مقالة منهجية

يعيش تصوير خلايا قشرة الدماغ الأولية باستخدام نظام ثقافة 2D

DOI:

10.3791/56063

⸱

أغسطس 9, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصوير الحية أداة قوية لدراسة السلوكيات الخلوية في الوقت الحقيقي. هنا، نحن وصف بروتوكول للوقت الفاصل بين الفيديو-مجهرية من خلايا قشرة الدماغ الأولية التي تتيح دراسة تفصيلية لمراحل سنت خلال تطور النسب من الخلايا الجذعية العصبية الأولية للخلايا العصبية متمايزة وإطلاق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء تطوير قشرة الدماغ، تخضع الخلايا السلف عدة جولات من انقسامات الخلية المتماثلة وغير المتماثلة لتوليد جديدة موروث أو الخلايا العصبية بوستميتوتيك. في وقت لاحق، تبديل بعض فروعه لمصير جليوجينيك، إضافة إلى السكان أستروسيتي وأوليجوديندروسيتي. باستخدام الفيديو الفحص المجهري الوقت الفاصل بين الثقافات الخلية الأولية قشرة الدماغ، من الممكن لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية السيطرة على طريقة تقسيم الخلية ومعلمات دورة الخلية من الخلايا السلف. وبالمثل، يمكن دراسة مصير الخلايا بوستميتوتيك استخدام البروتينات مراسل الفلورسنت الخاصة بخلية أو ما بعد التصوير إيمونوسيتوتشيميستري. الأهم من ذلك، يمكن أن تحلل كل هذه الميزات على مستوى خلية واحدة، يسمح بتحديد المتكفل ملتزمة بتوليد أنواع معينة من الخلايا. يمكن أيضا إجراء التلاعب بالجينات باستخدام تعداء الفيروسية بوساطة، السماح بدراسة الظواهر خلية مستقلة وذاتية الحكم في الخلية. وأخيراً، يسمح استخدام البروتينات الفلورية الانصهار دراسة توزيع المتماثلة وغير المتماثلة للبروتينات المحددة خلال شعبة والترابط مع مصير الخلايا الوليدة. وهنا يصف لنا طريقة الفيديو-الفحص المجهري الوقت الفاصل بين الصورة موريني خلايا قشرة الدماغ الأولية لما يصل إلى عدة أيام وتحليل طريقة انقسام الخلية، وطول دورة الخلية ومصير الخلايا التي تم إنشاؤها حديثا. ونحن أيضا وصف أسلوب بسيط ترانسفيكت الخلايا السلف، والتي يمكن تطبيقها على التلاعب بالجينات للفائدة أو ببساطة قم بتسمية الخلايا التي تحتوي على بروتينات مراسل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توليد الخلايا الجذعية العصبية (مجلس الأمن القومي) من الخلايا العصبية والخلايا ماكروجليال أثناء تنمية قشرة الدماغ. في وقت مبكر-كورتيكوجينيسيس، الود الخضوع لعدة جولات من انقسام الخلايا المتماثلة، وتوسيع قاعدة السلف. ثم، تقسم الود دون تناسق لتوليد الخلايا العصبية مباشرة أو غير مباشرة من خلال وسيطة1. فقط في منتصف-للتأخر-كورتيكوجينيسيس، المتكفل التبديل إلى توليد astrocytes و oligodendrocytes2،،من34. ومع ذلك، تظل آليات كاملة التي تتحكم في تكاثر الخلايا والتمايز، فضلا عن مساهمة مقيدة بمصير المتكفل بتوليد أنواع فريدة من الخلايا العصبية أو خلايا ماكروجليال مثار نقاش مكثف4،،من56. إمكانات فردية الود القشرية لتوليد الخلايا العصبية وأستروسيتيس وأوليجوديندروسيتيس وقد درس على نطاق واسع في المختبر و في فيفو باستخدام مجموعة متنوعة تقنيات مثل: يعيش التصوير في الثقافات خلية واحدة7،8،9،10،11،،من1213؛ يعيش التصوير في ثقافات عالية الكثافة الثقافات3،،من1415؛ يعيش التصوير في شريحة الثقافات16،،من1718؛ تحليل الاستنساخ باستخدام الفيروسية بوساطة ناقلات الأمراض الوراثية وسم في ثقافات عالية الكثافة14،15،19،،من2021؛ تحليل الاستنساخ في فيفو استخدام لفي22،23،24،25،26،27،،من2829،30،31،،من3233؛ وتحليل الاستنساخ في فيفو استخدام الحيوانات المحورة وراثيا34.

