مقالة منهجية

الكيمياء المناعية الكمية للمكروية الخلوية في المرضى ارتجاجات الأرومة الدبقية

DOI:

10.3791/56025

⸱

يوليو 31, 2017

 , 
1Biomedical Engineering, University of Virginia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تطوير هذا البروتوكول لتحديد كميا مكونات المكروية الورم في ريسيكلتيونس المريض ورم أروميوجيستوك باستخدام الكيمياء المناعية و إيماجيج.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع الاهتمام المتزايد في المكروية الورم، وضعنا إلى وضع طريقة لتحديد على وجه التحديد مكونات المكروية داخل عينات المريض من أرومة دبقية، والأكثر دموية والأكثر سرطان الدماغ الغازية. ليس فقط الطرق الكمية المفيدة لوصف الأنسجة المريضة بدقة، فإنها يمكن أيضا أن تسهم في تشخيص أكثر دقة، والتشخيص، وتطوير النظم التي تعمل على الأنسجة الأنسجة والاستبدالات. في الخلايا الدبقية، الخلايا الدبقية، مثل الخلايا الدبقية الصغيرة و الخلايا النجمية، وقد ارتبطت بشكل مستقل مع سوء التشخيص على أساس الدرجات علم الأمراض. ومع ذلك، فإن حالة هذه الخلايا وغيرها من مكونات الخلية الدبقية لم يتم وصفها بشكل جيد كميا. هذا يمكن أن يكون صعبا بسبب العمليات الكبيرة التي تميز هذه الخلايا الدبقية. وعلاوة على ذلك، فإن معظم التحليلات النسيجية تركز على عينة الأنسجة الشاملة أو فقط في الجزء الأكبر من الورم، بدلا من تحديد الكميات على أساس المناطق الطرافةهين الأنسجة غير متجانسة للغاية. هنا، نحن تصف طريقة لتحديد وتحليل كميا من السكان من الخلايا الدبقية داخل الورم السائبة والمناطق المجاورة من استئصال الورم من مرضى أرومة دبقية. استخدمنا المناعية اللوني لتحديد السكان الخلية الدبقية في استئصال الورم المريض و إيماجيج لتحليل التغطية في المئة من تلطيخ لكل السكان الدبقية. مع هذه التقنيات ونحن قادرون على وصف أفضل الخلايا الدبقية في جميع أنحاء المناطق المكروية الورم الدبقية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ورم أرومي دبقي (غم)، وسرطان الدماغ الأكثر شيوعا والخبيثة، وتتميز غزو منتشر للغاية من السائبة الورم الرئيسي في محيط حمة صحية المحيطة 1 ، 2 . هذا الغزو منتشر يجعل الورم من الصعب بشكل خاص على استئصال تماما، والخلايا السرطانية الغازية التي تبقى بعد العلاج هو السبب الأكثر شيوعا لتكرار لا مفر منه 2 ، 3 ، 4 . في السابق، وجدنا تثبيط غزو خلية دبقية منتشر ليكون مفيدا علاجيا 5 ، ولكن لا يعرف سوى القليل عن الآليات المعقدة المساهمة في غم غزو. وقد تورط المكروية الورم، أو الأنسجة المحيطة بالسرطان، في تطور الأورام في سرطانات متعددة 6 ، 7 . ورم أرومي غليوبلاستوما المكروية، في صالمفصلي، هو نسبيا أقل من وصفها، وهي معقدة بشكل فريد، وتتألف من الخلايا الدبقية متعددة، مثل الخلايا النجمية، الدبقية الصغيرة، و أوليغوديندروسيتس، فضلا عن مصفوفة خارج الخلية، والعوامل القابلة للذوبان، والعوامل الفيزيائية الحيوية. من الناحية التجريبية، وقد أظهرت الخلايا النجمية والدبقية الصغيرة لزيادة تطور الورم والغزو 8 ، 9 ، 10 ، ولكن تكوين جميع الخلايا الدبقية في المكروية الدماغ البشري الأصلي غير معروف.

لقد أظهرنا في السابق أن مكونات المكروية يمكن أن تتنبأ بقاء المريض عن طريق التحليل الكمي للمكونات الخلوية للمكروية الدبقية ودمج تحليلاتنا في نموذج المخاطر النسبية 11 . هنا، نحن تصف طريقة التحليل الكمي لتحديد السكان من الخلايا الدبقية داخل الورم السائبة والمناطق المجاورة من استئصال الورم من مريض أرومي دبقيالصورة. استخدمنا المناعية اللوني لتحديد السكان الخلايا الدبقية و إيماجيج لتحليل التغطية في المئة من تلطيخ لكل السكان الدبقية. تقييم نسبة التغطية يخلق قياس بسيط لتحديد الاختلافات المورفولوجية للخلايا، وخاصة تلك المتضررة من التفاعلات مع الخلايا السرطانية. الدراسات السابقة لقياس كميا تلطيخ الأنسجة استخدام تلطيخ القياسية مثل الهيماتوكسيلين ويوزين 12 أو ثلاثي الألوان ماسون في 13 ، والتي لا تستفيد من خصوصية تلطيخ المناعية القائمة على الأجسام المضادة. وقد تم تطوير أسلوبنا لتحديد كمية السكان الدبقية مباشرة داخل الورم الأرومي الدبقي استئصال الورم المريض، والتي نهدف إلى استخدامها لتوضيح المكروية الدبقية المعقدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يحدد المكونات الخلوية في الفورمالين ثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من عينات (فب)، كما هو الحال بالنسبة لعينات المريض السريرية السريرية. التضمين البارافين يسمح لأفضل صيانة التشكل الخلوي والأنسجة وكذلك لديه طول العمر أفضل من المقاطع. تم الوصول إلى العينات المستخدمة في هذا التحليل من خلال مرفق أبحاث المستودعات الحيوية والأنسجة بجامعة فرجينيا. تم اختيار عينات المرضى من قبل طبيب الأعصاب على أساس تشخيص نهائي من ورم أرومي دبقي (نجمي، الصف الرابع لمنظمة الصحة العالمية) الذين أكملوا استئصال الورم في جامعة فيرجينيا بين عامي 2010 و 2013، وتم إلغاء تحديدها قبل هذا التحليل 11 .

1. فب عينة ديبارافينيزاتيون والجفاف

ملاحظة: هذا الجزء من البروتوكول هو محدد لعينات فب. في حين أن العينات جزءا لا يتجزأ من البارافين يمكن أن تكون أكثر فائدة لهذا التحليل بسبب الحفاظ على الخلوية و tقضية مورفولوجيا، ويمكن أيضا أن يتم هذا التحليل مع أقسام المجمدة. إذا استخدام المقاطع المجمدة، ويمكن حذف هذا الجزء والمضي قدما مباشرة إلى المناعية اللوني.

  1. أداء يغسل التالية لمدة 5 دقائق كل: الزيلين، الزيلين، الإيثانول 100٪، الإيثانول 100٪، الإيثانول 95٪، الإيثانول 95٪، الإيثانول 70٪ والمياه منزوع الأيونات والمياه منزوع الأيونات

2. أنتيجن استرجاع

ملاحظة: هذا الجزء من بروتوكول ضروري لكسر الجسور الميثيلين شكلت خلال تثبيت الفورمالين من عينات فب وفضح مواقع مستضد للأجسام المضادة لربط.

  1. تمييع تريس المستندة إلى ارتفاع الرقم الهيدروجيني مستضد حل حل في توصية المصنع في الماء المقطر.
  2. إجراء استرجاع مستضد بوساطة الحرارة باستخدام الميكروويف. كما أن أشكال أخرى من استرجاع بوساطة الحرارة (مثل طنجرة الضغط أو باخرة الخضار أو الماء المغلي) تكفي أيضا.
    1. إضافة حل مخفيا كشف في الميكروويف غير مختومةوعاء. وضع الشرائح في السفينة. ضع الشرائح في الميكروويف.
    2. يغلي لمدة 20 دقيقة في قوة عالية. مراقبة مستويات السائل للتبخر، وتجديد بالماء المقطر حسب الضرورة.
  3. السماح للعينات لتبرد في حل لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

3. كروموجينيك المناعية

  1. مخطط عينة الأنسجة مع القلم مسعور لتقليل حجم الكواشف اللازمة لتغطية العينة.
    ملاحظة: تأكد من الحفاظ على عينات الأنسجة رطب وعدم السماح لهم تجف لأن هذا سيؤثر على فعالية تلطيخ.
  2. الماصة ما يكفي من حل بيرمابيليزاتيون (تريس مخزنة المالحة (تبس) + 0.01٪ تريتون- X) لتغطية عينة الأنسجة (عادة حوالي 100-200 ميكرولتر).
  3. إزالة وتجاهل الحل وتكرار الخطوة 3.2.
  4. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة مع حل عرقلة (مصل الحصان 2.5٪ + حل بيرمابيليزاتيون).
  5. احتضان عينات بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع الأجسام المضادة الأولية المخففةفي حجب الحل.
    ملاحظة: يتم تخفيف جميع الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هنا في 1: 200، ولكن يمكن تحديد التخفيفات المثلى باستخدام التخفيفات المسلسل بدءا من توصية الشركة المصنعة. تم نشر معلومات مفصلة عن الأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول سابقا 11 .
  6. الكشف عن الأجسام المضادة الأولية باستخدام كاشف البيروكسيداز البيروكسيديز الفجل المقابلة مع الحيوان المضيف الأجسام المضادة الأولية، بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
  7. الماصة ما يكفي من حل بيرمابيليزاتيون لتغطية عينة الأنسجة واحتضان لمدة 5 دقائق.
  8. إزالة وتجاهل الحل وتكرار الخطوة 3.7.
  9. احتضان الشرائح في 0.3٪ H 2 O 2 في تبس 1X لمدة 15 دقيقة.
  10. تطوير عينات مع البيروكسيديز ديامينوبنزيدين (داب) الركيزة لمدة 2-10 دقيقة حتى يتم تحقيق كثافة وصمة عار المطلوب.
  11. عينات كونتيرستين لتحديد نوى الخلية، مثل مع الهيماتوكسيلين، بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
  12. يذوى عينات مع 100٪الإيثانول والزيلين.
  13. جبل عينات بشكل دائم مع وسائل الإعلام المتصاعدة.

4. مناطق تحديد الهوية

  1. صورة الشرائح تحت برايتفيلد المجهري قادرة على صور عالية الدقة.
    ملاحظة: استخدام مكونات الخلوية التصوير على الأقل 20X القرار.
  2. نقل الكاميرا إلى مناطق محددة من الفائدة في جميع أنحاء عينات الأنسجة.
  3. حفظ الصور كملفات تيف للكمية.

5. تحليل الصورة

  1. فتح الصور في إيماجيج لتقدير كمية التغطية في المئة.
  2. استخدام المكون عتبة اللون لإزالة اللون الأرجواني من النوى الملطخة الهيماتوكسيلين.
  3. تحويل الصورة إلى 8 بت.
  4. أضف عتبة بدون خلفية داكنة.
  5. صورة العملية باستخدام واحدة من 17 مرشحات عتبة إيماجيج قبل تحميلها ( أي ماكسنتروبي) حتى يتم تضمين فقط أجزاء ملطخة داب في عتبة.
    ملاحظة: حدد فلتر العتبة الأمثل قبل التحميل الذي يقللإس، الجمع، بسبب، الخلفية.، ستينينغ. هذا يمكن أن تعتمد على نوعية تلطيخ وخصوصية الأجسام المضادة. استخدام نفس العتبة لجميع المكررات التقنية داخل كل عينة المريض.
  6. تطبيق الحد الأدنى.
  7. قياس نسبة النسبة المئوية للصورة المحددة.
  8. متوسط ​​نسبة تغطية المنطقة لمناطق متعددة داخل كل عينة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لهذا التحليل، تم تحديد منطقتين من المصالح داخل استئصال الورم لدينا - الجزء الأكبر السرطانية الورم والمناطق المجاورة، تتألف أساسا من نسيج صحي مع الخلايا السرطانية الغازية منتشر ( الشكل 1A ، 1B ) من قبل علماء الأعصاب المتعاونين على الهيماتوكسيلين والمريض الملون يوزين العينات. داخل كل عينة المريض، تلطيخ إيجابي لالخلايا النجمية ( الشكل 1C )، تم تحديد الدبقية الصغيرة (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة لدينا المقترحة هنا هو النهج الكمي لتحليل العينات النسيجية الملون باستخدام المناعية التقليدية اللونية. المنهجية الحالية لهذا النوع من التحليل تشمل بروتوكولات تلطيخ مماثلة تليها الدرجات من قبل علماء الأمراض مستقل. وكانت هذه الطريقة موثوق بها، ولكن بالنسبة لعدد من التطبيقات، وهناك حاجة إلى فهم أكثر دقة للمكياج الخلوي، مثل فهم أفضل للتغاير المرتبطة بالأورام والتلخيص الدقيق للأورام للدراسات في المختبر.

هذا البرو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفين أشكر درس. فهد بفاكيه وجيم مانديل لاقتناء وتحديد عينات المرضى، غاريت بيغلي للمساعدة في المناعية، ومرفق البحوث البيولوجية والأنسجة، ومركز بحوث القلب والأوعية الدموية الأساسية الأنسجة، ومرفق التحليل الجزيئي البيولوجي في جامعة فيرجينيا للحصول على مساعدة مع اكتساب العينة، المناعية، والتصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
زيلينفيشر كيميكالX3P
الإيثانول
محلول كشف المستضد عالي الأس الهيدروجينيVector LabsH-3301
TBS
Triton-XAmresco9002-93-1
مصل
المضاد ALDH1L1 abcam ab56777
مكافحة Iba1 abcam ab5076
بروتين محدد مضاد للخلايا قليلة التغصن1 abcam ab53041
ImmPRESS مضاد للماعزمختبرات ناقلاتMP-7405
ImmPRESS عالمي (مضاد للفأر / أرنب)Vector LabsMP-7500
بيروكسيد الهيدروجينSigma Aldrich216763
ImmPACT DAB الركيزةVector LabsSK-4105
Hematoxylin counterstainThermoScientific72404
Histochoice تصاعد وسائل الإعلامAmrescoH157-475
Aperio ScanscopeLeica Biosystems
Image LeicaBiosystems
Super HT PAP PenResearch Products International195506
الحصان

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
  2. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  3. Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells. Cancer Res. 61 (6), (2001).
  4. Tuettenberg, J., et al. Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).
  5. Munson, J. M., et al. Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36(2012).
  6. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).
  7. Rubin, J. B. Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis. Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).
  8. Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
  9. Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).
  10. Ye, X., et al. Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway. J. Immunol. 189, 444-453 (2012).
  11. Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival. J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).
  12. Yuan, Y., et al. Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling. Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).
  13. Yi, E. S., et al. Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).
  14. Turcan, S., et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).
  15. Songtao, Q., et al. IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma. Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).
  16. Shinojima, N., et al. Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme. Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).
  17. Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand? Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).
  18. Badie, B., Schartner, J. Role of microglia in glioma biology. Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).
  19. Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
  20. Alves, T. R., et al. Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma. Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).
  21. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).
  22. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
  23. Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment. Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).
  24. Rath, B. H., et al. Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells. PLoS One. 8 (1), e54752(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Glioblastoma Tumor MicroenvironmentChromogenic ImmunohistochemistryImageJ AnalysisGlial Cell QuantificationPatient Tumor ResectionsAntigen RetrievalPermeabilization SolutionPrimary AntibodiesDAB SubstrateHematoxylin Counterstain

مقالات ذات صلة