مقالة منهجية

استخدام في فيفو والأنسجة والخلايا Explant نهج لدراسة Morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والولادة

DOI:

10.3791/56039

⸱

سبتمبر 12, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكولات لدراسة الابهر مورين الجنينية والولادة باستخدام الاستنساخ في فيفو تحليل وتعيين مصير و explants الابهري العضلات الملساء المعزولة مفصلة الخلايا هنا. هذه النهوج المختلفة تسهيل التحقيق في morphogenesis الشريان الاورطي الجنينية والفترة المحيطة بالولادة في التطور الطبيعي والتسبب في المرض.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشريان الاورطي هو الشريان الأكبر في الجسم. ويتكون الجدار الابهري طبقة داخلية من خلايا بطانية وطبقة وسطى من التناوب lamellae مطاطا وخلايا العضلات الملساء (سمكس)، وطبقة خارجية الليفية والمصفوفة خارج الخلية. وعلى النقيض من هذه الدراسة على نطاق واسع من النماذج المرضية (مثل تصلب الشرايين) في الشريان الاورطي الكبار، أقل بكثير يعرف عن الشريان الاورطي الجنينية والفترة المحيطة بالولادة. وهنا، علينا أن نركز على سمكس وتوفر البروتوكولات لتحليل morphogenesis والمرضية سمكس الابهري الجنينية والفترة المحيطة بالولادة في التطور الطبيعي والمرض. على وجه التحديد، البروتوكولات الأربعة المدرجة: أنا) في فيفو مصير الجنينية رسم الخرائط والتحليل الاستنساخ؛ الثاني) الثقافة الشريان الاورطي الجنينية explant؛ ثالثا) SMC في معزل عن الشريان الاورطي الفترة المحيطة بالولادة؛ ورابعاً) وضع مضخة صغيرة ناضح تحت الجلد في الفئران الحوامل (أو غير حامل). وهكذا، هذه النهج تيسير التحقيق origin(s) ومصير، والاستنساخ بنية سمكس في الشريان الاورطي في فيفو. أنها تسمح لتحوير الشريان الاورطي الجنينية morphogenesis في الرحم بالتعرض المستمر لوكلاء الدوائية. وباﻹضافة إلى ذلك، explants الأنسجة الابهر معزولة أو سمكس الابهري يمكن استخدامها لاكتساب نظرة ثاقبة دور الجينات محددة الأهداف خلال العمليات الأساسية مثل موسكولاريزيشن، والانتشار، والهجرة. ثم يمكن تقييم هذه التجارب المدرة لفرضية سمكس معزولة والشريان الاورطي اكسبلانتيد في السياق في فيفو من خلال نهج الدوائي والوراثية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظم الدورة الدموية في الكائنات الحية متعددة الخلايا الدالة توصيل المواد الغذائية والأكسجين إلى الخلايا التي ليست على اتصال بالبيئة الخارجية، وإزالة الفضلات وثاني أكسيد الكربون من هذه الخلايا. في الفقاريات، يتكون نظام الدورة الدموية الأولية من القلب، وهي مضخات الدم من خلال سلسلة من الأوعية الدموية. جدران الأوعية الدموية الكبيرة، مثل الشرايين والاوردة، وتتألف من ثلاث طبقات: أنا) البطانية، أو الطبقة الداخلية من خلايا بطانية؛ ثانيا) وسائل الإعلام، أو طبقة وسطى من التناوب circumferentially ممدود خلايا العضلات الملساء سمكس ومطاطا lamellae؛ وثالثاً) الغلالة، أو الطبقة الخارجية من النسيج الضام والليفية. الغالبية العظمى من الدراسات في علم الأحياء والأوعية الدموية تركز على خلايا بطانية، التحقيق في تشكيل أنابيب مبطنة خلية بطانية جديدة عن طريق الأوعية. وفي المقابل، تلقي سمكس اهتماما ضئيلا نسبيا. ومع ذلك، يتم سمكس نوع خلية حاسمة في بناء الجدار الشرياني طبيعي وأمراض الأوعية الدموية.

