نحن نبرهن على طريقة لصورة الجزيئات متعددة داخل نانو الهياكل غير متجانسة في دقة جزيء واحد باستخدام ملزم متتابعة وشطف من الأجسام المضادة فلورزنتلي المسمى.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عالية متعددة، والتصوير فائقة الدقة من الخلايا T باستخدام مادستورم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد عرقل التصوير الهياكل الخلوية غير متجانسة باستخدام جزيء واحد المترجمة المجهري من قبل عدم كفاية الدقة التعريب والقدرة على مضاعفة. باستخدام الفلورسنت نانو الماس علامات فيدوسيال، ونحن تصف تصحيح الانجراف وإجراءات المحاذاة المطلوبة للحصول على دقة عالية في جزيء واحد المترجمة المجهري. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف استراتيجية تعدد الإرسال الجديدة، مادستورم، التي تستهدف جزيئات متعددة في نفس الخلية باستخدام ملتزمة متتابعة وشطف من الأجسام المضادة الفلورسنت. ويظهر مادستورم على خلية T تنشيط لتصور مواقع مكونات مختلفة داخل هيكل غشاء، متعدد البروتينات يسمى مستقبلات الخلايا الدقيقة T. وبالإضافة إلى ذلك، ويناقش تطبيق مادستورم كأداة عامة لتصور الهياكل متعددة البروتين.
المقدمة
وقد وضعت مجموعة متنوعة من تقنيات فائقة الدقة المجهر للتغلب على حد حيود المجهر الضوئي (~ 200 نانومتر). من بين هذه هي فئة من التقنيات تسمى جزيء واحد المجهر توطين (سملم) الذي يتضمن الصورة تنشيط التنشيط المجهري (بالم) والموجات الدقيقة المجهر الضوئي العشوائي (ستورم). تقنيات سملم حصة في استخدام فلوروفوريس التي يمكن أن تنتقل بين (على الفلورسنت) وخارج (الظلام / صورة التبديل) الدول، مما يسمح توطين متتابعة من مضان من جزيئات واحدة 1 ، 2 ، 3 .
وبسبب توافقه مع الأصباغ والمجاهر الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تنبیھ: یرجی الرجوع إلی جمیع صحائف بیانات سلامة المواد ذات الصلة (مسس) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول هي سامة ومسرطنة. يرجى استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند تنفيذ البروتوكول بما في ذلك استخدام الضوابط الهندسية (غطاء الدخان، علبة القفازات) ومعدات الحماية الشخصية (نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر، والسراويل طول كامل، وأحذية مغلقة اصبع القدم).
1. التصوير المضاعف من خلايا T المنشط
- مباشرة اقتران الأجسام المضادة مع اليكسا-6....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم استخدام طريقة الشطف والتلطيخ المتسلسل لإنتاج صورة مادستورم المضاعفة للميكروسترات وغيرها من الهياكل في خلية T جوركات المنشطة ( الشكل 1 ، والتحقق من التحالفات الرقم). كل صورة شبه الزائفة تمثل جولة واحدة من التصوير مادستورم المكتسبة في الخطوات 1.1.1 إلى 1.3.13. كما هو موضح سابقا 10 ، ينبغي رصد مجال الرؤية للإشارة المتبقية من السابق، غير إلوتد الأجسام المضادة لتجنب الحديث المتبادل بين الأهد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وتتيح عمليات تعدد الإرسال المتتابعة، وتصحيح الانحراف، وإجراءات المحاذاة في مادستورم تصورا دقيقا ومتعدد الإرسال للغاية للهياكل غير المتجانسة في الخلايا. 10 بالإضافة إلى ذلك، مادستورم يتجنب القيود من متعدد الألوان ستورم مثل انحراف لوني والخصائص دون المستوى الأمثل فوتوسويتشينغ / الانبعاثات من الأصباغ غير بعيدة الأحمر 9 ، 12 . كما خطوة شطف يقلل بشكل كبير من التداخل ستيريك من الأجسام المضادة ملزمة بالتتا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا ما نكشف عنه.
شكر وتقدير
نشكر شوفنغ وو للوصول إلى المجهر ستورم. وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث الداخلية للمركز الوطني للسرطان معهد (نسي) لأبحاث السرطان والمعهد الوطني لرئة القلب والدم (نهلبي).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 8 غرفة غطاء البئر | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1٪ محلول بولي إل ليسين | سيجما ألدريتش | P8920 | |
| NV-100 نانومتر نانو الماس الفلوري | أداماس الأحمر FND | ||
| المضاد ل CD3 & epsilon ؛ الأجسام المضادة | BD Biosciences | 555329 | |
| زلاليم مصل البقر ، الكسر الخامس | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10٪ Paraformaldehyde | EMS | 15712 | المسرطن |
| من جلد أسماك المياه العذبة | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 طقم وضع العلامات على الأجسام المضادة | Thermo Fisher | A20186 | |
| 138924 من كلوريد المغنيسيوم | |||
| سيجما ألدريتش | P6757 | ||
| توين -20 | فيشر Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | شديد السمية وحساس للهواء |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Cyclooctatetraene شديد السمية 98٪ | Sigma-Aldrich | 138924 | شديد السمية وحساسة للهواء |
| 10x PBS | KD | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
المراجع
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
