يتم وصف استخدام تكييف "رقاقة حاسة الشم" لتصوير الكالسيوم كفاءة الذكور C. ايليجانس هنا. وترد أيضا دراسات التعرض الذكور والغليسيرول وفرمون.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام رقاقة حاسة الشم تكييف موائع جزيئية لتصوير نشاط الخلايا العصبية في الرد على الفيرومونات في الذكور ايليجانس جيم رئيس الخلايا العصبية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استخدام مؤشرات الكالسيوم عزز إلى حد كبير فهمنا لديناميات العصبية والتنظيم. ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس، مع الجهاز العصبي تماما المعينة والتشريح شفافة، يقدم نموذجا مثاليا لفهم ديناميات العصبية في الوقت الحقيقي باستخدام مؤشرات الكالسيوم. في تركيبة مع التكنولوجيات موائع جزيئية وتصاميم تجريبية، يتم تنفيذ دراسات الكالسيوم-التصوير باستخدام هذه المؤشرات في الحيوانات التحرك الحر والمحاصرين. بيد أن معظم الدراسات السابقة استخدام الأجهزة الملائمة، مثل رقاقة حاسة الشم الموصوفة في Chronis et al.، الأجهزة المصممة للاستخدام في خنثي أكثر شيوعاً، كما ذكر أقل شيوعاً على حد سواء شكلياً وهيكليا متباينة. رقاقة إلكترونية حاسة الشم تكييف صمم وملفقة لزيادة الكفاءة في تصوير الخلايا العصبية الذكور مع استخدام الحيوانات البالغين الشباب. قد أدرجت بدوره الدودة تحميل المنفذ لتدوير الحيوانات والسماح لفصل الخلايا العصبية الفردية داخل زوج ثنائية في 2D التصوير. الديدان تتعرض لمراقبة تدفق الرائحة داخل الجهاز موائع جزيئية، كما هو مبين في الدراسات السابقة خنثي. ويتم تحليل العابرين الكالسيوم ثم استخدام البرمجيات المفتوحة المصدر إيماجيج. يجب السماح الإجراء الموضح هنا لزيادة كمية المستندة إلى ذكر C. ايليجانس الكالسيوم التصوير الدراسات، تعميق فهمنا لآليات الإشارات العصبية الخاصة بالجنس.
المقدمة
توفر أجهزة موائع جزيئية زيادة الوصول إلى البيئات التي تسيطر عليها تحديداً، حيث الحيوانات، مثل ديدان أسطوانية C. ايليجانس، يمكن أن يكون تجريبيا التلاعب1. وتشمل هذه الدراسات فحوصات السلوكية، ودراسات التصوير الكالسيوم، أو عروض حتى لتعمل محددة، أسفر عن قياسات أكثر دقة للنتائج التجريبية1،2،،من34، 5،6. ميكروفلويديكس توفير ظروف السائل صغيرة يمكن من خلالها تشغيل التجارب التفصيلية بينما تستخدم كميات ضئيلة من الكواشف. هناك إنتاج مستمر لتصميمات الجها....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-"تصنيع جهاز"
ملاحظة: انظر المرجع 1.
ملاحظة: قوالب السليكون الرئيسية كانت ملفقة استخدام تقنيات فوتوليثوغرفيك القياسية للزخرفة سو-8 مقاوم الضوء على سليكون رئيسي 1 ، 7. وطبعت فوتوماسكس للزخرفة ويفر على 25,000 نقطة في البوصة. تصميم الجهاز تتكيف مع ذكر ميزات شريحة حاسة الشم Chronis 19 مع تغيير في الدودة تحميل المنفذ، وتكييف تصميم التي تم الحصول عليها من م. زيمر (المراسلات الشخصية، 2016). ويرد بدوره للتحكم التناوب للحيوانات. هو تضييق عرض الدودة تحميل قناة الميناء إلى 50 ميكرومتر. جميع القنوات القامة 32 ميكر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مثال على إعداد الجهاز عموما يتبين في الشكل 1 ألف-باء. ويصور الشكل 1A تشييد خزان السليم والإعداد. ويبين الشكل 1B اتصالات الخزانات إلى الجهاز موائع جزيئية. ويصور الشكل 1 جهاز موائع جزيئية مع المنافذ الفردية المسمى للوضوح.
تصميم جهاز تكييف أنثى موائع جزيئية يحتوي على منحنى في ميناء التحميل، ولكن د.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
رقاقة حاسة الشم تتكيف مع ذكر يتضمن بدوره إلى ميناء تحميل أضيق، مما يسمح للمزيد من السيطرة التوجه وتعويض فعال للذكور C. ايليجانس. وهذا يسمح للتصور من كل من أعضاء اليسار واليمين من أزواج ثنائية الخلايا العصبية، دون الحاجة إلى التراص z. يؤدي هذا المنحنى إلى توجه بعيداً عن رأسي 100% من الوقت في الديدان حيث يستهدف زوج ثنائي واحد فقط مع علامة نيون، مثل الرماد (الشكل 2D-E)29،30. ولكن في فئات الخلايا العصبية مع الخل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
نود أن نشكر زيمر مانويل لتزويدنا بملف التصميم الأولية التي تم تكييفها للاستخدام مع الذكور؛ فرانك شرودر للتوليف وإمدادات من عسكر #3؛ لاجوي روس للبصيرة والمساعدة مع التصوير والتحليل؛ ولورا أوريليو لتصنيع الرئيسي ومنظمة الصحة العالمية، جنبا إلى جنب مع كريستوفر المشغلة، ساهمت في استعراض هذه المخطوطة. تم توفير التمويل لهذا العمل ضمن "المعاهد الوطنية للصحة" منحة 1R01DC016058-01 (ج. س.) ومنح المؤسسة الوطنية للعلوم كبة 1605679 (D.R.A.)، و "جائزة الوظيفي ويلكوم بوروز" في واجهة العلمية (D.R.A.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| رقاقة جامعة | السيليكون | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer | Mask CAD / Art | Services-طلب | مخصص. طبع بمعدل 25,000 نقطة في البوصة. |
| Sylgard-184 | Ellsworth المواد اللاصقة | 184 SIL ELAST KIT 0.5 كجم | |
| 1.0 مم Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| الأنابيب الناعمة | كول بالمر | EW-06419-01 | |
| الأنابيب الصلبة | IDEX الصحة & العلوم | 1622 | |
| دبابيس | نيو إنجلاند أنبوب صغير | NE-1027-12 | |
| دبابيس حجب نيو | إنجلاند أنبوب صغير | 0.415 / 0.425 "OD × .500 دفعة طويلة | PB07027 |
| 3 مل محاقن | BD | 309657 | |
| 30 مل محاقن | حيوية طبية | 302832 | تستخدم كخزانات عازلة. |
| المقاوم للصدأ إبرة حادة 23 مقياس، البولي بروليلين | Luer Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks مع وصلات Luer ؛ 3 اتجاهات ؛ قفل ذكر ؛ 5 نمط تدفق ؛ غير معقم | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest غطاء زجاجي | فيشر Scientific | 12-548-5M | |
| نظام التحكم مركاتور LF-5 نظام البلازما | مركاتور | LF-5 | |
| سكوتش الشريط | سكوتش | BSN43575 | |
| سلسلة 20 غرفة | وارنر إنسترومنتز | P-2 | |
| مجفف الفراغ | بيل آرت ساينسوير | 420250000 | 24 سم القطر الداخلي. |
| القوارب | كول بالمر | EW-01017-27 | |
| كلاسيك بلس بالانس | ميتلر توليدو | PB1501-S / FACT | |
| زجاج باستور ماصات | كول بالمر | EW-25554-06 | |
| نقل الماصات | جينيسي العلمية | 30-202 | |
| فرن | شيلدون التصنيع 9120993 | الموديل: 1500E. | |
| أطباق بتري 60 مم ، غير مهواة ، ذات حافة حادة | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss-Hammamatsu | ||
| Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| ضوء الفلورسنت الأزرق | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V / 7.9A DC. |
| محول الإضاءة | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 و 2 صمام عزل PTFE خامل مصغر | باركر | 001-0017-900 | صمام ثلاثي الاتجاهات للتحكم في التدفق. |
| ValveLink8.2 & reg ؛ | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro-Manager | Micro-Manager | مجانا ، على: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release | |
| ImageJ | ImageJ-Free ، ويمكن تنزيله على: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| Agar ، Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| بيبتون | أبيكس | 20-260 | |
| CaCl 2 < / sub> | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4< / sub> | Sigma-Aldrich | 230391-1 كجم | |
| كوليسترول | Alfa Aesar | A11470 | |
| الإيثانول | سيجما ألدريتش | 270741-4L | |
| تتراميسول | سيجما ألدريتش | L9756-10 (G) | تخزين في 4 درجات مئوية. |
| الفلوريسين | سيجما ألدريتش | FD2000S-250 مجم | حساس للضوء. تخزينها في قوارير واقية من الضوء. |
| الجلسرين | سيجما ألدريتش | G6279-1L | |
| الأسكاروسيد # 3 | - | تم تصنيعه في مختبر شرودر (جامعة كورنيل). | |
| كلوريد الصوديوم | جينيسي العلمي | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | JT Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | - | - | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). تم تطويره في مختبر Bargmann. مقدمة من مكتبة مختبر ألبريشت. |
| خط CEM GCaMP6 | - | JSR49 (FkEx98 [ppkd< / em>-2 :: GCaMP :: SL2: :d sRED + pBX-1] ؛ pha< / em>-1 (e2123ts) ؛ him < / em>-5 (e1490) ؛ lite< / em>-1 (ce314)). تم تطويره بواسطة Robyn Lints. مقدمة من مكتبة مختبر سرينيفاسان. | |
| E. القولوني< / em> (OP50) | Caenorhabditis< / em> مركز علم الوراثة | OP50 | |
| "الخزان" | - | لإنشاء خزان: "حقنة 30 مل" ، متصلة ب "محبس مع وصلات Luer ؛ 3 اتجاهات ؛ قفل ذكر ؛ 5 نمط تدفق ؛ غير معقم" ، متصل ب "حقنة 3 مل" و "إبرة حادة من الفولاذ المقاوم للصدأ 23 مقياسا ، بولي بروليلين لوير". ثم يتم إدخال "إبرة حادة من الفولاذ المقاوم للصدأ 23 مقياسا ، بولي بروليلين لوير" في "الأنابيب الناعمة" حوالي 1/3 من الطريق إلى أسفل الإبرة. |
المراجع
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