ويقدم كل من هذه التقنيات الإيجابيات والسلبيات. على سبيل المثال، في فيفو تتبع النسب عرضه لفاعلين وتقسيم الأخطاء3، مما يؤدي إلى استنتاجات متضاربة حول إمكانية المتكفل القشرية الفردية. علاوة على ذلك، سواء الدراسات في المختبر و في فيفو تستند إلى العلامات من خلايا السلف في وقت مبكر-النقاط والتحليل اللاحق للأنساب الخلية قد تتأثر بحدوث موت الخلية أثناء تطور النسب35التي لم يتم كشفها. ولذلك، يجب أن تسمح نظام مناسب لتحليل إمكانات الود واحد تحديد كافة الخلايا التي تم إنشاؤها، وكذلك وصف مصائر خلية داخل النسب المناسبة. مزيج من الثقافة الخلية الأولية وتصوير مباشر يوفر هذا الإعداد. استخدام الثقافة وحيدة الخلية ومجهرية الفيديو الوقت الفاصل، أظهرت معبد et al. التبديل في نسب موروث الفردية قشرة الدماغ من الخلايا جليوجينيسيس11. في وقت لاحق، أنها تستخدم نفس النظام لإظهار أن يتم إنشاء أنواع مختلفة من الخلايا العصبية من السلف القشرية واحد12. ومع ذلك، يعرض هذا النظام تحذير هام: فقط 1% فروعه القشرية معزولة في وقت مبكر كورتيكوجينيسيس تولد الحيوانات المستنسخة من ذرية 4 أو أكثر9. بعد إضافة FGF2، زيادة تواتر خلايا توليد خلايا 4 أو أكثر إلى 8-10%9. ومع ذلك فإن هذا الرقم صغير جداً بالنظر إلى أن تقريبا جميع فروعه القشرية التكاثري في هذه المرحلة. وعلاوة على ذلك، لا يمكن استبعاد الآثار المحتملة ل FGF2 على مواصفات مصير36. للالتفاف على هذه القيود، استخدمنا الثقافات الخلية عالية الكثافة التي تدعم انتشار كل البطين (التعبير عن Pax6) وسوبفينتريكولار (التعبير عن Tbr2) المتكفل القشرية15. وعلاوة على ذلك، أظهرت المراقبة في الوقت الحقيقي من هذه الثقافات أن ترد العديد من الميزات لمجلس الأمن القومي نسب التقدم في ظل هذه الظروف، مثل وضع انقسام الخلية، وإطالة دورة الخلية، وإمكانات الخلايا المفردة لتوليد الخلايا العصبية وإطلاق، بين أمور أخرى3،15. في الآونة الأخيرة، استخدمنا أيضا هذا النظام لإظهار أن إشارات كريب يؤثر على بقاء الخلية من الخلايا العصبية في قشرة الدماغ غير ناضجة في الفئران37. وهكذا، ونحن نعتقد أن الوقت الفاصل بين الفيديو-الفحص المجهري لقشرة الدماغ موريني الابتدائي الخلايا التي تزرع بكثافة عالية أداة قوية ويمكن الوصول إليها لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية لتقدم دورة الخلية، ووضع شعبة الخلية وبقاء الخلية وتحديد مصير الخلية. هذا الأخير يمكن إنجاز باستخدام الحيوانات المحورة وراثيا، مما يتيح تحديد مصائر خلية معينة في الوقت الحقيقي38،،من3940 أو استخدام ما بعد التصوير إيمونوسيتوتشيميستري3،38،،من4142.

هنا، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لإعداد ثقافة الخلية قشرة الدماغ الأساسي دعم انتشار الود والجيل اللاحق من الخلايا العصبية والخلايا ماكروجليال. نناقش أيضا استخدام تعداء للفيروس بوساطة للتلاعب بالجينات للخلايا الفردية، التي يمكن تحديدها وتعقب على مستوى خلية واحدة باستخدام مجهر الفيديو الوقت الفاصل بين. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة خلايا قشرة الدماغ الأولية المعزولة من البداية إلى نهاية كورتيكوجينيسيس في القوارض، ولكن قد يلزم إدخال تعديلات قليلة وفقا للمرحلة14. الود المعزولة من مصادر أخرى يمكن أن تدرس أيضا استخدام الفحص المجهري الفيديو الوقت الفاصل بين الثقافات في 2D، ولكن ينبغي أن يحدده النظام تثقيف مناسب مقارنة الخلية السلوكيات في المختبر و في فيفو38،43.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إجراء جميع التجارب التي تنطوي على حية موصوفة في هذا البروتوكول وفقا للقوانين الوطنية والدولية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام بالجامعة المحلية (CEUA / UFRN) ، بموجب الترخيص 009/2014. يتم تنفيذ البروتوكول التالي في بيئة معقمة. من المتوقع الإلمام بزراعة الخلايا الأساسية.

< p class = "jove_title" >1. التشريح المجهري الظهري الجانبي

  1. تحضير وسط التشريح (100 مل): 98.5 مل محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ، 0.5 مل 5 م HEPES درجة الحموضة 7.4 ، 1 مل بنسلين / ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل و 10,000 ميكروغرام / مل
    2. ).
  2. قم بتصفية وتعقيم وسط التشريح.
  3. إزالة أجنة اليوم الجنيني 14 (E14) من فأر حامل C57 / Bl6 (Mus musculus) تحت التخدير مع isoflurane.
    ملاحظة: ضع في اعتبارك E0 كيوم اكتشاف السدادات المهبلية. يجب أن يكتمل التشريح في موعد لا يتجاوز 1 ساعة بعد إزالته من الفأر الحامل. ينطبق هذا البروتوكول أيضا على الأجنة E11-E17.
  4. إزالة الأجنة عن طريق استئصال الرحم في ظروف معقمة.
  5. انقل الأجنة إلى طبق بتري مع وسط تشريح بارد (4 درجات مئوية).
  6. قم بإزالة الأدمغة من الجمجمة عن طريق قطع الشق الطولي. عادة ما يتراوح عدد الأجنة من خمسة إلى عشرة. ينتج كل دماغ E14 ما يقرب من 2 × 106 خلايا ، بما في ذلك الأسلاف والخلايا العصبية بعد الانقسام (نسبة 1: 1) < br / > ملاحظة: استخدم المجهر المجسم للخطوات التالية.
  7. قم بإزالة السحايا باستخدام ملقط التشريح. قم بتقسيم telencephalon في المنتصف لفصل نصفي الكرة الأرضية. لعزل الدماغ الظهري الوحشي ، قم بقص المنحنى الظهري والحدود السطحية الفرعية باستخدام ملقط التشريح. انقل الدماغ الظهري الجانبي إلى أنبوب سعة 2 مل مع وسط تشريح بارد (4 درجات مئوية) حتى يتم تشريح جميع الأدمغة.
< p class = "jove_title" >2. تفكك الخلية والطلاء

  1. تحضير وسط التكاثر (50 مل من DMEM+ 10٪ FCS): 44 مل من Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) ، 5 مل مصل عجل الجنين (FCS) ، 0.5 مل 40٪ جلوكوز ، 0.5 مل بنسلين / ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل و 10,000 ميكروغرام / مل). تعقيم وسط الانتشار بتصفية
  2. تحضير وسط التمايز (50 مل من DMEM + 2٪ B27): 48 مل DMEM ، 1 مل B27 ، 0.5 مل 40٪ جلوكوز ، 0.5 مل بنسلين / ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل و 10,000 ميكروغرام / مل). تعقيم وسط التمايز بتصفية
  3. بعد التشريح الدقيق للدماغية الظهرية الجانبية من الفئران E14 ، قم بالطرد المركزي للأنبوب بالأنسجة المجمعة ووسط التشريح البارد (لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، 340 × جم) لترسيب الأنسجة.
  4. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة وأضف 1 مل من التربسين-EDTA الدافئ مسبقا (37 درجة مئوية) (0.05٪) للهضم الكيميائي. احتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أضف 2 مل من وسط التكاثر لإيقاف نشاط التربسين.
  5. قم بتلميع طرف ماصة باستور الزجاجية فوق موقد غاز أو موقد بنسن لبضع ثوان لتضييق الفتحة قليلا. اغسل الماصة عن طريق شفط FCS لتغطية طرفها. لتجنب الفقاعات ، قم بفصل الخلايا ميكانيكيا باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار ومغلفة ب FCS.
  6. الطرد المركزي للخلايا (لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، 340 × جم). قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة. أضف 1 مل من وسط التكاثر وأعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  7. قم بإعداد تخفيف 1: 1 لتعليق الخلية باستخدام محلول Trypan Blue بنسبة 0.4٪. ستكون الخلايا غير القابلة للحياة زرقاء. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة (غير الملوثة) باستخدام غرفة Neubauer.
  8. تمييع الخلايا في وسط التكاثر للحصول على 106 خلايا / مل. أضف 500 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كل بئر من صفيحة زراعة أنسجة 24 بئر (حوالي 2.5 × 105 خلايا / سم2). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    ملاحظة: لا تستخدم أغطية زجاجية ، حيث يمكن أن تتحرك أثناء التجربة وتغير مجال المراقبة. بدلا من ذلك ، استخدم ألواح زراعة الأنسجة ذات القاع الزجاجي.
    ملاحظة: إذا كنت لا تستخدم زراعة الخلايا المعالجة متعددة الأطباق، فمن المهم معالجة أطباقك مسبقا ب Poly-D-Lysin (50 ميكروغرام/مل) ساعتين عند 37 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >3. التعداء بوساطة الفيروسات القهقرية

ملاحظة: هذه طريقة بسيطة لنقل الخلايا السلفية فقط. ومع ذلك ، يمكن استخدام النواقل الفيروسية الأخرى أو التعداء الكيميائي / الكهربائي لإدخال الجينات ذات الأهمية في الخلايا المستنبتة.

  1. لمعالجة التعبير الجيني وتسمية الخلايا ببروتينات مراسل الفلورسنت ، أضف الفيروسات القهقرية التي تحمل البلازميدات ذات الجينات ذات الأهمية بعد ساعتين من طلاء الخلية.
    ملاحظة: تندمج نواقل الفيروسات القهقرية فقط في جينوم الخلايا المنقسمة. لذلك ، من المهم إصابة الخلايا عندما يكون التكاثر مرتفعا.
    ملاحظة: استخدمنا بلازميد يحتوي على تسلسل اندماج بيتا أكتين / CMV (CAG) وموقع دخول ريبوسومي داخلي (IRES) متبوعا بتسلسل الترميز لبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، المعين pCAG-IRES-GFP < فئة sup = "xref" >44. يمكن استنساخ الجينات ذات الأهمية بين مروج CAG وتسلسل IRES37.
  2. تمييع الفيروس القهقري في وسط التمايز للحصول على العدد المطلوب من الجسيمات لكل مل. أضف 500 ميكرولتر من وسط التمايز مع الفيروس القهقري إلى كل بئر.
    ملاحظة: تعتمد كمية الفيروسات القهقرية المستخدمة على عيرها ويجب حسابها للحصول على 50 إلى 100 خلية مصابة لكل بئر. يسمح هذا العيار بتحديد المستنسخة المعزولة التي تعبر عن GFP ، والتي يمكن تأكيد علاقتها بشكل أكبر عن طريق تتبع صور تباين الطور (انظر القسم 6). يجب إجراء معايرة الفيروس القهقرية باستخدام نفس مجموعة الخلايا< فئة sup = "xref">45.
< p class = "jove_title" >4. المجهر بالفيديو بفاصل زمني

ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة مجهر مضان مقلوب مع غرفة حضانة (انظر جدول المواد).

  1. بعد الإصابة بالفيروس القهقري ، ضع لوحة زراعة الأنسجة في حاضنة متصلة بدرجة الحرارة ووحدات التحكم في ثاني أكسيد الكربون.
    ملاحظة: يمكن أن يساعد التسخين المسبق للغرفة لمدة 3 ساعات قبل بدء التصوير في تقليل الانجراف وإلغاء التركيز البؤري أثناء الاستحواذ.
    ملاحظة: يجب أن تحافظ الغرفة على الخلايا في ظروف ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  2. حدد موضعا في المحور XY ليكون بمثابة نقطة صفر (XY = 0). سيسمح ذلك للإشارة بالعثور على المواضع مرة أخرى في المستقبل ، على سبيل المثال بعد الكيمياء المناعية بعد التصوير (انظر القسم 5).
    ملاحظة: ينصح برسم علامة في اللوحة يمكن استخدامها كمرجع لتحديد نقطة الصفر.
  3. حدد المواضع المراد تصويرها بتكبير 10X.
    ملاحظة: حدد 10-15 موضعا لكل بئر لزيادة احتمالية مراقبة الخلايا التي يتم نقلها بالفيروسات القهقرية.
    ملاحظة: يمكن استخدام أهداف التكبير العالي لمسافات طويلة (20X أو 40X) للحصول على صور عالية الدقة. اعتمادا على مسافة العمل للأهداف ، قد تكون هناك حاجة إلى ألواح ذات قاع زجاجي.
  4. احصل على صور تباين الطور كل 5 دقائق وصور مضان كل 3 ساعات لتقليل السمية الضوئية. تحقق من التركيز واضبطه في أول 3 ساعات من التجربة ، حيث قد يتغير أثناء توازن درجة الحرارة. تحقق من التركيز واضبطه يوميا.
    ملاحظة: نلاحظ أن التركيز يصبح مستقرا بعد أول 24 ساعة. ومع ذلك ، ينصح بمراقبة التركيز. بدلا من ذلك ، استخدم نظام ضبط تلقائي للصورة قائم على البرامج.
  5. بعد 7 أيام ، توقف عن الاستحواذ وانتقل إلى الكيمياء الخلوية المناعية بعد التصوير (انظر القسم 5).
  6. بعد الكيمياء المناعية ، استبدل اللوحة في حاضنة المجهر ، وابحث عن نقطة الصفر ، وأعد تعيين XYZ = 0 وأعد تحميل التجربة بالمواضع المحفوظة. احصل على صور مضان لكل موضع باستخدام مرشحات التألق المناسبة.
< p class = "jove_title" >5. الكيمياء المناعية بعد التصوير

  1. بعد 7 أيام في المزرعة ، قم بإصلاح مزرعة الخلية بمثبت 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    تنبيه: PFA سام ويجب التعامل معه في غطاء دخان كيميائي.
  2. اشطفه ب 0.5 مل PBS 0.1 M لمدة 5 دقائق.
  3. احتضان الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في 0.5٪ تريتون و 10٪ من مصل الماعز الطبيعي في PBS 0.1 M.
    ملاحظة: استخدم الجسم المضاد للبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2 (MAP2) لتأكيد النمط الظاهري العصبي (الفأر IgG1 ، 1: 1،000) ومضاد GFP لتسمية الخلايا المنقولة (الجسم المضاد للدجاج ، 1: 500). يمكن استخدام الأجسام المضادة الأخرى للكشف عن الخلايا السلفية أو الخلايا الدبقية.
  4. اشطفه ب 0.5 مل PBS 0.1 M لمدة 5 دقائق.
  5. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في 0.5٪ تريتون و 10٪ من مصل الماعز الطبيعي في PBS 0.1 M واحتضانها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. التخفيف الموصى به: 1: 1,000.
  6. اشطفه ب 0.5 مل PBS 0.1 M لمدة 5 دقائق.
  7. لتلطيخ النوى ، احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق باستخدام 0.1 ميكروغرام / مل 4′6′-diamino-2-phenylindone (DAPI) في PBS 0.1 M.
  8. اشطفه ب 0.5 مل PBS 0.1 M لمدة 5 دقائق.
  9. احتفظ بالخلايا في PBS 0.1 M واحميها من الضوء (على سبيل المثال ، لف اللوحة بورق الألمنيوم).

6. تتبع الخلية

ملاحظة: هنا ، نصف بإيجاز الخطوات الرئيسية لتحليل بيانات الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني باستخدام برنامج أداة التتبع (tTt) ، المتاح على الرابط الموجود في جدول المواد.

ملاحظة: إذا تم إجراء الحصول على الصورة باستخدام برنامج آخر، فقم باستيراد بيانات الصورة باستخدام محول tTt المتاح في مثبت tTt (الرابط متوفر في جدول المواد). يتم قبول تنسيقات الصور png أو tif أو jpg فقط. اتبع الخطوات الموضحة في <الفئة القوية = "xfig">الشكل 1 أ - ب بعد بدء تشغيل محول tTt.

  1. ابدأ تشغيل البرنامج tTt واختر اسم مستخدم. انقر فوق الزر "إضافة مستخدم" و "متابعة" (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2 أ). تصفح وحدد "TTTWorkFolder" (<الفئة القوية = "xfig">الشكل 2 ب). سيتم حفظ أشجار الأنساب والإحصائيات والصور المصدرة في هذا المجلد. بعد ذلك ، حدد التجربة المراد تحليلها وقم بتحميلها (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2 ب).
  2. إذا تم تحويل الصور مسبقا بواسطة tTt Converter ، فانقر فوق "LogFileConverter" (الشكل 3 أ) وحدد عدد الثواني بين نقطتين زمنيتين متتاليتين في نافذة LogFileConverter. انقر فوق "تحويل ملفات السجل للتجربة بأكملها" (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1C).
  3. في قائمة الصور التي تظهر في نافذة tTt ، حدد الصور المطلوبة التي يتم تحميلها يدويا أو باستخدام الخيار المعروض في البرنامج. تحميل الصور (<فئة قوية = "xfig">الشكل 3).
  4. حدد ملف > فتح مستعمرة جديدة >. انقر فوق "تتبع" ، متبوعا ب "بدء التتبع" لبدء التتبع في الموضع المختار.
  5. ستظهر نافذة فيلم (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 4). حدد الخلية باستخدام دائرة التتبع واضغط على المفتاح 0. سينتقل البرنامج إلى الإطار التالي. استمر في وضع دائرة التتبع حول الخلية التي تم تعقبها باستخدام الماوس وانقر فوق 0 في كل إطار لإضافة علامة تتبع على الخلية.
  6. استخدم المفتاحين 1 و3 للانتقال إلى الإطار السابق أو التالي، على التوالي. لحذف علامة المسار ، ما عليك سوى النقر فوق الموضع الصحيح لوضع علامة والضغط على 0.
  7. إذا كانت الخلية مقسمة ، فحدد الزر "تقسيم" (مستطيل أحمر عند <فئة قوية = "xfig" >الشكل 4). استمر في تتبع خلية ابنة واحدة بالضغط على Shift+D. لتعقب الخلية الفرعية الثانية، حددها في محرر الخلية واضغط على F2.
  8. إذا ماتت الخلية أثناء الفحص المجهري بالفيديو ، فحدد "موت الخلايا المبرمج" (مستطيل أزرق عند <فئة قوية = "xfig" >الشكل 4).
    ملاحظة: على الرغم من أن البرنامج يصنف الحدث على أنه "موت الخلايا المبرمج" ، إلا أن الآليات الأخرى قد تكون مسؤولة عن موت الخلية.
  9. إذا غادرت الخلية مجال الملاحظة أو اختلطت مع الخلايا المجاورة التي تمنع التتبع ، فحدد "مفقود" (مستطيل أخضر عند <فئة قوية = "xfig" >الشكل 4).
  10. لإيقاف التتبع والمتابعة لاحقا ، انقر فوق "مقاطعة" (مستطيل أرجواني عند <الفئة القوية = "xfig" >الشكل 4).
    ملاحظة: في نافذة محرر الخلية ، سيتم إنشاء شجرة أثناء التتبع. لحفظ شجرة النسب، حدد ملف > حفظ > شجرة الحالية (في نافذة محرر الخلية).
  11. لبدء تتبع خلية مختلفة ، انقر فوق الخلية باستخدام زر الماوس الأيمن أو حدد الخلية باستخدام زر الماوس الأيسر وانقر فوق التتبع > بدء التتبع.
  12. لتصدير الفيلم مع بيانات التتبع ، يجب ألا يكون البرنامج في "وضع التتبع". لإيقاف تشغيل وضع التتبع، قم بتنفيذ الخطوة 6.10. في نافذة الفيلم، حدد تصدير > الفيلم. قم بإعداد التنسيق ونطاق الإطارات وعدد الإطارات في الثانية ومعدل البت. انقر فوق "بدء التصدير".
< p class = "jove_title" >7. التقديرات الكمي

ملاحظة: يمكن إجراء العديد من القياسات باستخدام بيانات الفحص المجهري للفيديو< فئة sup = "xref">46. هنا ، نصف ثلاثة احتمالات يتم توضيحها لاحقا في قسم "النتائج التمثيلية".

  1. حدد بقاء الخلية لكل سلالة خلية عن طريق قسمة عدد الخلايا الحية في نقاط زمنية مختلفة على العدد الإجمالي للخلايا التي تم إنشاؤها قبل الوصول إلى هذه النقاط الزمنية داخل المستنسخة الفردية< فئة الدعم = "xref">37.
  2. حدد نسبة السلف المتماثل (SP ، تستمر كلتا الخليتين الوليدتين في التكاثر) ، أو غير المتماثل (A ، تستمر إحدى الخليتين الوليدة في التكاثر والأخرى تصبح بعد الانقسام) ، أو الطرف المتماثل (ST ، تصبح كلتا الخليتين الولديتين بعد الانقسام) < sup class = "xref" >15 ، < sup class = "xref" >38.
  3. قم بقياس طول دورة الخلية عن طريق حساب الفترة الزمنية للخلايا المتكاثرة بين توليدها وانقسامها< فئة sup = "xref">15.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحتوي الثقافات الأولية لخلايا القشرة الدماغية المعزولة من الأجنة E14 على كل من الخلايا السلفية والعصبية. خلال فترة التصوير ، يخضع الأسلاف لعدة جولات من انقسام الخلايا ، مما يزيد من عدد الخلايا (<فئة قوية = "xfig">الشكل 5 والفيديو الشكل 1).

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" > يسهل التعدي بوساطة الفيروسات القهقرية لعدد قليل من الخلايا السلفية تحديد استنساخ الخلايا (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 6). لاحظ أن تعبير GFP يمكن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مراقبة الوقت الحقيقي من خلايا قشرة الدماغ الأولية يسمح تحليل انتشار الخلايا، ووضع تقسيم الخلية وطول دورة الخلية، وتمايز خلية وخلية بقاء3،،من1415،37. الأهم من ذلك، أنها تسمح دراسة الأنساب خلية واحدة، مما يؤدي إلى تحديد المراحل المتوسطة التي سنت خلال التقدم من الود للخلايا العصبية3. وأخيراً، المزيج من هذا النظام الثقافة مع أدوات الهندسة الحيوية للتلاعب بالجينات تقنية قوية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل كان يدعمها المجلس (المجلس الوطني للتنمية Científico ه تكنولوجيا البحار)، الرؤوس (وكالة دي Coordenação دي فترة دي المستوى الأعلى) وفابيرن (Fundação de Amparo تفعل البحوث ريو غراندي دو نورتي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

محلول رابط برنامج

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الملح المتوازن من هانك (HBSS)إنفيتروجين لايف تكنولوجيز14175129
هيبسسيجما ألدريتشH3375-25G
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140122
دولبيكو متوسط النسر المعدل (DMEM)جيبكو12400-024
مصل عجل الجنين (FCS)جيبكو10437028
جلوكوزجيبكوA2494001
B27جيبكو17504044
تريبسين EDTA (0.05٪)جيبكو25300054
بارافورمالدهيدسيجما16005
مصل الماعزسيجما ألدريتش69023
تريتون X-100VWR الدولية المحدودة.306324N
IsofluraneSigma792632
anti-MAP2 ، ماوسSigmaM4403
مضاد للGFP الدجاجAves0511FP12
DAPISigmaD9542
الماعز المضاد للفأر Alexa 594InvitrogenA11005
الماعز المضاد للدجاج Alexa 488InvitrogenA11039
ImageJNIH
tTtETH زيورخ
خلية المراقب المجهرZeiss
Pasteur ماصة
PBS
التنزيل https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.htmlأداة التتبع (tTt)

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  2. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
  3. Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
  4. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  5. Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449(2015).
  6. Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76(2015).
  7. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
  8. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
  9. Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
  10. Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
  11. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
  12. Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
  13. Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
  14. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  15. Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
  16. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  17. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
  18. Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
  19. Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
  20. Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
  21. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
  22. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  23. Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
  24. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
  25. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
  26. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
  27. Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
  28. Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
  29. Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
  30. Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
  31. Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
  32. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  33. Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
  34. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  35. Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
  36. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
  37. Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
  38. Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
  39. Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
  40. Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
  41. Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
  42. Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
  43. Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
  44. Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
  45. Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
  46. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  47. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
  48. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة