يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الأفقي جل الكهربائي للكشف عن تعزيز المجمعات البروتين رنا

11.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56031

⸱

يوليو 28, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomolecular Chemistry, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School

في هذه المقالة

ملخص

الأصلي بول أكريلاميد هلام الكهربائي هو أداة أساسية لتحليل التفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين. تقليديا استخدمت معظم التجارب المواد الهلامية العمودية. ومع ذلك، توفر المواد الهلامية الأفقية العديد من المزايا، مثل فرصة لمراقبة المجمعات أثناء الكهربائي. نحن نقدم بروتوكول مفصل لتوليد واستخدام الأفقي هلام الأصلي الكهربائي.

الملخص

بول أكريلاميد الأصلي الكهربائي هلام هو أداة أساسية من البيولوجيا الجزيئية التي استخدمت على نطاق واسع للتحليل البيوكيميائية للتفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين. وقد تم تحليل هذه التفاعلات تقليديا مع المواد الهلامية بولي أكريلاميد ولدت بين اثنين من لوحات الزجاج والعينات إليكتروفوريسد عموديا. ومع ذلك، المواد الهلامية بولكرلميد يلقي في الصواني و إليكتروفوريسد أفقيا يقدم العديد من المزايا. على سبيل المثال، المواد الهلامية الأفقية المستخدمة لتحليل المجمعات بين ركائز الفلورسنت رنا والبروتينات محددة يمكن تصوير عدة مرات كما تقدم الكهربائي. وهذا يوفر فرصة فريدة لرصد المجمعات رنا البروتين في عدة نقاط خلال التجربة. وبالإضافة إلى ذلك، الأفقي هلام الكهربائي يجعل من الممكن لتحليل العديد من العينات بالتوازي. وهذا يمكن أن يسهل كثيرا من التجارب بالطبع الوقت وكذلك تحليل ردود الفعل متعددة في وقت واحد لمقارنة المكونات والظروف المختلفة. هنا نحن بيأرأوفيد بروتوكول مفصلة لتوليد واستخدام الأفقي الكهربائي هلام الأصلي لتحليل التفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين.

المقدمة

وقد أثبتت مقايسات التحول التنقل الكهربي (إمساس) أن تكون أداة بيوكيميائية لا تقدر بثمن لتحليل تفاعلات حمض البروتين النووي محددة 1 ، 2 ، 3 . هذه المقايسات يمكن أن توفر معلومات هامة بشأن تقارب ملزمة من البروتينات إلى الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي 3 ، مكون الكيمياء المتفاعلة من المجمعات الحمض النووي البروتين 1 وتوفير رؤى جديدة هامة حول خصوصية ملزمة للبروتينات ملزمة رنا عبر التجارب المنافسة الركيزة 1 .

الإعداد التجريبي التقليدي لهذه المقايسات يتكون من خلط البروتين النقي مع راديولبلد رنا ركيزة. ثم يتم تحليل المجمعات الناتجة مع المواد الهلامية بوليكرلميد غير تغيير طبيعة (الأم) سكب بين اثنين من لوحات الزجاج تليها عينة الكهربائي في جهاز عمودي 3. في حين تم استخدام هذا النهج على نحو شامل لتوفير رؤى هامة في الآليات الكيميائية الحيوية التي تكمن وراء ارتباط البروتينات إلى الأحماض النووية، كما أن لديها العديد من القيود. على سبيل المثال، هذه الاستراتيجية الأساسية لديها منخفضة نسبيا الإنتاجية وأنها ليست قابلة للتكيف بسهولة للتطبيقات التي تتطلب تحليل العديد من ردود الفعل ملزمة في موازاة ذلك. وبالإضافة إلى ذلك، مع الجهاز الرأسي التقليدي فإنه من الصعب أن يحتمل رصد المجمعات في عدة مرات خلال الكهربائي 3 ، 4 .

هنا نقدم التكيف من الفحص إمزا الذي يستخدم المواد الهلامية بولي أكريلاميد الأم يلقي في جهاز مسطحة، الكهربائي الأفقي و فلورزنتلي المسمى ركائز رنا 4 ، 5 ، 6 ، 7 . دمج هذه التعديلات بسيطة نسبيا على سترا الأساسيةتيغي يوفر بعض المزايا القوية. على وجه الخصوص، فإن الشكل المسطح الأفقي بسهولة يفسح المجال لتحليل عشرات العينات في وقت واحد 4 . أيضا، بالنسبة لبعض المجمعات البروتين الحمض النووي الريبي، مثل تلك التي شكلت بين البروتين بيكودال-C والرنا الركيزة الكهربائي في هلام أفقي يوفر زيادة القدرة على حل المجمعات رنا البروتين متميزة وتمييز هذه من الركيزة رنا غير منضم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد أفقي بولي أكريلاميد جل الأصلي 4 .

  1. إعداد المواد اللازمة.
    1. للحصول على جهاز هلام أفقي، استخدم مربع هلام (37 سم × 24 سم) مع 27 سم × 21 سم صينية والقدرة على اثنين من أمشاط 24 جيدا. يوفر هذا الإعداد ما مجموعه 48 العينات التي يمكن تحليلها في وقت واحد.
    2. إعداد الكواشف التالية: 40٪ الأكريلاميد-مكرر 19: 1، 5X تب (تريس-بورات-إدتا درجة الحموضة 8.0)، تيمد، و 10٪ أبس (بيرسلفات الأمونيوم).
  2. جيل من 10٪ هلام الأكريلاميد الأصلي.
    1. في قارورة 500 مل، إضافة 80 مل من تب 5X، 100 مل من 40٪ الأكريلاميد، والماء إلى الحجم النهائي من 400 مل.
    2. إضافة 4 مل من 10٪ أبس و 400 ميكرولتر من تيمد. اخلط جيدا.
    3. صب المزيج في علبة صب الأفقية والسماح للهلام بلمرة لمدة 30 دقيقة. سوف يكون هلام حوالي 2 سم سميكة.
      ملاحظة: هلام يمكن أن يلقي في غطاء الدخان إلى سرعةحتى البلمرة. بعد البلمرة، سوف تبقى طبقة رقيقة من السائل على رأس هلام.
    4. صب السائل قبالة وشطف مع العازلة تشغيل. إزالة المشط (ق) بعناية وشطف الآبار مع العازلة تشغيل باستخدام حقنة.
  3. إعداد العازلة تشغيل.
    1. إعداد 2 لتر من 1X تب تشغيل عازلة لصندوق هلام. تمييع 400 مل من 5XTBE مع 1600 مل وخلط. مكان 1X تب العازلة في الغرفة الباردة لتبرد.
  4. قبل تشغيل هلام
    1. إضافة 2 لتر من العازلة تشغيل الباردة إلى مربع هلام وإدراج هلام.
    2. قبل تشغيل هلام في 120 V لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية في غرفة باردة. خلال هذا الوقت، وإعداد رد فعل ملزم.

2. ملزم رد فعل 8

  1. 2.1.إعداد مكونات التفاعل التالية.
    20 ملي دت
    10 ملي بسا
    10 ملي الحمض النووي الخميرة
    5X العازلة ملزمة (50 ملي هيبيس درجة الحموضة 8.0، 5 ملي إدتا، 250 ملي بوكل، 0.2٪ توين -20)
    100 نانومتر فلوريسئين المسمى الحمض النووي الريبي شراؤها تجاريا
    تتركز بيكودال-C البروتين
    50٪ الجلسرين في ديبك المعالجة H 2 O
    ديبك المعالجة H 2 O
  2. تجميع مكونات التفاعل ملزمة في أنبوب ميكروسنتريفوج الحرة ريبونوكلياز.
    1. إلى أنبوب، إضافة 5 ميكرولتر من 10 ملي بسا، 5 ميكرولتر من 20 ملي دت، 5 ميكرولتر من 10 ملي ترناس الخميرة، 10 ميكرولتر من 5X ملزمة ملزمة.
  3. إضافة البروتين إلى تركيز النهائي من 250 نانومتر في 50 ميكرولتر. إضافة الماء إلى حجم النهائي من 45 ميكرولتر.
  4. إضافة 5 ميكرولتر من فلورزنتلي المسمى رنا الركيزة. استخدام شراؤها تجاريا 3 'فلوريسئين المسمى 32 الركيزة النوكليوتيدات.
  5. مزيج واحتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

3. تحليل العينات على هلام بولي أكريلاميد الأفقي الأصلي

  1. لكل رد فعل، إضافة 15 ميكرولتر من الجلسرين 50٪ وتخلط بلطف.
  2. يتنبهلي إضافة 30 ميكرولتر من كل رد فعل على هلام. كمية العينة التي يمكن تحميلها في بئر واحد يختلف اعتمادا على سمك هلام وحجم الآبار. لدينا تحميل كميات أقل من 15 ميكرولتر وبقدر 45 ميكرولتر في بئر واحدة من المواد الهلامية التي تم إنشاؤها مع مشط 24 جيدا وسكب لسمك 2 سم.
  3. بعد توصيل إمدادات الطاقة إلى جهاز هلام التبديل على السلطة وضبط الجهد. تشغيل هلام في 4 درجات مئوية في 120 V.
    ملاحظة: لجهاز هلام الأفقي، وهذا ينتهي ما يقرب من 5 V / سم. لجهاز هلام العمودي، وهذا هو 16 V / سم.
    1. لمنع إتلاف أو تبييض رنا فلورزنتلي المسمى، إجراء الكهربائي في الظلام.
    2. تختلف أوقات الكهربائي اعتمادا على تفاصيل مجمع البروتين الحمض النووي الريبي يجري تحليلها.
      ملاحظة: وهناك ميزة رئيسية لتحليل إمزا الأفقي هو أن الكهربائي يمكن أن تتوقف، وتصوير هلام ومن ثم غيل يمكن وضعها مرة أخرى في الجهاز والالكهربائي يمكن أن تستمر لأوقات أطول.

4. تصوير جل

  1. إجراء التحليل مع أي أداة مصممة للكشف والتصوير ركائز الفلورسنت.
  2. وضع هلام على تصوير.
  3. ضبط إعدادات التصوير. لروابط فلوريسئين المسمى الحمض النووي الريبي، استخدم الإعدادات التالية: فام (الطول الموجي 473 نانومتر)، 750 المضاعف الجهد (بمت)، 100 ميكرون بكسل الحجم.
  4. مسح هلام لالتقاط الصورة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لإثبات قوة وبراعة الأفقي هلام الأصلي الكهربائي قمنا بتحليل ملزمة من القيطم بيكودال-C (Bicc1) البروتين إلى رنا فلورزنتلي المسمى يحتوي على موقع ملزمة Bicc1. البروتينات Bicc1 وظيفة كما مرنا القمعية متعدية محددة للسيطرة على قرارات مصير الخلية خلال مراحل الأمهات من التنمية الحيوانية 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، فضلا عن وظائف أج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

المواد الهلامية بولكرلميد الأصلية هي أداة لا تقدر بثمن للتحقيق التفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي وتقليديا هذه المواد الهلامية هي إليكتروفوريسد عموديا 2 ، 3 . لقد استخدمنا تعديل البروتوكول الذي يحل المواد الهلامية بولكرلميد الأم إنشاؤها و إليكتروفوريسد أفقيا 1 ، 4 ، 6 ، 7 ،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نشكر لورا فاندربلوغ لإعداد الأرقام. ويدعم العمل في المختبر صفائح من قبل جبهة الخلاص الوطني منحة 1050395 ومنح المعاهد الوطنية للصحة (R21HD076828). ويدعم العمل في مختبر رايدر من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01GM117237 و R01GM117008. ويدعم ميغان دودل من قبل زميد غرس فرصة متقدمة زمالة من خلال جامعة ويسكونسن ماديسون كلية الدراسات العليا وبرنامج التدريب على التكنولوجيا الحيوية من خلال المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة (T32GM008349).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
صندوق جل أفقيOWLN / Aلم يعد المنتج مصنوعا. يمكن العثور على علب هلام مماثلة في صناديق هلام Thermo Scientific ، من السلسلة A. رقم الكتالوج: A2-BP
24 جيدا أمشاط الرحلان الكهربائي الأفقيللهلام لمالمنتج مصنوعا. يمكن العثور على علب هلام مماثلة في أمشاط صندوق الهلام من السلسلة A-series من Thermo Scientific. رقم الكتالوج: A2-24C
Powerpac 300Bio-Rad1655050
Mini-Protean II خلية الرحلان الكهربائيBio-Rad165-2940
InstaPAGE-19 40٪ 19: 1 أكريلاميد / مكررIBIIB70015
TEMEDIBIIB70120
APSIBIIB70080
الخميرة tRNAsAmbionAM7119
الفلورسين المسمى RNAIDTN / Aالطلب حسب الطول والتسلسل المطلوب
EDTA ترع الصوديوم هيدراتالملح Sigma-AldrichE5391-1KG
HEPESSigma-AldrichH4034-500G
Tris Base Ultra PureUS BiologicalT8600
حمض البوريكفيشر العلميBP168-500
كلوريد البوتاسيومفيشر العلميBP366-1
توين -20فيشر العلميBP337-500
DEPCسيجما ألدريتش1609-47-8
ديثيوثريتول (DTT)سيجما ألدريتش3483 12 3
ألبومين مصل البقر (BSA)سيجما ألدريتش9048-46-8
الكبير يعد يمكن إجراء

المراجع

  1. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  2. Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
  5. Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
  6. Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
  7. Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
  8. Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
  9. Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386(2012).
  10. Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
  11. Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
  12. Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
  13. Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
  14. Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
  15. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
  16. Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

TBE
الأفقي جل الكهربائي للكشف عن تعزيز المجمعات البروتين رنا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.