الشريان الاورطي هو الشريان عيار أكبر في الجسم، وتلقى إخراج القلب من البطين الأيسر للقلب. هي تعاني من الأمراض البشرية المتنوعة، بما في ذلك تصلب الشرايين والأوعية الدموية، والتشريح. في الكائنات الحية الكبار، الشريان الاورطي وفروعه الرئيسية درس مكثف في نماذج أمراض الأوعية الدموية. على سبيل المثال، وضع حمية الدهون عالية تغذية الفئران التي تعتبر لاغية للجينات ترميز مستقبلات low-density lipoprotein أو الابوليبوبروتين ه، تصلب الشرايين، ومصير الأخيرة رسم خرائط الدراسات تشير إلى أن تثير سمكس موجودة مسبقاً إلى أنواع متعددة من الخلايا في لوحة تصلب الشرايين1. وتشمل التغييرات المرضية في تمدد الأوعية الدموية الابهري، المبرمج SMC والمصفوفة خارج الخلية إعادة عرض2،3.

من المعروف أقل بكثير فيما يتعلق بتصريح خاص morphogenesis والمرضية أثناء فترات الولادة والجنينية. هنا، نحن نقدم البروتوكولات لدراسة الجنينية والولادة الابهري سمكس في فيفو، في explants الأنسجة والخلايا المعزولة. على سبيل المثال، القسم الأول من البروتوكول يحدد مصير رسم الخرائط والتحليل الاستنساخ في الفئران الجنينية. Recombinase Cre أعرب تحت سيطرة أحد المروجين خلية محددة يسهل تمييز خلايا معينة وعلى ذرية4،،من56؛ مع ذلك، يمكن التحكم الزمني لوضع العلامات الخاصة بالخلية الصعبة خلال التطور الجنيني في الفئران. وفي هذا السياق، مع الأجنة معربا عن كرير الشرطي تحت مروج نشط في سمكس (e.g.,Myh11 أو Acta2)، وهو مراسل لجنة المساواة العرقية، نحن توفير أساليب للحقن تاموكسيفين أو في المستقلب النشط 4-OH-التاموكسيفين في السدود الحوامل ومن أجل تحليل الخلايا المسماة في الأجنة أو ذرية بعد الولادة. وعلاوة على ذلك، خلافا لمصير دراسات رسم الخرائط، التي يغلب عليها الطابع الاستفادة من الصحفيين لجنة المساواة العرقية مع مراسل واحد فلوروفوري1،7، إلى حد كبير هو تعزيز تحليل الاستنساخ مع الصحفيين Cre متعدد الألوان.

تصف الأجزاء الثانية والثالثة من البروتوكول الأساليب لعزل واستزراع explants الابهري الجنينية وسمكس الابهري من حديثي الولادة، على التوالي. تسمح هذه النهج للتلاعب بمسارات الإشارات، على وجه التحديد في الابهر explants أو سمكس، وتحليل الآثار المباشرة لوكلاء الدوائية. وهكذا، يمكن فحص دور جينات محددة في النسيج للفائدة بطريقة سريعة أكثر بكثير مما عن طريق التلاعب الوراثية التقليدية في الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، دراسات SMC معزولة تيسير تحليل الهجرة الخلية والالتصاق، ومن الناحية الفنية محدودة فيفو.

وأخيراً، يحدد القسم البروتوكول الرابع وضع مضخة صغيرة تحت الجلد ناضح محملة بوكلاء الدوائية في الفئران الحوامل (أو غير حامل). ويسهل هذا الأسلوب تحليل الأثر على التنمية الجنينية الناجمة عن العوامل التي تتطلب التسريب المستمر بسبب التمثيل الغذائي السريع. والبديل للحقن المتكرر ليس عمليا بالنسبة للعديد من العوامل وينبغي تجنبها، كما أنه قد يسبب مشقة كبيرة في السد حامل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع البروتوكولات الماوس تقرها لجنة الاستخدام في جامعة ييل ورعاية الحيوان المؤسسية.

1. تعيين مصير الجنينية في فيفو وتحليل الاستنساخ

ملاحظة: أننا استخدمنا هذه النهج على نطاق واسع لتقييم أصول الخلايا وعلى بنية الاستنساخ في نماذج التنمية والمرض 7 ، 8 ، 9 ، 10-

  1. إعداد التزاوج بين الفئران مع كرير والفئران مع مراسل Cre.
    ملاحظة: يتم استخدام كرير ل SMC الوسم؛ Myh11-CreERT2 أو Acta2-CreERT2 الفئران 11 ، 12 يستخدم عادة لهذا الغرض. وقد استخدمنا ROSA26R-CreERT2 الفئران 13 لوضع علامات على نطاق واسع على الأنسجة الجنينية.
    1. لتحليل الاستنساخ، استخدام متعدد ألوان Cre مراسل (مثلاً، قصاصات من الورق أو الفئران قوس قزح [م ع]) 8 ، ، من 14 15 ومصير رسم الخرائط، استخدام لون واحد مراسل لجنة المساواة العرقية (مثلاً، ROSA26R-يفب الفئران 16) أو المراسل Cre لون مزدوج ROSA26R-متوماتو-مجفب (متمج) 17-
      ملاحظة: يستخدم هذا المخطط تربية الفئران الكبار 2-6 أشهر من العمر (عادة ز ~ 30) وسوف تولد الأجنة مع كرير ومراسل Cre.
  2. التحقق من المقابس المهبلي في الصباح باستخدام معدن التحقيق والنظر بعد ظهر اليوم للكشف عن التوصيل كيوم الجنينية (ه) 0.5-
  3. فصل الإناث عن الذكور عند الكشف عن المكونات.
  4. تحضير 4-OH-تاموكسيفين وحلول العامل تاموكسيفين.
    1. على 4-OH-تاموكسيفين، يذوب 5 ملغ في 50 ميليلتر من 100% إيثانول، دوامة لمدة 2 دقيقة ثم قم بإضافة 450 ميليلتر من زيت الذرة. على الجليد، sonicate على مستوى الإخراج 2 لعشر دورات s مع الراحة بين الدورات حتى يبرد عينة. بعد أن عينة هو حل تماما (عادة ~ 4-5 دورات سونيكيشن) وتأخذ 200 ميليلتر لحل سونيكاتيد وتذوب في 1,800 ميليلتر من زيت الذرة لجعل الحل العامل النهائي (4-OH-تاموكسيفين، 1 ملغ/مل).
    2. على تاموكسيفين، تضعف إلى 50 ملغ/مل في الإيثانول 100% ودوامه حتى أنه يذوب. مخفف بزيت الذرة لجعل الحل العامل النهائي (تاموكسيفين، 10 ملغ/مل) وآثاره عند 45 درجة مئوية لضمان أن يتم حله تماما.
  5. لتحريض الجنينية المبكرة، حقن 4-OH-تاموكسيفين إينترابيريتونيلي في سد حوامل.
    1. استخدام حقن 4-OH-تاموكسيفين (يصل إلى 150 ~ ميكروغرام كل الحوامل الماوس، أو تقريبا 5 مغ/كغ وزن الجسم) في E5.5 وما بعدها كما أنها تسفر عن السد قابلة للحياة والأجنة الجراء.
    2. استخدام تاموكسيفين في جرعات 0.5-1.5 ملغ (أو 17-50 مغ/كغ) للحوامل مع الأجنة في السدود ~ E9 وما بعدها. استخدام إبرة ز 30 لحقن كل.
      ملاحظة: يستخدم الترشيح من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر عادة لتعقيم جميع المخاليط قبل الحقن.
  6. لتحليل الاستنساخ، استخدام الحقن داخل لجرعات عالية من 4-OH-تاموكسيفين (مثلاً، 5 مغ/كغ) أو تاموكسيفين (مثلاً، 50 مغ/كغ) وضع علامة على خلايا متعددة.
    1. لتمييز الخلايا الفردية، تيتراتي إلى أسفل جرعة 4-OH-تاموكسيفين أو تاموكسيفين بحيث أنه في النسيج للفائدة (أي الشريان الاورطي)، تقريبا جميع أجنة حلل (كما هو موضح أدناه في نهاية هذا القسم) لا الخلايا المسماة أو الخلايا فقط من لون واحد؛ هذا هو جرعة العتبة.
  7. لتمييز الخلايا في فترة منتصف أواخر الحمل وتتبع مصير أو كلوناليتي في الماوس بعد الولادة، وحقن البروجسترون داخل تجويف السد حامل متزامنا مع تاموكسيفين في 1:2 (البروجسترون: تاموكسيفين) نسبة الجرعة.
    ملاحظة: جرعة تاموكسيفين 17-50 مغ/كغ وجرعات البروجسترون 8.5-25 مغ/كغ (أي نصف جرعة تاموكسيفين). حقن البروجسترون قد يؤدي إلى تأخير العمل بأيام ~ 1-2-
  8. يوثانيزي السد الحوامل بأجنة السن المطلوب باستخدام أسلوب إسقاط مفتوحة، حيث يتم وضع السد في وعاء يحتوي على القطن أو الشاش غارقة مع إيسوفلوراني غير مخفف. تأكيد الوفاة عن طريق فتح تجويف الصدر للحث على استرواح الصدر، بإزالة الأعضاء الحيوية، و/أو عن طريق إجراء خلع عنق الرحم.
  9. تطهير البطن مع الإيثانول 70%. استخدام مقص لقص فتح البطن وتشريح خارج الرحم. إزالة الأجنة من الرحم وفصل الأجنة بعناية من المشيمة وكيس ألمح باستخدام الملقط.
  10. Euthanize الأجنة في E15 أو كبار السن عن طريق إجراء أما التفكك عنق الرحم أو قطع الرأس بالمقص الجراحي أو شفرة حادة.
    ملاحظة: أجنة أصغر سنا من E15 يموت سريعاً في أعقاب القتل الرحيم الأم و/أو إزالة الأجنة من الأم.
  11. وضع الأجنة في برنامج تلفزيوني المثلج وقطع قطعة صغيرة من الذيل باستخدام مقص للنمط الوراثي للمراسل كرير ولجنة المساواة العرقية.
  12. إصلاح الأجنة في بارافورمالدهيد 4% في 4 درجات مئوية عن 2 حاء يغسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني واحتضان ثم الأجنة في السكروز 30% في برنامج تلفزيوني في أنابيب 15 مل، الانتظار حتى أنها تغرق، الذي قد يستغرق مدة تصل إلى يومين.
    13. قوالب البلاستيك تعبئة
  13. التجميد تصل إلى 2/3 من الحد الأقصى لمستوى درجة الحرارة المثلى قطع (OCT) مجمع. ضع كل الجنين عمودياً في القالب، مغمورة تماما في أكتوبر الماضي إينكوباتي لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لتقليل فقاعات.
  14. مكان تجميد كتل الأنسجة تستقيم في ثلج الجاف، حمام الإيثانول 70% تجميد. تخزين الكتل في-80 درجة مئوية.
  15. تعيين درجة الحرارة كريوستات-22 درجة مئوية وقص كتل لإنشاء مقاطع عرضية عن طريق الشريان الاورطي كامل، 10-20 ميكرومتر سميكة. الجاف للشرائح على RT لمدة 30 دقيقة قبل تخزينها في-80 درجة مئوية.
  16. ذوبان الشرائح في الرايت، محمية من الضوء لتجنب وتبيض من فلوروفوريس. يغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني-Tween20 0.1%.
    1. لتحليل الاستنساخ، وصمة عار الشرائح لنوى (DAPI، 5 ملغ/مل) وصورة مباشرة أخرى فلوروفوريس في المراسل Cre قوس قزح (أزرق: الإثارة 433-نيوتن متر كحد أقصى، وشمال البحر الأبيض المتوسط-475 الانبعاثات ماكس؛ mOrange: 548 نانومتر، 562 نانومتر؛ متشيري: 587 نانومتر، 610 نيوتن متر).
      1. استخدام المرشحات التالية للكشف عن فلوروفوريس مع مجهر فلوري تستقيم: DAPI (الإثارة ماكس/عرض النطاق الترددي 350/50 نانومتر، nm الانبعاثات ماكس/عرض النطاق الترددي 460/50)، وأزرق (الإثارة 436/20 نانومتر، nm الانبعاثات 480/40)، ولاية تكساس الأحمر (الإثارة 560/ 40 نانومتر، nm الانبعاثات 630/75) وعامل تصفية مخصص لفصل متشيري عن مورانجي (الإثارة 577/10 نانومتر، الانبعاثات 630/50 nm).
    2. لمصير رسم الخرائط مع المراسل Cre متمج، الكشف عن التجارة والنقل (484 نانومتر، 510 نيوتن متر)، أما عن طريق التصوير مباشرة أو باستخدام إيمونوستاينينج. للتصوير مع مجهر فلوري تستقيم استخدام عامل تصفية التجارة والنقل (الإثارة 470/40 شمال البحر الأبيض المتوسط، وانبعاث 525/50 نانومتر).
    3. إيمونوستينينج، احتضان الأقسام مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وتغسل مع 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني واحتضان ثم مع الأجسام المضادة الثانوية حاء 1 استخدام مكافحة--CD31 (التركيز النهائي 0.0016 مغ/مل)، مكافحة-التجارة والنقل (0.006 ملغ/مل) و Cy3--مباشرة مترافق مكافحة-SMA (تمييع النهائي 1: 500) الابتدائي الأجسام المضادة واستخدام أنتيبودي الثانويةs مترافق مباشرة إلى فلوروفوريس (1: 500 تمييع النهائي) (انظر الجدول للمواد)-
  17. صورة الشرائح مع مجهر فلوري تستقيم (التكبير: 4 X-20 X) أو [كنفوكل] مجهر (10 X-63 X). للتكبير عالية، استخدام 63 تصوير [كنفوكل] × الهدف النفط مع فتحه عددية من 1.4-0.6 وحجم إطار بكسل 1,024 x 1,024-

2. Explant "الجنينية الشريان الاورطي الثقافة"

ملاحظة: هذا النهج كان يستخدم لتقييم دور beta3 إنتغرين في تضيق اكسبلانتيد جيش التحرير الوطني (-/-) الشريان الاورطي الجنينية 9 ، 18-

  1. euthanize سد في الوقت المناسب-حوامل في E15.5 باستنشاق isoflurane الزائدة، وفقا للخطوة 1.8، أعلاه.
  2. الحصاد و euthanize الأجنة، وفقا للخطوات 1-1، 9-10، أعلاه.
  3. وضع الجنين سوبينيلي ويعلقون أطرافه الموسعة للمجلس التشريح. تصور مع ستيريوسكوبي تشريح واستخدام مقص لقص شق عمودي من البطن عن طريق القص بالصدر العلوي. تشريح بعيداً الغدة الصعترية، القصبة الهوائية والرئتين والمريء، والكبد والأمعاء.
  4. بلطف سحب قلب بطنيا باستخدام الملقط واستخدام مقص تشريح الشريان الاورطي بعيداً عن الجانب الظهرية في تجاويف الصدر والبطن. لإطلاق سراح الشريان الاورطي، قطع عليه في جذر الدانية والبعيدة ومواقف البطن.
  5. مكان الشريان الاورطي في المثلج PBS العقيمة في غطاء ثقافة خلية. نقل الشريان الاورطي إلى لوحة 24-جيدا والثقافة في دميم مع 0.5% FBS لمدة تصل إلى 24 ساعة في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تكميل المتوسط الثقافة مع جسم حظر (مثلاً، مكافحة إنتغرين αvβ3 جسم في 0.02 مغ/مل 9؛ انظر الجدول للمواد) أو عامل الدوائي.
  6. أغسل الشريان الاورطي مرتين مع برنامج تلفزيوني ومن ثم إصلاحها مع بارافورمالدهيد 4% عن 20 دقيقة
  7. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ونقل الشريان الاورطي إلى أنبوب 1.5 مل مع 30% السكروز في برنامج تلفزيوني. بعد المصارف الشريان الاورطي، جعل كتل الأنسجة المجمدة وقطع المقاطع وإيمونوستاين، كما هو موضح في الخطوات 1، 1، 13-15، أعلاه.

3. SMC في معزل عن "الشريان الاورطي الفترة المحيطة بالولادة"

ملاحظة: هذا النهج يستخدم حاليا لمقارنة بيولوجيا سمكس الابهر معزولة من جيش التحرير الوطني (--/--) و wildtype الفئران فترة ما حول الولادة-

  1. يوثانيزي الفاري ألجرو في يوم ما بعد الولادة (ف) 0.5، أما بخلع عنق الرحم أو بقطع الرأس بالمقص الجراحي أو شفرة حادة، كما هو موضح في الخطوة 1، 10، أعلاه.
    2. نفذ الخطوة 2، 3
  2. وبعد ذلك، بعد فتح الصدر والبطن، ثقب البطين الأيسر مع إبرة ز 23. استخدام أنابيب بلاستيكية للاتصال الإبرة المحاقن المعقمة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني عقد عمودياً في وضع مرتفعة حيث أن برنامج تلفزيوني يتدفق في البطين الأيسر بالجاذبية. تسمح ضخ PBS العقيمة في البطين الأيسر حتى بلانتشيس الكبد.
    1. استخدام الملقط لإزالة الأنسجة أدفينتيتيال في الخارج من الشريان الاورطي وتشريح الشريان الاورطي كما هو موضح في الخطوة 2، 4-
  3. هضم الشريان الاورطي في حل واحد من دميم (500 ميليلتر) تستكمل مع 225 يو/مليلتر كولاجيناز و 2.25 يو/مليلتر elastase مضاد حيوي فطري لمدة 45 دقيقة في 37 درجة "جيم يدوياً" يهز 1 x الأنبوب كل دقيقة 5-10
  4. في الخلية العقيمة الثقافة هود، تيتوراتي الأنسجة هضمها من بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع ماصة 200 ميليلتر لتوليد تعليق خلية واحدة. نقل تعليق خلية واحدة إلى أنبوب 15 مل، وإضافة 2 مل دميم، والطرد المركزي في ز 920 x لمدة 5 دقائق في 25 درجة مئوية.
  5. تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 3 مل من SMC الثقافة المتوسطة (التي تحتوي على 10% FBS وتستكمل مع 10 ميكروغرام/مل رهيجف والبنسلين يو/مليلتر 100/ستربتوميسين، رهفجف 1 ميكروغرام/مل و 2.5 ميكروغرام/مل الامفوتريسين بدميم). نقل إلى لوحة ثقافة 35 ملم.
    ملاحظة: عند عزل الأولية، ~ 400,000 الخلايا يتم الحصول عليها من الابهر wildtype P0.5 واحد؛ ~ 300,000 من هذه الخلايا هي سمكس.
  6. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية وتغيير إلى متوسط الثقافة SMC جديدة كل 3 أيام. استخدام التقنيات القياسية مع التربسين، مرور الخلايا عندما المتلاقية. للتجارب، واستخدام خلايا من مقاطع من 3-7-

4. تحت الجلد ناضح مضخات صغيرة "الإيداع" في الحوامل (أو عدم الحوامل) الفئران

ملاحظة: هذا النهج كان يستخدم باستمرار تقديم عامل دوائية (مثل إنتغرين β3 و β5 المانع سيلينجيتيدي) للأجنة في الرحم 9. المضخة كان إدراجها في السد حامل في E13.5 وتحتفظ حتى الولادة.

  1. تخدير الفئران مع إيسوفلوراني 2-5 ٪ في الأكسجين (معدل التدفق من 1 لتر في الدقيقة) للاستقراء و 1-3% للصيانة. استخدم منعكس تو-قرصه لرصد مستوى التخدير، وضبط عامل مخدر حسب الحاجة. إدارة البوبرينورفين تحت الجلد (0.05-0.1 مغ/كغ) لتسكين.
  2. يحلق في أسفل الظهر مع لوس أنجليس كليبرز. استخدام الستائر العقيمة، والقفازات، والصكوك، والحفاظ على الفئران على لوحة تدفئة جراحية خلال عملية جراحية-
    3. ضع كل الماوس في موقف المعرضة
  3. وفرك ظهره مع تدين تليها كحول الأيزوبروبيل. حوالي 3-5 سم روسترال إلى قاعدة الذيل في أسفل الظهر، واستخدم مشرط جعل شق جلد أفقي 0.5-1.0 سم في الطول دون إصابة العضلات الأساسية-
  4. إدراج هيموستات في الشق وإنشاء جيب تحت الجلد روسترالي لغرس مضخة بفتح وإغلاق الفكين هيموستات.
  5. ملء مضخة صغيرة ناضح بعامل الاختيار، وفقا للشركة المصنعة ' s المبادئ التوجيهية (انظر الجدول للمواد). إدراج المضخة شغلها في الجيب وإغلاق الشق مع مقاطع أو خيوط غير الامتصاص 6-0. التأكد من أن الوقت الجراحي الكلي أقل من 10 دقيقة
  6. ، قد رصد الفئران كل 15 دقيقة حتى أنهم استعادوا من ريكومبينسي القصية. إدارة البوبرينورفين تحت الجلد (0.05-0.1 مغ/كغ) كل 6-12 ساعة في حالة ح 48. عند الفئران شفوا تماما من التخدير العام، رصد منها يوميا. إزالة القصاصات أو خيوط الجراحة بعد 7-10 أيام-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في تحليل الاستنساخ ممثل سمكس في المسخ الأجنة جيش التحرير الوطني (الجينات ترميز الايلاستين البروتين المصفوفة خارج الخلية)، جيش التحرير الوطني(+/-)، Acta2-كريرT2 الفئران كانت تزاوج للفئران جيش التحرير الوطني(+/-) يحمل أيضا متعدد الألوان ROSA26R(Rb/Rb) المراسل. كما هو موضح في الخطوة 1، تم التحقق من المقابس والسدود الحوامل كانت المستحث بحقنه واحدة تاموكسيفين (1.5 ملغ) في E12.5، وأنهم قد ضحى بها في E18.5. وكانت الأجنة الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على النقيض من تحقيقات واسعة النطاق في الشريان الاورطي موريني وفروعها الرئيسية في الحالات المرضية الكبار، مثل نماذج من تصلب الشرايين، المعروف أقل فيما يتعلق morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والفترة المحيطة بالولادة. هنا، علينا التركيز على الشريان الاورطي الجنينية/فترة ما حول الولادة، على وجه التحديد سمكس، وتوفير بروتوكولات لدراسة الشريان الاورطي من خلال في فيفو، explant الأنسجة، ونهج العزلة SMC. وتوفر هذه النهج مجانية المحقق بمختلف النهج لدراسة الشريان الاورطي الجنينية/فترة ما حول الولادة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر لي دين لمشاركة بروتوكول له المختبرات لعزل SMC الابهري. دعم التمويل كان المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R21NS088854، R01HL125815، و R01HL133016 إلى D.M.G)، "جمعية القلب الأمريكية" (معونات 14GRNT19990019 إلى D.M.G.)، وجامعة ييل (زمالة براون-كوكس صباحا وبدء التشغيل الأموال إلى D.M.G.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تاموكسيفينسيجماT5648
زيت الذرةسيجماC-8267مركبة للتاموكسيفين
4-OH-tamoxifenSigmaH7904المستقلب النشط للتاموكسيفين
البروجسترونسيجماP8783-5Gاستخدم بنصف تركيز مركب تاموكسيفين
OCTساكورا الأنسجة تيك4583لصنع كتل التبريد
CryomoldsPolysciences inc18986
DAPISigmaD9542تلطيخ IHC للنواة ، التركيز النهائي 5 مجم / مل
Cy3 مترافق مباشرة الأجسام المضادة لضمور العضلاتالشوكي SigmaA2547تلطيخ IHC من SMA ، التخفيف النهائي 1: 500
الجسم المضاد المضاد CD31BD Pharmingen550274تلطيخ IHC من GFP ، التركيز النهائي 0.006 مجم / مل
الأجسام المضادة المضادة ل GFPThermo Fisher ScientificA-11121تلطيخ IHC ل CD31 ، التركيز النهائي 0.0016 مجم / مل
الأجسام المضادة الثانوية للماعز المضادة للأرانب ، Alexa 647Life Technologiesa21244تلطيخ IHC ، التركيز النهائي 0.004 مجم / مل
الأجسام المضادة الثانوية للماعز المضادة للأرانب ، Alexa 488Life Technologiesa11008تلطيخ IHC ، التركيز النهائي 0.004 مجم / مل
DMEMثيرمو فيشر العلمي10567-014لزراعة الخلايا
FBSThermo Fisher Scientific10437028
الأجسام المضادة المضادة للانتجرين بيتا 3BD Biosciences553343استنساخ 2C9. G2 ، التركيز النهائي 0.02 مجم / مل
كولاجينازورثينجتون للكيمياء الحيوية44H14977Aلهضم الشريان الأورطي
ElastaseWorthington Biochemical Corp34K15139لهضم الشريان الأورطي
مضاد حيوي مضاد للفطريات (100X)Thermo Fisher Scientific15240062
مؤتلف بشري FGFPromegaG5071
مؤتلف الإنسان EGFPromegaG5021
البنسلين / الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل)ثيرمو فيشر العلمي15140122
الأمفوتريسين بثيرمو فيشر 15290026
الأنسجة العلمية لوحات زراعة الأنسجةCorningCLS430165
Alzet مضخة صغيرة بالتناضحDurect Corporation2001
ECLIPSE 80i تستقيم مجهر الفلورسنتنيكون 
  TCS  SP5Leica
برانسون سونيفاير 450VWR
Myh11-CreERT2 الفئرانمختبر جاكسون 19079
Acta2-CreERT2تم الحصول عليها من مختبر الدكتور بيير شامبون ودانيال ميتزجر
ROSA26R-CreERT2 الفئرانمختبر جاكسون 8463
ROSA26R(mTmG / mTmG) الفئرانمختبر جاكسون    026862
فئران ROSA26R(EYFP / EYFP)مختبر جاكسون   006148 
ROSA26R (قصاصات ورق / قصاصات ورقية) الفئرانمختبر جاكسون   ؛13731
مختبر الفئران ROSA26R (Rb / Rb)للدكتور إيرف وايزمانتم الحصول عليه من مختبر الدكتور إيرف وايزمان
فئران

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
  2. Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
  3. Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
  4. Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
  5. Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
  6. Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
  7. Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
  8. Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
  9. Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
  10. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
  11. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
  12. Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
  13. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  14. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  15. Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810(2014).
  16. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4(2001).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  18. Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
  19. Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
  20. Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
  21. Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
  22. Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
  23. Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
  24. Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
  25. Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
  26. Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
  27. Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
  28. Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
  29. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
  30. Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة