بروتوكولات لدراسة الابهر مورين الجنينية والولادة باستخدام الاستنساخ في فيفو تحليل وتعيين مصير و explants الابهري العضلات الملساء المعزولة مفصلة الخلايا هنا. هذه النهوج المختلفة تسهيل التحقيق في morphogenesis الشريان الاورطي الجنينية والفترة المحيطة بالولادة في التطور الطبيعي والتسبب في المرض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام في فيفو والأنسجة والخلايا Explant نهج لدراسة Morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والولادة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الشريان الاورطي هو الشريان الأكبر في الجسم. ويتكون الجدار الابهري طبقة داخلية من خلايا بطانية وطبقة وسطى من التناوب lamellae مطاطا وخلايا العضلات الملساء (سمكس)، وطبقة خارجية الليفية والمصفوفة خارج الخلية. وعلى النقيض من هذه الدراسة على نطاق واسع من النماذج المرضية (مثل تصلب الشرايين) في الشريان الاورطي الكبار، أقل بكثير يعرف عن الشريان الاورطي الجنينية والفترة المحيطة بالولادة. وهنا، علينا أن نركز على سمكس وتوفر البروتوكولات لتحليل morphogenesis والمرضية سمكس الابهري الجنينية والفترة المحيطة بالولادة في التطور الطبيعي والمرض. على وجه التحديد، البروتوكولات الأربعة المدرجة: أنا) في فيفو مصير الجنينية رسم الخرائط والتحليل الاستنساخ؛ الثاني) الثقافة الشريان الاورطي الجنينية explant؛ ثالثا) SMC في معزل عن الشريان الاورطي الفترة المحيطة بالولادة؛ ورابعاً) وضع مضخة صغيرة ناضح تحت الجلد في الفئران الحوامل (أو غير حامل). وهكذا، هذه النهج تيسير التحقيق origin(s) ومصير، والاستنساخ بنية سمكس في الشريان الاورطي في فيفو. أنها تسمح لتحوير الشريان الاورطي الجنينية morphogenesis في الرحم بالتعرض المستمر لوكلاء الدوائية. وباﻹضافة إلى ذلك، explants الأنسجة الابهر معزولة أو سمكس الابهري يمكن استخدامها لاكتساب نظرة ثاقبة دور الجينات محددة الأهداف خلال العمليات الأساسية مثل موسكولاريزيشن، والانتشار، والهجرة. ثم يمكن تقييم هذه التجارب المدرة لفرضية سمكس معزولة والشريان الاورطي اكسبلانتيد في السياق في فيفو من خلال نهج الدوائي والوراثية.
المقدمة
نظم الدورة الدموية في الكائنات الحية متعددة الخلايا الدالة توصيل المواد الغذائية والأكسجين إلى الخلايا التي ليست على اتصال بالبيئة الخارجية، وإزالة الفضلات وثاني أكسيد الكربون من هذه الخلايا. في الفقاريات، يتكون نظام الدورة الدموية الأولية من القلب، وهي مضخات الدم من خلال سلسلة من الأوعية الدموية. جدران الأوعية الدموية الكبيرة، مثل الشرايين والاوردة، وتتألف من ثلاث طبقات: أنا) البطانية، أو الطبقة الداخلية من خلايا بطانية؛ ثانيا) وسائل الإعلام، أو طبقة وسطى من التناوب circumferentially ممدود خلايا العضلات الملساء سمكس ومطاطا lamellae؛ وثالثاً) الغلالة، أو الطبقة الخارجية من النسيج الضام والليفية. الغالبية العظمى من الدراسات في علم الأحياء والأوعية الدموية تركز على خلاي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع البروتوكولات الماوس تقرها لجنة الاستخدام في جامعة ييل ورعاية الحيوان المؤسسية.
1. تعيين مصير الجنينية في فيفو وتحليل الاستنساخ
ملاحظة: أننا استخدمنا هذه النهج على نطاق واسع لتقييم أصول الخلايا وعلى بنية الاستنساخ في نماذج التنمية والمرض 7 ، 8 ، 9 ، 10-
- إعداد التزاوج بين الفئران مع كرير والفئران مع مراسل Cre.
