى مصفاة خلية وتصفية بعيداً في مستنبت.
    3. ريسوسبيند ميكروتيسويس 3D تحميل همسكس في الحل الجيلاتين 15%، في كثافة 100 ميكروكريوجيلس الواحد 100 ميليلتر الحل.
    4. قبل الجراحة، وتعقيم الأدوات الجراحية اﻷوتوكﻻف وإجراء عمليات جراحية في غرفة العمليات في مركز مرفق الحيوان لحيوان.
    5. ضع الماوس في قاعة تحريض التخدير التي تحتوي على إيسوفلوراني 1-3% في الأكسجين 100% بمعدل 1 لتر/دقيقة تطبيق الاريثروميسين في عيون الماوس لمنع تجفيف تدفق. من خلال شق جلد طوله 1 سم، سد شريان فخذي وفروعها مع خيوط الحرير 5-10 والمكوس 19-
      6. حقن
    6. إدخال إيندوسيانيني الخضراء (ICG) (0.1 مل من 100 ميكروغرام/مل) عن طريق الوريد الذيل لمراقبة تدفق الدم. القيام بتصوير fluorescence ICG الأسفار نظام التصوير باستخدام (هنا، نظام محلي الصنع) في هندسة الانعكاس 11-
    7. ميكروتيسويس حقن العضل ثلاثة مواقع للعضلات مرهف حول شق الشريان باستخدام حقنه 1 مل بإبرة عيار 23-
    8. بعد عملية جراحية، الدفء الماوس مع وسادة ساخنة في قفص الانتعاش. حقن تحت الجلد ميلوكسيكام تخفيف الألم، وترصد باستمرار حتى مستيقظا.
    9. بعد 28 يوما، رصد الفعالية العلاجية من أطرافهم تعامل ميكروتيسوي 3D بالأسفار التصوير 11-
      ملاحظة: حقن تحت الجلد ميلوكسيكام لتخفيف الألم عند الماوس بينت بتر عفوية.
    10. الفئران يوثانيزي مع ثاني أكسيد الكربون بعد انتهاء تجارب-
      ملاحظة: هنا، القتل الرحيم مع ثاني أكسيد الكربون وأجرى وفقا للبروتوكول الصارم أقرته "لجنة أخلاقيات الحيوان" في مركز التحليل البيولوجية الطبية، جامعة تسينغهوا.

3. الجمعية ميكروتيسوي صفيف شريحة "فحص المخدرات" الفائق

  1. الجمعية العامة لمجموعة ميكروكريوجيل لثقافة الخلية على شريحة
    1. تعديل التصميم في القسم 1-1 وفقا لإبعاد لوحة متعددة كذلك التقليدية، أي، لتنسيق 384-متعددة--حسنا، تصميم مجموعة من 16 × 24 بئرا (صف من العمود)، كل من تباعد مركز إلى مركز 4.5 مم وقطرها 2 مم-
    2. ليزر نقش على ورقة البولي ميثيل ميثا اكريلات 500 ميكرومتر سميكة كما هو موضح في القسم 1-1-
      3. ميكروكريوجيلس
    3. فابريكاتي كما هو موضح في القسم 1-2 استخدام رقاقة الصفيف 384-multi-كذلك تم الحصول عليها من الخطوة 3.1.2. هذا الصفيف الذي يحتوي على ميكروكريوجيل تم تعيينه كرقاقة الصفيف ميكروكريوجيل.
    4. تغسل الرقاقة الصفيف ميكروكريوجيل مع 50 مل م 0.1 نأبه 4 لإخماد أي ألدهيد المتبقية uncross-المرتبطة، ثم مرارا وتكرارا شطف بماء منزوع 50 مل ح 2 3 مرات، لكل الوقت.
    5. تجاهل الماء، تجميد رقاقة مجموعة ميكروكريوجيل في-20 درجة مئوية ح 4 إلى 16 قبل ليوفيليزينج وفقا للخطوة 1.2.7-
    6. الآبار تعديل 384-multi-البئر في خطوة 3.1.1 تصميم الصفيف تحتوي على 16 × 24، كل من تباعد مركز إلى مركز 4.5 مم وقطرها 3 مم-
      7. إزالة أحد جانبي بمساندة من ورقة رقيقة جداً (10 ميكرون) متوافق حيويا على الوجهين شريط لاصق
    7. ولصقها على جانب واحد من قطعة من ورقة البولي ميثيل ميثا اكريلات 3-مم-سميكة. ليزر نقش التصميم من الخطوة 3.1.4 هذا ورقة البولي ميثيل ميثا اكريلات 3-مم-سميكة ووفقا للفرع 1-1. عينت هذا الصفيف الصفيف الخزان.
    8. محاذاة الصفيف ميكروكريوجيل رقاقة مع رقاقة الصفيف الخزان والالتزام معا محكم لتجميع رقاقة صفيف 3D ميكروكريوجيل لثقافة الخلية على شريحة. تعقيم بالإشعاع فوق البنفسجي على حاء 1
    9. رقائق تخزين الصفيف ميكروكريوجيل 3D في فراغ في درجة حرارة الغرفة لإجراء المزيد من التجارب.
  2. فحص المخدرات على صفائف ميكروتيسوي 3D
    1. ملء مربع رطب مع الماء المتأين دي عقيمة 25 مل لتكون بمثابة غرفة رطوبة لثقافة الخلية. قبل الحرارة في 5% هوميديفيد CO 2 حاضنة إلى 37 درجة مئوية.
    2. حصاد خلايا سرطان الرئة الخلية الصغيرة غير (NCI-H460) وسرطانه الخلية الكبدية الخلايا (HepG2) من لوحات زراعة الأنسجة وفقا لبروتوكول قياسي وإعادة تعليق في ثقافة وسائل الإعلام بكثافة نهائية 1.0 × 10 6 خلايا/مل. مزيج دقيق.
      ملاحظة: يتم استخدام RPM1640 مع 10% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل ل NCI-H460. استخدام دميم مع 10% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل ل HepG2-
    3. إزالة الدائرة الرطوبة من الحاضنة. استخدام الملقط لرقاقة الصفيف ميكروكريوجيل مكان 3D تجميعها بعناية من الخطوة 3.1.9 في قاعة الرطوبة. أخذ الحيطة والحذر ليس الرطب ميكروكريوجيلس مع الماء في الدائرة-
    4. ميكس تعليق خلية جيدا، ثم الكوة ميليلتر 3 من تعليق خلية مباشرة على ميكروكريوجيل في كل بئر-
      ملاحظة: نصيحة ماصة ينبغي طفيفة لمس سطح ميكروكريوجيل قبل طرد تعليق خلية. خلايا يتم تحميلها تلقائياً في ميكروكريوجيل بامتصاص. لا البذور الخلايا في الآبار الهامشية.
    5. إضافة 10 ميكروليتر من وسائل الإعلام لكل بئر بعد الخلايا هي تبذر في ميكروكريوجيل باستخدام ماصة متعددة القنوات، مثل معالج 96-قناة سائل. المتوسطة أيضا إضافة إلى الآبار الهامشية.
      ملاحظة: RPM1640 استخدام الوسائط مع 10% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسيn للخلايا H460. استخدام الوسائط دميم مع 10% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل للخلايا HepaG2-
    6. رقاقة الثقافة الصفيف تحميل الخلية ميكروكريوجيل في غرفة 24 ساعة في هوميديفيد 5% رطوبة CO 2 حاضنة في 37 درجة مئوية لنموذج صفيف 3D ميكروتيسوي-
      7. ميتوتريكسات
    7. حل و إيملج-8439 9 في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) أن يشكل حلاً أسهم من 10 ملم. تمييع المخدرات مع الثقافة المتوسطة شكل تدرج تركيز تمييع الوقت من 2 نانومتر إلى 200 مليميكرون.
      8. إضافة 10 ميليلتر من حلول المخدرات إلى كل
    8. بشكل جيد. استخدام [دمس] 0.1% (مخففة في المتوسط) كعنصر التحكم. احتضان الصفيف ميكروتيسوي 3D تحميل المخدرات في 5% هوميديفيد CO 2 حاضنة في 37 درجة مئوية ل 24 h.
    9. ميليلتر 4 إضافة إلى حل ريسازورين الأسهم لكل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية حاء 2 مكان 3D ميكروتيسوي الصفيف في القارئ الميكروسكوبية وكشف الأسفار ريسازورين استقلاب خلايا قابلة للحياة في الطول موجي ضوء إثارة من 560 نانومتر وانبعاث الضوء الطول الموجي 590 نانومتر.
      10. طرح
    10. إشارة ريسازورين خط الأساس من جميع الآبار قبل مواصلة تجهيز البيانات. حساب الكسر بقاء الخلية لكل بئر بتقسيم الإشارات الأسفار بإشارة fluorescence متوسط الآبار التحكم.
    11. رسم منحنى الاستجابة للجرعة في رسم البرامج مع الكسر بقاء الخلية كلوغاريتم الأساس 10 تركيز المخدرات كالمحور السيني والصادي. اقحم تركيز تثبيط 50% (IC50) في خلية بقاء جزء صغير من 0.5-

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصنيع وتوصيف ميكروكريوجيلس لتشكيل ميكروتيسوي ثلاثي الأبعاد.

ووفقا لهذا البروتوكول، ميكروكريوجيلس كانت ملفقة للنموذج الثلاثي الأبعاد ميكروتيسويس وميكروكريوجيلس الفردية أو صفائف ميكروكريوجيل، وطبقت على العلاج بالتجدد والمخدرات الفرز، على التوالي (الشكل 1). وطبقت ميكروستينسيل صفيف رقائق ملفقة من البولي ميثيل ميثا اكريلات ميكرومولدس لرقائق مصفوفة ميكروكريوجيل. ويمكن إعداد تصاميم هندسية ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نماذج التجدد في الطب و في المختبر لفحص المخدرات هي اثنين من التطبيقات الهامة للأنسجة الهندسة5،،من67،،من89. بينما هذه التطبيقات اثنين لديها احتياجات مختلفة إلى حد كبير، وأرضية مشتركة بينهما يكمن في الحاجة المحاكاة البيولوجية أكثر استزراع شرط لتعزيز مهام الخلية19. فقط مع مهام الخلية المحسنة في مجال البحوث يمكن أن نعالج الأمراض أف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل دعم مالي من "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (المنح: 81522022، 51461165302). الكتاب تود أن تقر جميع أعضاء مختبر دو للمساعدة العامة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الجيلاتينسيجماG7041تم شراء جميع الكواشف الأخرى من سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري) ما لم يذكر خلاف ذلك.
الجلوتارالديهايد J& K902042تستخدم كرابط في تحضير المواد.
زلة غطاء زجاجي (24 × 50 مم)CITOGLASS ، الصين10212450Cلكشط محلول prcursor على رقائق صفيف microstencils.
الصوديوم  بوروهيدريد ، NaBH 4< / sub>Chemical Works116-8لغسل ما تبقى من الجلوتارالديهايد بعد الهلام.
جرة asperts ، الصينVC8130للحفاظ على microgels تحت الفراغ.
صفائح بولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA)  Sunjin Electronics Co.، Ltd ، صفائح PMMA الصينيةالعادية.
نظام الليزر RayjetRayjet ، أسترالياRayjet 50 C30لنقش صفائح PMMA لتشكيل الآبار.
منظف البلازماMycro Technologies ، الولايات المتحدة الأمريكيةPDC-32Gلجعل PMMA hyphophilic.
LyophilizerBoyikang ، الصينSC21CLلتجميد المواد.
محلول Trypan Blue (0.4٪)Zhongkekeao ، الصينDA0065لصبغ المواد الهلامية الدقيقة.
دوكسوروبيسين هيدروكلوريدالطاقة الكيميائية ، الصينA01E0801360010لاختبار مقاومة الأدوية للخلايا في 2D أو 3D microgel.
الفحص الحي / الميتDojindo Molecular Technologies (كوماموتو ، اليابان)CS01-10للتمييز بين الخلايا الحية والميتة.
خلية Titer-BluePromega (ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية).G8080لاختبار صلاحية الخلية.
مصفاة الخليةBD Biosciences ، الولايات المتحدة الأمريكية352360لجمع الهلاميات الدقيقة.
D-LuciferinSYNCHEM (ألمانيا)s039لمعالجة الخلايا.
المجهر الإلكتروني الماسحFEI ، الولايات المتحدة الأمريكيةQuanta 200لتوصيف مورفولوجيا ميكروجل.
  آلة الاختبار الميكانيكيةبوز ، الولايات المتحدة الأمريكية3230لقياس الميزات الميكانيكية.
مضخة حقنة قابلة للبرمجة  World Precision Instruments ، الولايات المتحدة الأمريكيةALADINI 1000لاختبار injactabiliy.
مقياس القوة الرقميةHBO ، Yueqing Haibao Instrument Co.، Ltd. ، الصينH-50 & nbsp ؛لاختبار injactabiliy.
نظام تعقيم أكسيد الإيثيلينAnprolene ، Anderson Sterilization، Inc. ، Haw River ، NCAN74iلتعقيم الهلاميات الدقيقة بغاز أكسيد الإيثيلين.
قارئ الصفيحةالدقيقة الأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكيةM5لقياس شدة التألق في المصفوفة الدقيقة.
مجهر متحد البؤرنيكون ، اليابانA1Rsiلمراقبة توزيع الخلايا في 3D.
Xenogen  نظام التصوير لومينا الثانيCaliper Life Sciences ، الولايات المتحدة الأمريكيةIVISلتتبع الخلايا في.
الثابت للعملالسائل ، ماصة S الأمريكيةلتحميل تعليق متوسط أو خلية عالية الحرارة.
Beijing فراغ تصميم المشمش

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  3. Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
  4. Fischbach, M. A., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine. Sci Transl Med. 5 (179), 179(2013).
  5. Kuraitis, D., Giordano, C., Ruel, M., Musaro, A., Suuronen, E. J. Exploiting extracellular matrix-stem cell interactions: a review of natural materials for therapeutic muscle regeneration. Biomaterials. 33 (2), 428-443 (2012).
  6. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  7. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay Drug Dev Technol. 11 (7), 435-448 (2013).
  8. Yoshii, Y., et al. High-throughput screening with nanoimprinting 3D culture for efficient drug development by mimicking the tumor environment. Biomaterials. 51, 278-289 (2015).
  9. Li, X., et al. Micro-scaffold array chip for upgrading cell-based high-throughput drug testing to 3D using benchtop equipment. Lab Chip. 14 (3), 471-481 (2014).
  10. Qi, C., Yan, X., Huang, C., Melerzanov, A., Du, Y. Biomaterials as carrier, barrier and reactor for cell-based regenerative medicine. Protein Cell. 6 (9), 638-653 (2015).
  11. Li, Y., et al. Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13511-13516 (2014).
  12. Liu, W., et al. Magnetically controllable 3D microtissues based on magnetic microcryogels. Lab Chip. 14 (15), 2614-2625 (2014).
  13. Zhao, S., Zhao, H., Zhang, X., Li, Y., Du, Y. Off-the-shelf microsponge arrays for facile and efficient construction of miniaturized 3D cellular microenvironments for versatile cell-based assays. Lab Chip. 13 (12), 2350-2358 (2013).
