مقالة منهجية

زرع الخلايا البدائية كريسبر/Cas9-تعتمد قفزات واسعة في النمو

7.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56035

⸱

فبراير 1, 2018

1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

في هذه المقالة

ملخص

الجينات الأساسية للبقاء على قيد الحياة تشكل عقبات تقنية لإنشاء خطوط المسخ. قفزات واسعة تلتف الفتك بالجمع بين الجينوم التحرير مع زرع الخلايا البدائية خلق الحيوانات البرية من نوع تحمل طفرات الخط. قفزات واسعة ويسمح أيضا بكفاءة توليد طفرات فارغة متماثل في الجيل1 و. ويتجلى هنا، خطوة الزرع.

الملخص

هو التعجيل بإنشاء خطوط متحولة عن طريق تحرير الجينوم التحليل الجيني في العديد من الكائنات الحية. أساليب كريسبر/Cas9 وقد تم تكييف للاستخدام في الضفدع المخالب الأفريقية، النمو، كائن طراز القديم للبحوث الطبية الحيوية. وقد نظم التربية التقليدية لخلق خطوط متحولة متماثل مع الطفرات كريسبر/Cas9--استهدفت عدة خطوات شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. تيسيرا تخليق أجنة متحولة، لا سيما التغلب على العقبات المرتبطة بانقطاع الجينات التي لا غنى عنها ل embryogenesis، وضعت طريقة جديدة تسمى قفزات واسعة. هذا الأسلوب روافع متانة النمو الأجنة "قص ولصق" أساليب الجنينية. قفزات واسعة يستخدم نقل الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) من الأجنة موتاجينيزيد كفاءة الجهات المانحة إلى الأخوة والأخوات أبلاتيد PGC wildtype. يسمح هذا الأسلوب للطفرة كفاءة الجينات الأساسية عن طريق إنشاء تشيميريك الحيوانات مع خلايا جسدية wildtype التي تحمل الفعل المسخ. عندما تقل اثنين من الحيوانات0 و "زرع قفز" هي إينتيركروسيد (أي، متحولة الخلايا الجرثومية)، وأنها تنتج متماثل، أو مجمع متخالف، فارغة و1 الأجنة، مما يوفر وقت جيل كامل للحصول على البيانات المظهرية. قفزات واسعة كما يوفر نهجاً جديداً لتحليل الجينات تأثير الأم، التي صهر لتحليل المظهرية0 و بعد الطفرات كريسبر/Cas9. هذه المخطوطة تفاصيل أسلوب القفزات، مع التركيز بوجه خاص على كيفية إجراء زرع PGC بنجاح.

المقدمة

وقد كيف بالنمط الوراثي ترميز النمط الظاهري مسألة رئيسية في علم الأحياء منذ إعادة اكتشاف قوانين مندل. فهم أدوار الجينات وتنظيمها والتفاعلات داخل شبكات الجينات، ووظائف المنتجات المشفرة بالوعود تقديم أدوات للكشف عن الأحياء الجديدة وتحسين المرض الدول. لأكثر من نصف قرن1، كان الضفدع الأفريقية المخالب، النمو، نموذجا رائدا للدراسات بشأن طائفة واسعة من المواضيع في البيولوجيا الأساسية والطب الحيوي، بما في ذلك عنصر التحكم الوراثي للتنمية. تاريخيا، استخدمت معظم البحوث بشأن النمو الضفدع اللوتيترابلويد، X. laevis، ولكن في الآونة الأخيرة، وضعت بسبب ما ديبلويدي، X. tropicalis كنموذج وراثية البرمائية. وقد تم تجميع تسلسل الجينوم الكامل من كل الأنواع النمو 2،3. "المجتمع الضفدع" الآن في نقطة تحول حيث تسمح تقنية تعديل الجينوم الأساسي دراسة وظيفة الجينات، وتقريبا في الإرادة. برمجة كريسبر/Cas9 اندونوكليسيس جعلت الطفرات الجينات ذات كفاءة عالية، مع الطفرة بياليليك ممكن في معظم الخلايا الحيوانية4،5،،من67، 8،9،،من1011. هذه الدراسات، وأبرز بهاتاشاريا et al. 12 وشيجيتا et al. 13، قد أظهرت أن الدالة العديد من الجينات يمكن أن يدرسها الطفرات في و0 فسيفساء الحيوانات. وهذا النهج له العديد من المزايا؛ ومع ذلك، عرض الأجنة Cas9-سجرنا-ميكروينجيكتيد غالباً ما تعمل متغير بسبب فقدان وظيفة (LOF) غير مكتملة. الأهم من ذلك، توليد خطوط متحولة مفيد جداً لبعض التطبيقات – وبخاصة عند دراسة الجينات التي لها مساهمة مرناً النفاسية. مرناس الأمهات والبروتينات، وتأثيراتها على التخلق، تستمر لفترة طويلة في امبريوجينيسيس14،،من1516، تقديم المساهمات الإنمائية المبكرة العديد من الجينات صهر للتحليلات و0 . ولذلك، نهج LOF أخرى مطلوبة.

عندما تسعى إلى إنشاء خطوط متحولة، والمسار للحصول على الأجنة LOF متماثل قد عدة عقبات. يمكن أن تكون الطفرات أولاً، تتسم بالكفاءة لإنتاج طفرات بياليليك غير ملائم نظراً لفقدان وظائف الجينات الأساسية يؤدي إلى الفشل في البقاء على قيد الحياة إلى مرحلة النضج الجنسي، تتداخل مع إنتاج خط قابلة للحياة. حل مشترك هو المعايرة الدقيق مقدار Cas9-سجرنا تسليمها. هنا، أن الهدف تحقيق توازن بين خفض الفتك مع تعظيم كفاءة الطفرات germline أيضا. ظهرت مشكلة ثانية من نظام تربية قياسية، حيث يتم تأجيل تحليلات المظهرية إلى الجيل2 و. استخدام النهج الموحدة، ناضجة جنسياً و0 الحيوانات التي تنقل المسخ الآليلات من خلال الخط يتم أووتكروسيد لإنتاج و1 متخالف "ناقلات"، التي تزرع ثم إلى مرحلة النضج الجنسي. ثم يتم إينتيركروسيد اثنين heterozygotes1 و إنتاج و2 أجنة المسخ في تردد مندلية المتوقعة بنسبة 25%. وهكذا، جيلين تربية ضرورية لتحليل تعمل المسخ. يمكن أن تكون الحيوانات المسخ homozygotes أو heterozygotes المركب (أي ذرية تحتوي على اثنين من الآليلات المختلفة المسخ، الذي يعتمد على الأنماط الجينية للحيوانات الأبوية المستخدمة في إينتيركروس1 و).

ويمكن التغلب على هذه العقبات بقصره للبرمجة نوكلاس بوساطة الطفرات في الخلايا الجرثومية، الذي يكمن وراء طريقة جديدة تسمى الوثب17. قفزات واسعة بعنصرين رئيسيين هما: (1) microinjection مرناً Cas جنبا إلى جنب مع سجرنا، أو مجمعات سجرنا nuclease (أو في مبدأ أو تالينس أو الزنك nucleases الإصبع) مرحلة وحيدة الخلية كفاءة موتاجينيزي الجينوم الجنينية، تليها (2) زرع بجكس إلى أجنة الأخوة wildtype، حيث أزيلت بجكس الذاتية. يمكن الحصول على كل الخطوات عند استبدال الخط كاملة، وكفاءة مع الخلايا الجرثومية المسخ. أظهر بلاكلير في أوائل الستينات أن يمكن زرع بجكس النمو بين الأجنة في نارولا الراحل وأوائل تايلبود مراحل18،19. للقفزات، تعديل النهج الذي بلاكلير بالقيام عمليات الزرع في مرحلة البلاستولا17، عندما يتم ترجمة بجكس في القطب فيجيتال20،الجنين21. وقد زرع قبل gastrulation اثنين من المزايا الرئيسية. أولاً، تم العثور على انجرافتمينت لعمليات زرع الأعضاء والتطور الطبيعي اللاحقة لتكون أكثر فعالية عندما يتم زرع الأعضاء في مرحلة البلاستولا (الملاحظات غير منشورة). ثانيا، عن طريق إجراء عمليات الزرع في مرحلة البلاستولا بعد وقت قصير من النسخ زيجوتيك وقد بدأ، واحد تجنب الفتك الناشئة عن الجينات الإنمائية الطفرات التي تعطل gastrulation أو خلاف ذلك يؤدي إلى تالف نارولا أواخر. وتزرع PGC الحاملة لزرع الأجنة ("تخطي") إلى مرحلة النضج الجنسي، وإينتيركروسيس بين هذه الحيوانات0 و قد أثبتت أنه في كثير من الحالات، عرض 100 ٪ ذرية1 و النمط الظاهري LOF (معظم يجري مجمع heterozygotes)، التي تشير إلى استبدال الخط كاملة مع التحولات المستهدفة.

ومن المتوقع أن القفزات سوف تعجل بالنهج الوراثية في النمو. قفزات واسعة كما يوفر بديلاً ل أسلوب "مضيفة نقل"22 لتحليل LOF للأمهات تأثير الجينات (الملاحظات غير منشورة). في المنشور الحالي، يرد وصف مفصل للطريقة، وتركز بصفة خاصة على زرع PGC، في X. tropicalis (مع تعديلات طفيفة ل X. laevis). ويتجلى زرع بجكس هنا لتسهيل نقل هذه التكنولوجيا أكثر سرعة إلى مختبرات أخرى تعمل مع النمو. ينبغي أن تكون مبادئ هذا الأسلوب الناجح في البرمائيات الأخرى (مثلاً، أوروديليس)، والتعديلات الخاصة بالكائن الحي في المنهجية التي ينبغي أن تسمح بالتطبيق للعديد من الحيوانات الأخرى التي يمكن تحقيق كفاءة الطفرات و بجكس سهولة الأولى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها لجنة الاستخدام من جامعة كاليفورنيا في إيرفين ورعاية الحيوان المؤسسية.

1-الأعمال التحضيرية لزرع PGC

  1. إعداد أدوات تشريح مسبقاً، كما هو موضح سابقا23.
    ملاحظة: يتم استخدام السكاكين شعر الحواجب جعل شقوق بالمساعدة من حلقة الشعر استقرار الجنين أثناء إجراء العمليات الجراحية. الشعر الحاجب والشعر الحلقات لصقها في زجاج البورسليكات باستور الممصات التي قد وضعت أولاً في لهب وكسر في الجزء ضعفت (انظر الشكل 1A، رأس السهم) لإنشاء تلميح أقصر وأضيق (الشكل 1B) لمهارة أكبر عند إجراء العمليات الجراحية.
  2. إنشاء سجرناس باستخدام الإجراءات الموصوفة سابقا24 .
    ملاحظة: بإيجاز، قصيرة الحمض النووي الترميز سجرناس يتم إنشاء قوالب باستخدام ديوكسيوليجونوكليوتيديس المتداخلة التي تحتوي على "ملء" و 5 ' عاثية T7 المروجين، التي هي تعتيق بوليميراز الدنا خالية من الأخطاء، والحرارة. في المختبر سجرنا التوليف التفاعلات هي المحتضنة لعدة ساعات بين عشية وضحاها (اعتماداً على عدة المستخدمة). ردود الفعل المعالجة الدناز لإزالة القالب. يتم تنقيته سجرناس بالأساليب القياسية للفينول/كلوروفورم الاستخراج والأمونيوم اسيتات/الايزوبروبانول هطول الأمطار، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة مجموعة24.
  3. قبل وقت قصير من أداء ميكروينجيكشنز، إعداد مجمعات سجرنا Cas9 بأول يشوه ~ 250 نانوغرام سجرنا في ميليلتر 3 إجمالي حجم رناسي خالية (المعالجة ديثيلبيروكاربوناتي) ح2س في 60-65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تليها التبريد السريع على الجليد لمدة 5 دقائق. الطرد المركزي في سجرنا لبضع ثوان وإضافة 1 ميليلتر من 1 ميكروغرام/ميليلتر Cas9 البروتين واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتعزيز تشكيل معقدة.
    ملاحظة: بعد هذا الاحتضان، الأنبوب يمكن الاحتفاظ على الجليد بينما كان يستعد الأجنة ل microinjection.
  4. الحصول على X. tropicalis الأجنة عن طريق الإخصاب في المختبر باستخدام الأساليب القياسية، كما هو موضح سابقا25. إزالة جيلي،من2526 الأجنة في إخصاب بعد 10 دقائق.
    ملاحظة: يعتبر وقت الإخصاب الوقت بعد تعليق الحيوانات المنوية إضافة للبيض والطبق طوفان 1/9thX مارك قارعو الأجراس تعديل (MMR)26. لإجراء X. tropicalis25، خلافا X. laevis، في جيليينج دي في 1/9 x MMR التي تحتوي على 3% سيستين مجاناً قاعدة (لا الملح HCl)، الأس الهيدروجيني تعديلها إلى 7.8-8.0، تليها يغسل المتعددة في 1/9 x MMR. نقل الأجنة إلى [اغروس] (1%)-طبق المغلفة التي تحتوي على 1/9 x MMR في درجة حرارة الغرفة.
  5. نقل الأجنة بالحقن لطبق [اغروس] المغلفة 1% الذي يحتوي على 1 على الفور x MMR باستخدام ماصة باستور.
  6. حقن في المرحلة 1-الخلية. راجع مراجع26،27 أوصاف مفصلة لأساليب microinjection النمو .
    1. حقن كل الأجنة في موقع واحد في القطب الحيواني، مع 4 nL مجمع Cas9-سجرنا (المبلغ النهائي = 1 نانوغرام Cas9 وجزء من الغرام ~ 250 من سجرنا؛ انظر المناقشة)24. بعد 10-20 دقيقة لحقن الموقع الشفاء، نقل الأجنة طبق [اغروس] المغلفة التي تحتوي على 1/9 x MMR واحتضان عند 25 درجة مئوية. أيضا إنشاء طبق من الأخوة أونينجيكتيد الأجنة التي ستكون بمثابة متلقي الاختلاس.
  7. إعداد لوحات بيتري (60 ملم) التي تحتوي على مم ~ 5-طبقة سميكة من 1% [اغروس] في 0.3 x MMR، إذا كان القيام بعمليات الزرع في X. tropicalis، أو 1 x MMR ل X. laevis.
    1. إنشاء المنخفضات ~ 3-4 مم العميقة بإدراج 3-x 4-البئر العفن (تم إنشاؤه عن طريق خفض صفيحة بكر 96-جيدا) في المنصهرة [اغروس] عند سكب اللوحات (انظر الشكل 1 و دال). عقد العفن عدة ملليمترات فوق الجزء السفلي من صحن بيتري استخدام المشبك تعلق على موقف خاتم حتى قد تصلب [اغروس].
    2. بالإضافة إلى ذلك، جعل لوحة 24-جيدا للأجنة الفردية بيت بطلاء الآبار مع طبقة رقيقة من 1% [اغروس] في 1/9 x MMR.
      ملاحظة: هو المتوسط الثقافة إضافة إلى هذه الآبار x 1/9 MMR تستكمل مع 50 ميكروغرام مع الجنتامايسين كبريتات/مل.

2-زرع بجكس

  1. عند الأجنة فقط الوصول إلى نيووكوب وإبر28 البلاستولا المرحلة 9 (الشكل 2A)، ح ~4.5 بعد الإخصاب (hpf) ل X. tropicalis، إزالتها من حاضنة 25 درجة مئوية، والسماح لهم بحجته إلى درجة حرارة غرفة إضافية ح 0.5.
  2. للبدء زرع 5 هبف (الشكل 2)، استخدم ماصة باستور نقل أحد الأجنة المانحة PGC (حقن Cas9-سجرنا) للطبق [اغروس] 60 ملم تحتوي على منخفضات (تم إنشاؤه في الخطوة 1، 7) في 0.3 x MMR (أو 1 x MMR في حالة استخدام X. laevis). كما نقل أحد الأخوة أونينجيكتيد الجنين، المستلم الاختلاس، لهذا الطبق.
    ملاحظة: من المهم أن لا يتم الخلط هويات كل من هذه الأجنة.
  3. يدوياً إزالة المغلفات فيتيلين من كل الأجنة باستخدام الملقط وتدوير كل الأجنة حيث تكون أقطاب فيجيتال بهم في العرض ويمكن الوصول إليها لإجراء عملية جراحية.
    ملاحظة: وصف فيتيلينيشن دي اليدوي من الأجنة قد سبق وصف26.
  4. استخدام تلميح حادة سكين الشعر الحاجب، جعل أربعة شقوق ضحلة على شكل مربع في القطب فيجيتال الجنين المتلقية، داخل المنطقة حيث سوف تشكل الخلايا زجاجة مستقبلا بوضع علامة بلاستوبوري. جعل الشقوق بإدراج غيض السكين شعر الحاجب في الجنين، فقط تحت السطح، وجعل التصاعدي تقطيع الحركات حين استقرار الجنين مع حلقة الشعر.
    ملاحظة: يبين الشكل 2 آراء نباتية للجنين على فترات التابع من 4.5 7.0 هبف لإظهار حجم الخلية وتوفير دليل لتقدير حيث ستشكل الخلايا الزجاجات (دائرة بيضاء متقطع). والهدف جعل شقوق حيث تتم الإشارة إلى مربع أسود متقطع.
  5. حالما يتم تحدد الجوانب الأربعة للمربع شقوق، تعميق كل شق بالسكين شعر الحاجب استخدام الاقتراحات قطع مماثلة للوصول إلى عمق من حوالي 1/3 إلى 1/2 المسافة إلى الكلمة blastocoel.
  6. مجاناً explant الأنسجة النباتية من الجنين المتلقية (الشكل 3 ألف و ب) بجعل أفقي (الموازية للسطح النباتي) cut(s) في منطقة نباتية عميقة.
    ملاحظة: هو حجم explant النباتية المحتوية على PGC حوالي 0.4-0.45 ملم من كل جانب و 0.25-0.3 ملم في العمق. لم يعد هناك حاجة هذا explant نباتية من الجنين المتلقي وينبغي لذلك جانبا لإهمالها.
  7. العمل بسرعة، كرر هذا الإجراء (خطوات 2.4-2.6) على الجنين PGC المانحين إنشاء جزء حجم وبالمثل أنسجة نباتية لزرع الأعضاء.
    ملاحظة: من المهم الاضطلاع بهذا التشريح الثاني مع القليل من التأخير لتقليل الوقت للجنين المتلقية للشفاء جرح مفتوح.
  8. حالما تتم إزالة الأنسجة التي تحتوي على بجكس من الأجنة المانحة، استخدام حلقة السكين وحلاقة الشعر الحاجب لنقل هذا اكسبلانت إلى الموقف في افتتاح إنشاؤها في الجنين المتلقية.
    ملاحظة: يجب أن تواجه السطح الداخلية للاختلاس المانحة الداخلية للجنين المتلقية. فإنه ليس من الضروري لمطابقة لتوجهات المحاور الظهرية البطني واليسار واليمين للاختلاس مع الجنين المتلقية.
  9. استخدام الحافة الطويلة رمح السكين شعر الحاجب، الذي عقد موازيا لسطح الابتزاز، لاضغط برفق الاختلاس في الافتتاح في السطح النباتي الجنين المتلقية.
  10. مرة واحدة وضعت الاختلاس، استخدام هايرلوب أو مدخل المنجم سكين شعر الحواجب للشريحة بلطف "الذبيحة" الجنين المانحة عبر السطح [اغروس] وإلى اكتئاب [اغروس]. تأكد من أن تواجه جرح مفتوح من الذبيحة السائل الأكبر. إذا لم يكن الأمر كذلك، استخدم السكين شعر الحواجب لتدوير الجنين إلى تحقيق هذا التوجه.
  11. الشريحة الجنين المتلقية، مع الاختلاس الشفاء في المكان، إلى اكتئاب المتاخمة وكذلك التأكد من أن تواجه الأنسجة المطعمة فيجيتال القطب السائل الأكبر.
  12. كرر هذا الإجراء (خطوات 2.1-2.11) باستخدام زوج آخر من البلدان المانحة والمتلقية من الأجنة لإنشاء زوج زرع/الذبيحة آخر؛ نقل هذه المنخفضات فارغة.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان واحد يجعل تدوينات لتعقب أزواج متماثلة من الذبائح والحاملة لزرع الأجنة. جيف المانحين ستستخدم كوكيل للكفاءة للطفرات التي يسببها سجرنا Cas9 في بجكس المزروعة، التي لا يمكن أن تكون بسهولة جزيئي حتى الحيوانات الحاملة لزرع تصل إلى مرحلة النضج الجنسي (راجع الخطوة 3-3، أدناه، و مناقشة ).
  13. مواصلة إجراء عمليات زرع الأعضاء حتى تصل الأجنة إلى مرحلة gastrula مبكرة حوالي 10، وهو ما يقرب من 6.5 هبف في X. tropicalis (انظر الشكل 2E).

3-بعد شفاء رعاية الأجنة

ملاحظة: شفاء الطعوم في مكانها داخل ~ 30 دقيقة، ومن الطبيعي أن نلاحظ بعض الحطام yolky من تحلل الخلية تنزح من الجنين (الشكل 3).

  1. عندما تلتئم، استخدام ماصة باستور إلى بلطف جداً نقل الأجنة من المنخفضات إلى الآبار الفردية من صفيحة 24-جيدا [اغروس] المغلفة. سوف تكون الإفرازات إزالتها (الشكل ثلاثي الأبعاد) بخلط أثناء النقل السوائل.
    1. قم بتدوير الأجنة حيث أن وضعها نباتية القطب حتى تواجه الحل الأكبر. مرة أخرى، ضع جيف المانحين و graft المستلمين في الآبار المجاورة للمساعدة في اقتفاء أثر أزواج الجنين؛ تسجيل هذه المعلومات.
  2. نقل لوحة 24-كذلك تحتوي على الأجنة لحاضنة 25 درجة مئوية للثقافة بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: في اليوم التالي، الأجنة سوف وصلت إلى مراحل تايلبود.
  3. نقل المستلمين الابتزاز لتنظيف لوحات 6-جيدا [اغروس] المغلفة التي تحتوي على 1/9 x MMR تستكمل مع 50 ميكروغرام مع الجنتامايسين كبريتات/مل، مع الجنين 1 كل بئر. الاحتفاظ بسجل واضح لجثث الجهات المانحة التي تطابق هذه graft المستلمين.
  4. لتقييم كفاءة الطفرات بتسلسل بكر أمبليكونس5،،من1724 أو باستخدام الأساليب الأخرى التي تعتمد على أمبليكونس بكر (انظر المناقشة)، نقل جثث الفردية إلى 0.2 مل PCR قطاع أنابيب. إزالة أكثر من المتوسط وتجانسه في تحلل 100 ميليلتر المخزن المؤقت24 تتضمن بروتيناز ك (PK) بتكرار بيبيتينج صعودا ونزولاً باستخدام ماصة P200.
  5. إجراء تحلل الجنين24 في 56 درجة مئوية ل 6 (ح) بين عشية وضحاها إلى تصريح الهضم PK. إلغاء تنشيط PK بتدفئة 90-95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، متبوعاً بالتبريد السريع إلى 4 درجات مئوية. استخدام ليساتيس دون مزيد من خطوات تنظيف للبذور PCR ردود الفعل للحصول على أمبليكونس قصيرة ل تسلسل "الحمض النووي سانجر" مباشرة24. تخزين ليساتيس في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: في غضون عدة أيام، سوف تصل إلى مراحل التغذية (المرحلة حوالي 45-46) الضفادع الصغيرة ويمكن تغذية تعليق مسحوق العوالق (الأمصال ميكرون).
  6. بعد أسبوع ~ 1، مع التغيرات اليومية للثقافة المتوسطة الحفاظ على نظافة والتقليل من فرط الميكروبية، نقل الضفادع الصغيرة إلى خزانات صغيرة في تعميم نظام المائية مع تدفق بالتنقيط. استخدام البيانات التسلسل لفصل الضفادع الصغيرة مع بجكس موتاجينيزيد عالية الكفاءة من الضفادع الصغيرة مع انخفاض كفاءة الطفرات. بمجرد اكتمال المسخ، نقل الضفيدعات نظام المائية الكبار في المختبر.
    ملاحظة: أنظمة وضعتها المورد النمو الوطني (مختبر البيولوجيا البحرية، وودز هول، ماجستير) تقديم دليل شرغوف التغذية29 والضفدع الكبار صيانة30.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عقب الزرع، ينبغي أن يجري تحديد النوعية لكفاءة الطفرات كريسبر/Cas9 قبل أنفاق الجهد في تربية الحيوانات على النمو والحفاظ على الحيوانات لمرحلة النضج الجنسي. لأن الحيوانات تحمل زرع قفز سوماتيكالي wildtype والفعل يصعب الوصول إليها للقياسات المباشرة، يصبح من المهم إنقاذ جثث الأجنة المانحة. تحليل الحمض النووي من جيف يعمل كوكيل لمدى الطفرات التي تحدث في زرع germline17.

يتمثل أحد النهج لتقييم نجاح الطفرات مباشرة ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويقدم هذا التقرير يستخدم بروتوكول مفصل لزرع الأنسجة النباتية التي تحتوي على بجكس-"زرع الأعضاء من بجكس" بالتزامن مع تحرير الجينوم التكنولوجيات (مثل، كريسبر/Cas9) لتعديل الفعل حيوان بينما الحفاظ على ما يقرب من جميع الأنسجة الجسدية، كنوع البرية وراثيا. لتجاوز المراحل لتكون ناجحة، هناك عدد من العوامل الحاسمة في الاعتبار قبل تنفيذ عمليات الزرع المنفذ.

لضمان الاستبدال الكامل للفعل مع الآليلات متحولة، من المستحسن واحدة أولاً يحدد الكفاءة في فيفو سجرناس. التجربة تشير إلى أن معظم سجرن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.

شكر وتقدير

أنجز هذا العمل بالدعم من منحة، 5R21HD080684-02، من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية. المؤلف يود أن يشكر شو كين للحماس المتواصل ودعمه. صاحب البلاغ أيضا تود أن تقر بلومبرغ بروس لاستخدام آلة التصوير، "ربيكا شارني"، لقراءة نقدية للمخطوطات، وشون مكنمارا ومارسين وليزلا في المورد النمو الوطني (RRID:SCR_013731)، لقيمة المحادثات المتعلقة بتغذية X. tropicalis ونظم الرعاية الحيوانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Dumont # 5 ملقطأدوات العلومالدقيقة 11252-20 أو 11252-30
سكينحلقة شعر
محلية الصنع
، زجاج البورسليكاتفيشر Scientific13-678-20A
غراء كرازي (قائم على السيانواكريلات) منتجاتElmer's ، Inc.KG581لتثبيت شعر الحاجب وحلقات الشعر في ماصات باستور ، يمكن استخدام مواد لاصقة أخرى مماثلة.
Oligodeoxynucleotides ، تقنياتالحمض النووي المتكاملةالطلبلتصنيع sgRNA ، انظر Nakayama et al. ، 2014 للحصول على تفاصيل التصميم.
مجموعة Megascript T7Ambion / ThermoFisherAM1334أو استخدم مجموعة Megashortscript T7 (AM1354)
Phenol ، Tris Bufferedالفينول المقطر عالي الجودة من أي مورد تجاري
الكلوروفورمكلوروفورم عالي الجودة من أي مورد تجاري
الإيثانولعالي الجودة من أي مورد تجاري
ثنائي إيثيل بيروكاربونات (DEPC) شركةسيجما للكيماوياتD5758-50ML
Cas9 بروتين ، مع إشارة توطين نوويةPNA Bio، Inc.CP01أعيد تشكيله باستخدام المياه المعالجة DEPC وفقا لتوصيات الشركة المصنعة
10X حلمن مارك محلي الصنع. الوصفة (المرجع 26) ل 1X MMR (تفتقر إلى EDTA) هي 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريد الكنتروجين ، 1 ملي ملي MgSO4 ، 2 ملي CaCl2 ، 5 ملي هيبس. يتم تعديل الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى 7.4.
Agaroseأي درجة بيولوجيا جزيئية من اللاغاروز كافية
60 × 15 مم صفائح بتريFalcon351007
24 بئراFalcon3047
L-CysteineSigma Chemical Co.C7352-100Gقاعدة مجانية ، وليس ملح حمض الهيدروكلوريك
بروتيناز KRoche03 115 828 001عادة ~ 20 مجم / مل من طعام Roche
sera Micronsera Tadpole. إعادة التعليق في وسط النمو. يمكن شراؤها من مجموعة متنوعة من تجار التجزئة عبر الإنترنت
شعر الحاجب محلية الصنع ماصات باستور المطلوبة حسب Ringers المعدل

المراجع

  1. Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
  2. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  3. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  4. Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
  5. Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  6. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
  7. Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15(2015).
  8. Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
  9. Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22(2016).
  10. Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
  11. Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
  12. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  13. Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
  14. Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148(2015).
  15. Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
  16. Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
  17. Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
  18. Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
  19. Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
  20. Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
  21. Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
  22. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
  23. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
  24. Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
  25. Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  27. Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
  28. Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
  29. Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
  30. Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
  31. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168(2014).
  32. Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
  33. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  34. Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157(2014).
  35. Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
  36. Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  37. Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
  38. Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861(2012).
  39. Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587(2015).
  40. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  41. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282(2014).
  42. Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
  43. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  44. Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
  45. Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
  46. Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRISPR Cas9 Xenopus Leapfrogging F1

مقالات ذات صلة