الأصلي بول أكريلاميد هلام الكهربائي هو أداة أساسية لتحليل التفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين. تقليديا استخدمت معظم التجارب المواد الهلامية العمودية. ومع ذلك، توفر المواد الهلامية الأفقية العديد من المزايا، مثل فرصة لمراقبة المجمعات أثناء الكهربائي. نحن نقدم بروتوكول مفصل لتوليد واستخدام الأفقي هلام الأصلي الكهربائي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الأفقي جل الكهربائي للكشف عن تعزيز المجمعات البروتين رنا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بول أكريلاميد الأصلي الكهربائي هلام هو أداة أساسية من البيولوجيا الجزيئية التي استخدمت على نطاق واسع للتحليل البيوكيميائية للتفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين. وقد تم تحليل هذه التفاعلات تقليديا مع المواد الهلامية بولي أكريلاميد ولدت بين اثنين من لوحات الزجاج والعينات إليكتروفوريسد عموديا. ومع ذلك، المواد الهلامية بولكرلميد يلقي في الصواني و إليكتروفوريسد أفقيا يقدم العديد من المزايا. على سبيل المثال، المواد الهلامية الأفقية المستخدمة لتحليل المجمعات بين ركائز الفلورسنت رنا والبروتينات محددة يمكن تصوير عدة مرات كما تقدم الكهربائي. وهذا يوفر فرصة فريدة لرصد المجمعات رنا البروتين في عدة نقاط خلال التجربة. وبالإضافة إلى ذلك، الأفقي هلام الكهربائي يجعل من الممكن لتحليل العديد من العينات بالتوازي. وهذا يمكن أن يسهل كثيرا من التجارب بالطبع الوقت وكذلك تحليل ردود الفعل متعددة في وقت واحد لمقارنة المكونات والظروف المختلفة. هنا نحن بيأرأوفيد بروتوكول مفصلة لتوليد واستخدام الأفقي الكهربائي هلام الأصلي لتحليل التفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين.
المقدمة
وقد أثبتت مقايسات التحول التنقل الكهربي (إمساس) أن تكون أداة بيوكيميائية لا تقدر بثمن لتحليل تفاعلات حمض البروتين النووي محددة 1 ، 2 ، 3 . هذه المقايسات يمكن أن توفر معلومات هامة بشأن تقارب ملزمة من البروتينات إلى الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي 3 ، مكون الكيمياء المتفاعلة من المجمعات الحمض النووي البروتين 1 وتوفير رؤى جديدة هامة حول خصوصية ملزمة للبروتينات ملزمة رنا عبر التجارب المنافسة الركيزة 1 .
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد أفقي بولي أكريلاميد جل الأصلي 4 .
- إعداد المواد اللازمة.
- للحصول على جهاز هلام أفقي، استخدم مربع هلام (37 سم × 24 سم) مع 27 سم × 21 سم صينية والقدرة على اثنين من أمشاط 24 جيدا. يوفر هذا الإعداد ما مجموعه 48 العينات التي يمكن تحليلها في وقت واحد.
- إعداد الكواشف التالية: 40٪ الأكريلاميد-مكرر 19: 1، 5X تب (تريس-بورات-إدتا درجة الحموضة 8.0)، تيمد، و 10٪ أبس (ب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لإثبات قوة وبراعة الأفقي هلام الأصلي الكهربائي قمنا بتحليل ملزمة من القيطم بيكودال-C (Bicc1) البروتين إلى رنا فلورزنتلي المسمى يحتوي على موقع ملزمة Bicc1. البروتينات Bicc1 وظيفة كما مرنا القمعية متعدية محددة للسيطرة على قرارات مصير الخلية خلال مراحل الأمهات من التنمية الحيوانية 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، فضلا عن وظائف أج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
المواد الهلامية بولكرلميد الأصلية هي أداة لا تقدر بثمن للتحقيق التفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي وتقليديا هذه المواد الهلامية هي إليكتروفوريسد عموديا 2 ، 3 . لقد استخدمنا تعديل البروتوكول الذي يحل المواد الهلامية بولكرلميد الأم إنشاؤها و إليكتروفوريسد أفقيا 1 ، 4 ، 6 ، 7 ،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نشكر لورا فاندربلوغ لإعداد الأرقام. ويدعم العمل في المختبر صفائح من قبل جبهة الخلاص الوطني منحة 1050395 ومنح المعاهد الوطنية للصحة (R21HD076828). ويدعم العمل في مختبر رايدر من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01GM117237 و R01GM117008. ويدعم ميغان دودل من قبل زميد غرس فرصة متقدمة زمالة من خلال جامعة ويسكونسن ماديسون كلية الدراسات العليا وبرنامج التدريب على التكنولوجيا الحيوية من خلال المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة (T32GM008349).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| صندوق جل أفقي | OWL | N / A | لم يعد المنتج مصنوعا. يمكن العثور على علب هلام مماثلة في صناديق هلام Thermo Scientific ، من السلسلة A. رقم الكتالوج: A2-BP |
| 24 جيدا أمشاط الرحلان الكهربائي الأفقي | للهلام لم | المنتج مصنوعا. يمكن العثور على علب هلام مماثلة في أمشاط صندوق الهلام من السلسلة A-series من Thermo Scientific. رقم الكتالوج: A2-24C | |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II خلية الرحلان الكهربائي | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40٪ 19: 1 أكريلاميد / مكرر | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| الخميرة tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| الفلورسين المسمى RNA | IDT | N / A | الطلب حسب الطول والتسلسل المطلوب |
| EDTA ترع الصوديوم هيدرات | الملح Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultra Pure | US Biological | T8600 | |
| حمض البوريك | فيشر العلمي | BP168-500 | |
| كلوريد البوتاسيوم | فيشر العلمي | BP366-1 | |
| توين -20 | فيشر العلمي | BP337-500 | |
| DEPC | سيجما ألدريتش | 1609-47-8 | |
| ديثيوثريتول (DTT) | سيجما ألدريتش | 3483 12 3 | |
| ألبومين مصل البقر (BSA) | سيجما ألدريتش | 9048-46-8 |
المراجع
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacteri....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