ملاحظة: يتم استخدام كرير ل SMC الوسم؛ Myh11-CreERT2 أو Acta2-CreERT2 الفئران 11 ، 12
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في تحليل الاستنساخ ممثل سمكس في المسخ الأجنة جيش التحرير الوطني (الجينات ترميز الايلاستين البروتين المصفوفة خارج الخلية)، جيش التحرير الوطني(+/-)، Acta2-كريرT2 الفئران كانت تزاوج للفئران جيش التحرير الوطني(+/-) يحمل أيضا متعدد الألوان ROSA26R(Rb/Rb) المراسل. كما هو موضح في الخطوة 1، تم التحقق من المقابس والسدود الحوامل كانت المستحث بحقنه واحدة تاموكسيفين (1.5 ملغ) في E12.5، وأنهم قد ضحى بها في E18.5. وكانت الأجنة الم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على النقيض من تحقيقات واسعة النطاق في الشريان الاورطي موريني وفروعها الرئيسية في الحالات المرضية الكبار، مثل نماذج من تصلب الشرايين، المعروف أقل فيما يتعلق morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والفترة المحيطة بالولادة. هنا، علينا التركيز على الشريان الاورطي الجنينية/فترة ما حول الولادة، على وجه التحديد سمكس، وتوفير بروتوكولات لدراسة الشريان الاورطي من خلال في فيفو، explant الأنسجة، ونهج العزلة SMC. وتوفر هذه النهج مجانية المحقق بمختلف النهج لدراسة الشريان الاورطي الجنينية/فترة ما حول الولادة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونحن نشكر لي دين لمشاركة بروتوكول له المختبرات لعزل SMC الابهري. دعم التمويل كان المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R21NS088854، R01HL125815، و R01HL133016 إلى D.M.G)، "جمعية القلب الأمريكية" (معونات 14GRNT19990019 إلى D.M.G.)، وجامعة ييل (زمالة براون-كوكس صباحا وبدء التشغيل الأموال إلى D.M.G.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| تاموكسيفين | سيجما | T5648 | |
| زيت الذرة | سيجما | C-8267 | مركبة للتاموكسيفين |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | المستقلب النشط للتاموكسيفين |
| البروجسترون | سيجما | P8783-5G | استخدم بنصف تركيز مركب تاموكسيفين |
| OCT | ساكورا الأنسجة تيك | 4583 | لصنع كتل التبريد |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | تلطيخ IHC للنواة ، التركيز النهائي 5 مجم / مل |
| Cy3 مترافق مباشرة الأجسام المضادة لضمور العضلات | الشوكي Sigma | A2547 | تلطيخ IHC من SMA ، التخفيف النهائي 1: 500 |
| الجسم المضاد المضاد CD31 | BD Pharmingen | 550274 | تلطيخ IHC من GFP ، التركيز النهائي 0.006 مجم / مل |
| الأجسام المضادة المضادة ل GFP | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | تلطيخ IHC ل CD31 ، التركيز النهائي 0.0016 مجم / مل |
| الأجسام المضادة الثانوية للماعز المضادة للأرانب ، Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | تلطيخ IHC ، التركيز النهائي 0.004 مجم / مل |
| الأجسام المضادة الثانوية للماعز المضادة للأرانب ، Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | تلطيخ IHC ، التركيز النهائي 0.004 مجم / مل |
| DMEM | ثيرمو فيشر العلمي | 10567-014 | لزراعة الخلايا |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| الأجسام المضادة المضادة للانتجرين بيتا 3 | BD Biosciences | 553343 | استنساخ 2C9. G2 ، التركيز النهائي 0.02 مجم / مل |
| كولاجيناز | ورثينجتون للكيمياء الحيوية | 44H14977A | لهضم الشريان الأورطي |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | لهضم الشريان الأورطي |
| مضاد حيوي مضاد للفطريات (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| مؤتلف بشري FGF | Promega | G5071 | |
| مؤتلف الإنسان EGF | Promega | G5021 | |
| البنسلين / الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل) | ثيرمو فيشر العلمي | 15140122 | |
| الأمفوتريسين ب | ثيرمو فيشر 15290026 | ||
| الأنسجة العلمية لوحات زراعة الأنسجة | Corning | CLS430165 | |
| Alzet مضخة صغيرة بالتناضح | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i تستقيم مجهر الفلورسنت | نيكون | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| برانسون سونيفاير 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 الفئران | مختبر جاكسون | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 | تم الحصول عليها من مختبر الدكتور بيير شامبون ودانيال ميتزجر | ||
| ROSA26R-CreERT2 الفئران | مختبر جاكسون | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG / mTmG) الفئران | مختبر جاكسون | 026862 | |
| فئران ROSA26R(EYFP / EYFP) | مختبر جاكسون | 006148 | |
| ROSA26R (قصاصات ورق / قصاصات ورقية) الفئران | مختبر جاكسون ؛ | 13731 | |
| مختبر الفئران ROSA26R (Rb / Rb) | للدكتور إيرف وايزمان | تم الحصول عليه من مختبر الدكتور إيرف وايزمان |
المراجع
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smoo....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
