عباءة الخلية اللمفاوية (MCL) مهمة صعبة لعلاج اضطراب خلايا ب ويصعب وضع نموذج ماوس إكسينوجرافت من MCL الأولية دراسة وتطوير المداواة. هنا، يصف لنا النجاح في إقامة MCL تكثيفها في الفئران للمساعدة على فهم البيولوجيا الأساسية لها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ورم انجرافتمينت في نموذج الفأر إكسينوجرافت من عباءة البشرية الخلية اللمفاوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
من الفعاليات الرئيسية في التداول الخلايا المناعية وأنها موطن أساسا للخلايا الليمفاوية ب ويقيمون في الأجهزة اللمفاوية. بينما تتكاثر الخلايا العادية ب فقط عندما يحفزه لمفاوية T، النمطان ب الخلايا البقاء على قيد الحياة وتوسيع استقلالية في منافذ الجهاز غير معرف. عباءة الخلية اللمفاوية (MCL) أحد هذه الخلية باضطراب، وحيث معدل متوسط بقاء المرضى 4-5 سنوات. وهذا يدعو إلى حاجة الآليات الفعالة التي يتم حظرها بصاروخ موجه وانجرافتمينت من هذه الخلايا بغية زيادة البقاء على قيد الحياة وطول العمر للمرضى. ولذلك، بالجهود المبذولة لتطوير نموذج ماوس إكسينوجرافت لدراسة مدى فعالية العلاجات MCL بعرقلة صاروخ موجه إليه في فيفو أهمية قصوى. واتبعت طويلة التنمية الحيوانية المتلقين للسلالة البشرية الخلية لاختبار المخدرات المرحلة المبكرة، كنماذج الماوس السريرية ذات الصلة حاسمة بالنسبة للعوامل العلاجية الجديدة الشاشة. تم تطوير هذا النموذج الحيواني لتجنب رفض الابتزاز البشرية ووضع نموذج للأمراض التي تصيب الإنسان، وأنها قد تكون أداة مفيدة للغاية لدراسة تطور المرض لأنواع مختلفة من الأورام اللمفاوية، والقيام بالتجارب السريرية للمخدرات مرشح الأورام الخبيثة الدموية، مثل MCL. قمنا بإنشاء نموذج ماوس إكسينوجرافت التي ستكون بمثابة مصدرا ممتازا دراسة وتطوير نهج علاجية مبتكرة ل MCL.
المقدمة
لمفاوية بالطبيعة تؤدي دوراً رئيسيا في منأى عن المراقبة، واللمفاويات الاتجار خطوة حاسمة في تركيب مستضد حصانة محددة1،2. وتشمل هذه العملية الهجرة من السذاجة تي لمفاوية من الغدة الصعترية إلى مجرى الدم، ومن هناك إلى الأجهزة اللمفاوية الثانوية، بما في ذلك الغدد الليمفاوية أو بقع بير في الطحال، حيث يلتقي المستضدات المشابهة. الخلايا الليمفاوية ب التفريق في نخاع العظام وتهاجر كخلايا ساذجة في المسام من الأجهزة اللمفاوية الثانوية3. بعض من هذه الخلايا ب ربط مستضد مع مستقبلات بهم ويتم تفعيلها من خلال خلايا T معينة. انتشار وتمايز هذه الخلايا ب يدفع الخلايا السذاجة ب عدم تفعيلها، إلى منطقة عباءة المسام. يمكن أن تفرق في الذاكرة ب تنشيط الخلايا ثم الخلايا التي دوريات الهيئة، أو تنضج في الغلوبولين المناعي إفراز خلايا البلازما التي تهاجر إلى نخاع العظم4.
MCL عند لمفاوية السذاجة ب في منطقة عباءة تحويل إلى ورم. هذه الخلايا اللمفاوية الموجودة في المكروية الأجهزة اللمفاوية وتتكاثر مستقلة عن مراقبة محددة تي اللمفاويات. بيد أنه في مرحلة معينة من كثافة الهروب من هذا مكانة واوافيكم في مجرى الدم في البحث عن منافذ في الأجهزة الأخرى. نظراً للطابع المعقد لجزيئات الالتصاق والانفلات من المستقطبات وعلى المستقبلات، إليه هذا الخلوية الاتجار في فيفو هو غير مفهومة ويعوق ذلك العلاج. أساليب الرواية ضرورية لفعالية حظر هذا عملية الهجرة لمنع الخلايا اللمفاوية ب من الوصول إلى ميكرونفيرونمينتس جديدة.
MCL واحد من الأكثر صعوبة في علاج الأورام الخبيثة الخلية ب. تطوير النمط الظاهري الورمية ل MCL هو نتيجة لسلسلة متعددة الخطوات، تتميز باكتساب الخصائص البيولوجية الفريدة. وقت التشخيص، يقدم معظم المرضى (70 في المائة) الفعل مع مرض نشرها، مع غالبية الحالات العارضة مشاركة اكسترانودال في الطحال ونخاع العظام، و/أو الجهاز الهضمي5،6. في معالجة المرضى، والانتكاس بمقاومة الأورام في غضون سنوات قليلة شائع، على الرغم من أن العلاج الكيميائي التقليدي يدفع معدلات عالية مغفرة في المدى القصير7،8. هنا نقدم نموذجا أمراض جديدة التي يمكن أن تساعد على فهم نشر MCL وعن البيولوجيا الأساسية: قمنا بإنشاء نموذج ماوس xenograft MCL بشرية التي نشأت من الخلايا السرطانية الأولية للمرضى. ونأمل أن يساعد هذا النموذج وضع استراتيجيات علاجية ضد نشر MCL، وربما توفر منظورات جديدة السريرية للأمثل التشخيص والعلاج للمرضى الذين انتكست.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد استخدمت عينات الدم البشري وفقا للإجراءات التي أقرتها بالأخلاقيات المحلية ولجان إجراء التجارب على البشر في مستشفى جامعة جنيف.
وأجريت إجراءات الحيوانية وفقا "المؤسسية الأخلاقية اللجنة للحيوان الرعاية" في جنيف، سويسرا، ومكتب الطب البيطري الكانتونات (رقم الترخيص: جنرال الكتريك/26/15).
1-إعداد خلايا الدم الطرفية الأولية وحيدات النوى (ببمكس) بكثافة الفصل التدرج
ملاحظة: تم الحصول على 3-5 مل دم المحيطي من المرضى تقديم مع MCL في مرحلة ليوكيميك. التشخيص المنشأة وفقا للمعايير التشخيصية للتدفق الخلوي (CD5 +، CD23−، CD200 +، والسكان [مونوكلونل] بالخليه)، وأكدت وجود t(11;14) إزفاء و overexpression cyclin D1 في وقت لاحق. وفي جميع الحالات، تشكل الخلايا ب [مونوكلونل] إلى > 90 في المائة من السكان الإجمالي بالخليه. وكانت الخلايا المتبقية أساسا وحيدات وبعض الخلايا T.
- تمييع (1:1) 5 مل من عينة الدم MCL مع 5 مل من روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط 1640 (ربمي) (الشكل 1A).
- عكس الإعلام الكثافة المتدرجة (جدول المواد) عدة مرات قبل الاستعمال لضمان خلط دقيق.
- إضافة 5 مل من كثافة وسائل الإعلام التدرج في أنبوب الطرد مركزي 15 مل المضخة ماصة باستخدام.
- بلطف طبقة عينة الدم المخفف أكثر كثافة وسائل الإعلام التدرج في أنبوب الطرد المركزي 15 مل باستخدام الشافطة (يجب أن يكون الدم إلى كثافة وسائل الإعلام التدرج نسبة 2:1، مثلاً، 10 مل من الدم إلى 5 مل من الكثافة المتدرجة وسائط الإعلام). ينبغي الحرص على عدم مزيج الطبقتين (الشكل 1، ج).
- الطرد المركزي العينة في 400 غرام x لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل الفرامل أجهزة الطرد المركزي.
- استخدام ماصة باستور معقمة، نضح بلطف طبقة وسطى (حلقة بيضاء، رقيقة ملحوظ مع سهم (الشكل 1، ﻫ)) التي تحتوي على الخلايا وحيدات النوى، وتحويلها إلى أنبوب نظيفة.
- غسل الخلايا وحيدات النوى
- تقدير حجم تعليق خلية المحولة، وإضافة إلى ذلك 3 مجلدات العقيمة 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع ألبومين المصل البقري 1% (BSA).
- مزيج التعليق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات.
- الطرد المركزي بتعليق في 400-500 غم x لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل المادة طافية على الحصول على خلية بيليه وكرر الخطوة يغسل مرة أخرى.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا الموجودة في وحدة التخزين المطلوبة، مثلاً، مل 1 أو 2 من برنامج تلفزيوني.
- حساب عدد الخلايا عداد الآلي خلية أو يدوياً باستخدام هيموسيتوميتير (دائرة نويباور).
2-تخصيب الخلايا ب بتحديد الخلية بالسلبيه
- تمييع الخلايا في برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي من 50 × 106 خلايا/مل.
- نقل الخلايا إلى 5 مل جولة الأنبوبة البوليستيرين السفلي. إضافة 100 ميليلتر من جسم كوكتيل من الطقم تخصيب خلية بالي 2 مل تعليق خلية، وتخلط بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً (الشكل 2-1).
- احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- بإيجاز دوامة الجزيئات المغناطيسية المنصوص عليها في مواد تخصيب خلية ب 30 ثانية (الشكل 2-2). إضافة 150 ميليلتر من الجزيئات المغناطيسية إلى 2 مل العينة.
- احتضان العينة لآخر 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- جعل حجم العينة إلى 2.5 مل مع PBS x 1 يحتوي على 2% مصل العجل الجنين (FCS) وحمض الإيثيلين 1 مم (يدتا). ضع الأنبوبة في المغناطيس واحتضان الأنبوب لآخر 3-5 دقيقة (الشكل 2-3).
- التقاط المغناطيس مع الأنبوب في المكان، وفي حركة مستمرة واحدة، صب الأنبوبة حيث أن تعليق التخصيب الخلية يتم جمعها في أنبوب جديد (الشكل 2-4). عد الخلايا عداد الآلي خلية أو يدوياً باستخدام هيموسيتوميتير الحصول على عائد إجمالي الخلايا ب.
ملاحظة: عادة ما يكون العائد ~ 105 ب خلايا/مل للعادي ب الخلايا و 5-50 × 106 خلايا/مل ل MCL. - يؤكد نقاء تخصيب خلية ب
- تأخذ ~ الخلايا 50,000 واحتضان الخلايا مع الأجسام المضادة-CD19/CD20 (01:20 إضعاف) والأجسام المضادة-CD45 بالإضافة إلى فلوروتشروميس مختلفة (01:10 إضعاف) في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-30 دقيقة.
- يغسل مع 1 مل 1 × برنامج تلفزيوني + 1% جيش صرب البوسنة، والطرد المركزي الخلايا في 400-500 غم x لمدة 5 دقائق، وريسوسبيند الخلايا في ~ 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
- الحصول على عينات الخلايا بالتدفق الخلوي وتحليل لنقاء الخلايا باء. النقاء الغالب > 90% بهذه الطريقة (الشكل 3).
3-وضع النموذج الماوس إكسينوجرافت
- تعليق ~ 40-60 × 106 خلايا في 150-200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x (الحجم المطلوب لحقن كل الماوس).
- ضخ 150 ميليلتر من تعليق خلية عن طريق الوريد (رابعا) الوريد ذيل كل 6-7 الأسبوع القديمة العوز الفئران مشمولان إيماءة غاما (مجموعة موردي المواد النووية) بغض النظر عن نوع الجنس (الشكل 4 أ).
- السماح للفئران لتطوير الأورام اللمفاوية البشرية ~ 10 أسابيع.
ملاحظة: الخلايا اللمفاوية البشرية الأولية يستغرق وقتاً أطول لوضع الورم مقارنة بخطوط الخلايا البشرية سرطان الغدد الليمفاوية (~ 3 أسابيع). - عندما تبدأ الحيوانات في إظهار أعراض أمراض قاتلة مثل فقدان الوزن، تكدرت الشعر، تناقص النشاط، الشلل أطرافهم هند، إلخ، التضحية الفئران CO2 خنقاً متبوعاً بثقب القلب القلب للحصول على الدم ب.
- جمع مختلف الأجهزة مثل نخاع العظم والطحال والكبد بتشريح الفئران وجمع الدم بسحب الدم من القلب وقت التضحية للورم انجرافتمينت تحليل (الشكل 4 باء -و).
4-تشيميريسم تحليل خلية الورم انجرافتيد في مختلف الأجهزة
- وبعد جمع مختلف الأجهزة، عملية لهم بتعطيل الميكانيكية لتوليد تعليق خلية مفردة عقب تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) استخدام ميليلتر 200 1 x البوتاسيوم كلوريد الأمونيوم العازلة للدم ونخاع العظام، 500 ميليلتر للطحال، ومل 2 للكبد .
- عد ووصمة عار الخلايا باستخدام الأجسام البشرية بخليه محددة أيوالمضادة-CD19، CD20 مكافحة، ومكافحة CD45.
ملاحظة: الفئران مجموعة موردي المواد النووية تفتقر خلايا ب والتالي للتحليل، ملطخة الخلايا مع علامات خلية ببشريه محددة. - تحليل الخلايا المستمدة من كل جهاز بالتدفق الخلوي النابضة في الخلايا ب (CD19 + CD20 +، CD45 +).
- تحديد الخلايا السرطانية انجرافتيد في الأجهزة المختلفة المستمدة من MCL حقن الفئران استناداً إلى بوابات الخلايا كما هو مبين في الخطوة 4، 3 (الشكل 4).
ملاحظة: انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويصف المخطوط بروتوكولا أمثل للتنمية الناجحة لنموذج الماوس إكسينوجرافت engraftment الخلايا MCL. إعداد سكان خلية النقي (في هذه الحالة في خلايا MCL)، حرج للغاية لتطوير ناجح MCL تكثيفها. ويمثل الرقم 1 الخطوات التحضيرية لعزل الخلايا وحيدات النوى من دم المريض MCL بكثافة الفصل التدرج. وتجهز الخلايا وحيدات النوى كذلك الحصول على النقي ب الخلايا باستخدام مجموعة إثراء سلبي بخليه للحصول على عدد سكان خلية نقية لحقن إكسينوجرافت في الفئران. وينبغي الحرص على الحصول على نقاء ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التجارب السريرية ممكنة للمخدرات التي في مرحلة متقدمة من التنمية ولكن لا يمكن استخدامها لاكتشاف المخدرات. واتبعت منذ فترة طويلة الجهود الرامية إلى تطوير المستلمين الحيوان للسلالة البشرية الخلية من أجل اختبار المخدرات المرحلة المبكرة. هنا نقدم نموذجا حيوان أن يتجنب رفض الابتزاز البشرية ويمكن وضع نموذج للأمراض التي تصيب الإنسان، مثل MCL. وهذا في الوقت الحاضر نموذج xenograft أحدث دراسة الآليات engraftment الأورام البشرية ونمو الورم. هنا نستخدم مجموعة موردي المواد النووية الفئران، واحد من النماذج الماوس القصور المناعي الأكثر ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
هذا العمل كان يدعمها جنيه جنيف رابطة مكافحة السرطان، مؤسسة الدكتور دوبوا فيريير دينو--Lipatti، أونكوسويسي شرطة-مكتب الدعم الدستوري، مكتب الدعم الدستوري-02260-08-2008 و 2914-02-2012، و "منحة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية" 31003A_156760 و 310030-153456.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Ficoll-paque media | GE Healthcare | 17-1440-02 | لفصل الخلايا أحادية النواة |
| RPMI Medium 1640 | تقنيات Gibco-Life | 61870-010 | لتخفيف عينة الدم |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | غسل الخلايا |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | سيجما ألدريتش | A8412 | لتحضير PBS مع 1٪ BSA المستخدمة في غسل الخلايا أثناء العزل |
| CD19-APC700 | Beckman Coulter | B49212 | خلية بشرية عموم B |
| CD20-APC | بيكمان كولتر | A21693 | علامة خلية عموم ب بشرية |
| CD20-ECD | بيكمان كولتر | IM3607 | خلية بشرية عموم ب |
| CD5-PC 5.5 | بيكمان كولتر | PN A70203 | علامة |
| CD23-PE | Pharmingen | 555711 | بروتين سطح الخلية غائب عادة في MCL |
| CD45 KO | Beckman Coulter | B36294 | علامة عموم الكريات |
| البيض CD200-PE | Pharmingen | 552475 | بروتين سطح الخلية غائب عادة في MCL |
| NOD scid gamma (NSG) | مختبرات تشارلز ريفر | 5557 | المستخدمة لتطوير الطعوم الغريبة MCL في هذه الدراسة |
| مجموعة تخصيب الخلايا البائية البشرية سهلة | تقنيات الخلايا الجذعية | 19054 | تستخدم لإثراء الخلايا البائية للحصول على خلايا نقية للحقن في الفئران |
| FACS | بيكمان كولتر | نافيوس | تستخدم لتوصيف عينة MCL ودراسة أعضاء نقش MCL |
| 1X كلوريد الأمونيوم البوتاسيوم عازلة | تحلل الدم الأحمر (NH4Cl 8,024 مجم / لتر ؛ KHCO3 1,001 مجم / لتر ؛ EDTA. Na2 & middot; 2H2O 3.722 مجم / لتر) |
المراجع
- Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. Human chemokines: an update. Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).
- Baggiolini, M. Chemokines and leukocyte traffic. Nature. 392, 565-568 (1998).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th edition, (2001).
- De Silva, N. S., Klein, U. Dynamics of B cells in germinal centres. Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).
- Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma. Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).
- Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems. Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).
- Herrmann, A., et al. Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma. J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).
- Martin, P., et al. Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies. Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).
- Iyengar, S., et al. Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice. Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).
- Klco, J. M., et al. Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia. Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).
- Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts. Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).
- Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma. J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