  14. Liu, W., et al. Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery. Acta Biomater. 10 (5), 1864-1875 (2014).
  15. Hakanson, M., et al. Controlled breast cancer microarrays for the deconvolution of cellular multilayering and density effects upon drug responses. PLoS One. 7 (6), e40141(2012).
  16. Du, Y., et al. Rapid generation of spatially and temporally controllable long-range concentration gradients in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (6), 761-767 (2009).
  17. He, J., et al. Microfluidic synthesis of composite cross-gradient materials for investigating cell-biomaterial interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 175-185 (2011).
  18. Zeng, Y., et al. Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing. Acta Biomater. 25, 291-303 (2015).
  19. Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3317-3322 (2010).
  20. Zhang, L., et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia. Stroke. 42 (5), 1437-1444 (2011).
  21. Kinnaird, T., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 109 (12), 1543-1549 (2004).
  22. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  23. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  24. Gimble, J. M., Guilak, F., Bunnell, B. A. Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem Cell Res Ther. 1 (2), (2010).
  25. Thai, H. M., et al. Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant. 18 (3), 283-295 (2009).
  26. Moreira Teixeira, L. S., et al. High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage formation in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 23, 387-399 (2012).
  27. Ifkovits, J. L., et al. Injectable hydrogel properties influence infarct expansion and extent of postinfarction left ventricular remodeling in an ovine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (25), 11507-11512 (2010).
  28. Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomater. , (2017).
  29. Cheng, V., et al. High-content analysis of tumour cell invasion in three-dimensional spheroid assays. Oncoscience. 2 (6), 596-606 (2015).
  30. Huber, J. M., et al. Evaluation of assays for drug efficacy in a three-dimensional model of the lung. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (9), 1955-1966 (2016).
  31. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment in vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BMC Cancer. 16, 581(2016).
  32. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  33. Monjaret, F., et al. Fully Automated One-Step Production of Functional 3D Tumor Spheroids for High-Content Screening. J Lab Autom. 21 (2), 268-280 (2016).
  34. Shologu, N., et al. Recreating complex pathophysiologies in vitro with extracellular matrix surrogates for anticancer therapeutics screening. Drug Discov Today. 21 (9), 1521-1531 (2016).
  35. Ho, W. J., et al. Incorporation of multicellular spheroids into 3-D polymeric scaffolds provides an improved tumor model for screening anticancer drugs. Cancer Sci. 101 (12), 2637-2643 (2010).
  36. Pathak, A., Kumar, S. Independent regulation of tumor cell migration by matrix stiffness and confinement. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (26), 10334-10339 (2012).
  37. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nat Cell Biol. 17 (5), 678-688 (2015).
  38. Romero-Lopez, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  39. Xu, X., Sabanayagam, C. R., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Jia, X. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics. Biomaterials. 35 (10), 3319-3330 (2014).
  40. Xu, X., et al. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer, hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids. Biomaterials. 33 (35), 9049-9060 (2012).
  41. Nyga, A., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U. A novel tissue engineered three-dimensional in vitro colorectal cancer model. Acta Biomater. 9 (8), 7917-7926 (2013).
  42. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochem Biophys Res Commun. 433 (3), 327-332 (2013).
  43. Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
  44. Delgado, L. M., Bayon, Y., Pandit, A., Zeugolis, D. I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 298-313 (2015).
  45. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  46. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  47. Zhang, M., Boughton, P., Rose, B., Lee, C. S., Hong, A. M. The use of porous scaffold as a tumor model. Int J Biomater. 2013, 396056(2013).
  48. Wang, J., et al. Engineering EMT using 3D micro-scaffold to promote hepatic functions for drug hepatotoxicity evaluation. Biomaterials. 91, 11-22 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D MicrotissuesMicrocryogel FabricationInjectable Regenerative TherapyHigh throughput Drug ScreeningCryogelation TechnologyGelatin MicrocryogelsCell loaded CarriersOn chip AssemblyMouse Limb IschemiaResazurin Assay

Related Articles