Method Article

الفرز الفائق للإرث القائم على البروتين في سيريفيسيا س.

DOI:

10.3791/56069

⸱

August 8th, 2017

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول منهجية الفائق للشاشة وظيفيا للإرث القائم على البروتين في S. cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترميز المعلومات البيولوجية التي يمكن الوصول إليها لأجيال المستقبل عموما يتحقق عن طريق إدخال تغييرات على تسلسل الحمض النووي. الوراثة المعمرة المشفرة في البروتين المطابقة (بدلاً من تسلسل) منذ فترة طويلة وتعتبر تحول النموذج ولكن نادرة. أفضل الأمثلة تتسم هذه عناصر جينية هي البريونات، التي تمتلك سلوكاً ذاتيا تجميع التي يمكن أن تدفع بمظاهر جديدة تعمل الموروثة. البريونات التوراتية العديد من عرض تحيز تسلسل N/Q-الأغنياء ملفتة للنظر وتجميع في حظيرة اميلويد. وقد أبلغت هذه الميزات غير عادية معظم جهود الفحص لتحديد جديد بريون البروتينات. ومع ذلك، عدم إيواء ثلاثة على الأقل البريونات المعروفة (بما في ذلك بريون المؤسسين، الحزب الثوريSc) هذه الخصائص البيوكيميائية. ولذلك قمنا بتطوير أسلوب بديل للتحقيق في نطاق الإرث القائم على البروتين يستند إلى خاصية العمل الجماعي: overexpression عابرة من بروتينات بريون يزيد التردد الذي يحصلون تكيف قولبة المتمتعة بالحكم الذاتي. وتصف هذه الورقة أسلوباً لتحليل قدرة الخميرة أورفيومي للحصول على الإرث القائم على البروتين. باستخدام هذه الاستراتيجية، وجدنا سابقا أن > 1% بروتينات الخميرة يمكن أن تغذي ظهور الصفات البيولوجية التي كانت طويلة الأمد ومستقرة، وقد نشأ أكثر من الطفرات الوراثية. يمكن استخدام هذا النهج في إنتاجية عالية عبر أورفيوميس كامل أو كنموذج فحص المستهدف للشبكات الجينية المحددة أو المحفزات البيئية. مثلما شاشات الجينية إلى الأمام تعريف المسارات الإنمائية وإشارات عديدة، تقدم هذه التقنيات منهجية للتحقيق في تأثير الوراثة على أساس البروتين في العمليات البيولوجية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كثيرا ما تواجه النظم البيولوجية تقلبات عابرة في وفرة البروتين. لم يتضح ما إذا كانت هذه يكون لها تأثير دائم في تشكيل النمط الظاهري للكائن الحي أو للأجيال المقبلة. الحالات الأكثر شهرة من هذه الأحياء تشمل فئة نادرة من البروتينات، البريونات، التي تدفع ظهور السمات الموروثة دون تعديل الجينوم. بدلاً من ذلك، يحيل هذه الجسيمات فيكتيوس تيناسيوس و في بروتعمل عن طريق تغييرات مستديمة للبروتين المطابقة1،2. تم اكتشاف هذا النوع من الميراث كسبب لأنماط الإرث غير عادية من مرض الأعصاب المدمرة. ومع ذلك، أظهرت الدراسات في الكائنات الحية بدءاً من الفطريات للثدييات4،3،5،7،،من68،،من910 منذ ذلك الحين أن عناصر مثل بريون يمكن أن يضفي قيمة تكيفية. ومع ذلك، قد يعتبر البريونات رائعة لكنها نادرة غرائب البيولوجية.

ويعقد هذه الحكمة السائدة في الجزء لتوصيف الإرث القائم على البروتين طويلة قد تم تقييدها من قبل مجموعة صغيرة من الأمثلة. جهود الفحص المنهجي الأخيرة اتسعت هذه الصورة إلى حد كبير بتحديد عدة البريونات حسن النية الجديدة11 والبروتين تقريبا أربعة وعشرين المجالات12 مع القدرة على تحويل الوقود مثل بريون conformational. ومع ذلك، نظراً لأن هذه النهج قد تركز عموما على التحيزات القائمة على تسلسل الأحماض الأمينية القوية، البريونات التي تم اكتشافها تشترك في الخصائص البيوكيميائية للمؤسسين الخميرة البريونات [هذه المبادرة+]13،14و [URE3]15، و11،[RNQ+]16. وتشمل هذه: 1) وحدات المجالات التي هي غنية في البوليمر طويلة تمتد من الهليونين (N) والجلوتامين (Q)، 2) الجمعية إلى اميلويد [بريون+] تكيف17،،من1819، و 3) إكمال الاعتماد على ديساجريجاسي الدالة Hsp104 لإكثار المؤمنين من الأم إلى الابنة13،،من2021. والواقع أن الكثير من حسن النية البريونات، بما في ذلك [غار+]، [Het-s]، وحتى بريون الأصلي (PrPاتفاقية استكهولم)، سوف تضيع تحت هذه المعايير الصارمة. وربما الأهم من ذلك، أنهم سيكون غير قادر على التقاط أي آليات جديدة من الإرث القائم على البروتين22. وهكذا، قد يكون اتساع هذه الظواهر البيولوجية الحقيقية الآن أكثر شيوعاً في الطبيعة مما يفترض مسبقاً.

للتحقيق في هذه المسألة، كان يعمل في استراتيجية الفائق والبروتين على نطاق المنظومة. من السمات مميزة البريونات كافة، بما في ذلك الحزب الثورياتفاقية استكهولم، [غار+]، و [Het-s]، أن overexpression عابرة من البروتينات المسببة بشدة يزيد معدل بريون اقتناء15،،من2324،،من2526. وقد اتخذنا الاستفادة من هذه الميزة أن تسأل بشكل منهجي، عبر الكامل الخميرة أورفيومي، إذا كانت الدول المستندة إلى البروتين، وجينيه مستقرة يمكن الشروع في طريق عابر حمل overexpression البروتينات الفردية. ومن المعروف جيدا أن overexpression البروتين يمكن أن يغير تعمل27. ومع ذلك، بروتينات بريون غير عادية لعلى الإفراط في إنتاج مؤقت ينتج تغيير في النمط الظاهري هو الموروثة لعدة مئات من الأجيال بعد أوفيريكسبريشن الأولى. وقد لاحظنا سابقا الاستفادة من هذه الميزة، فضلا عن أنماط الإرث غير عادية من العناصر الوراثية المستندة إلى البروتين، التعرف على العشرات من البروتينات التي قادرة على هيريتابلي إعادة الأسلاك المظهرية المناظر الطبيعية دون تغيير الجينوم28. على الرغم من أن بعض التعرف على البروتينات كانت معروفة سابقا البريونات، معظم لم تكن، مما يؤكد قوة هذا النهج للكشف عن أشكال جديدة من الإرث القائم على البروتين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التعبير الزائد الأولي

  1. قم بتحويل خلايا الخميرة (في هذه الحالة ، BY4741 MAT a أحادي الصيغة الصبغية) المزروعة سابقا في سائل YPD (10 جم من مستخلص الخميرة ، و 20 جم من البيبتون ، و 20 جم من الجلوكوز لكل 1 لتر) مع التركيبات المرشحة المرغوبة من مكتبة FLEXGene ORFeome (ORFs الخميرة تحت سيطرة محفز محفز للجالاكتوز في العمود الفقري البلازميد المركزي الذي يحمل علامة URA3 ، pBY01129).
  2. استخدم أعواد الأسنان المعقمة لاختيار أربع مستعمرات منفصلة من هذه التحولات لتكون بمثابة مكررات بيولوجية. قم بزراعتها لمدة 48-72 ساعة في 150 ميكرولتر من SRaffinose-URA (0.74 جم من CSM-URA ، و 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ، و 20 جم من الرافينوز لكل 1 لتر) في 96 بئر من الأطباق. تلقيح المستعمرات من أول ORF في البئر A1 من جميع الألواح ، والمستعمرات من ORF الثاني في A2 من جميع اللوحات ، وما إلى ذلك <br / > ملاحظة: يتم إجراء جميع خطوات النمو عند 30 درجة مئوية وعند مستويات الغلاف الجوي لثاني أكسيد الكربون2 (407.05 جزء في المليون) ، ما لم ينص على خلاف ذلك.
  3. تأكد من أن الثقافات مشبعة (الخلايا المرئية بالعين في قاع كل بئر) واستخدم روبوت مناولة السوائل لتلقيح مصفوفة 1: 4 من 1 ميكرولتر من كل بئر 96 بئر في 4 آبار منفصلة من صفيحة 384 بئرا مملوءة ب 45 ميكرولتر من SGal-URA (0.74 جم من CSM-URA ، 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ، و 20 جم من الجالاكتوز لكل 1 لتر) لكل بئر.
    ملاحظة: يؤدي ذلك إلى إنشاء صفيحة مركبة يتم فيها ترتيب 4 مكررات بيولوجية لكل ORF في نمط مربع.
  4. في الوقت نفسه ، قم بإعداد ألواح منفصلة من 384 بئرا تحتوي على 45 ميكرولتر من SGal-URA مع الضغوطات ذات الأهمية (على سبيل المثال ، كلوريد المنغنيز عند 20 ملم) لكل بئر. تلقيح هذه اللوحة بنفس الطريقة كما في الخطوة 1.3.
    ملاحظة: لتحقيق أكبر نطاق ديناميكي للكشف عن النمط الظاهري ، يوصى باستخدام سلسلة تخفيف 2 أضعاف حول تركيز LD50 لضغط معين. يمكن القيام بذلك مسبقا لتحديد التركيز الأمثل الذي يمكن عنده مراقبة النمو المعزز والمخفيض.
  5. كعنصر تحكم متوازي نهائي ، قم بتلقيح صفيحة ثالثة مكونة من 384 بئرا بنفس الطريقة ، مع تضمين نفس الإجهاد في وسط لن يحفز التعبير عن البلازميد. تأكد من أن اللوحة تحتوي على 45 ميكرولتر من SD-URA (0.74 جم من CSM-URA ، و 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ، و 20 جم من الجلوكوز لكل 1 لتر) لكل بئر ويتم تلقيحها كما في الخطوتين 1.3 و 1.4.
  6. ضع اللوحات على الفور مع الخلايا على مكدس صفيحة دقيقة واضبط البروتوكول على حلقة مستمرة مدتها 72 ساعة ، وقياس OD600 باستخدام قارئ صفيحة دقيقة مزود بمكدسات في درجة حرارة الغرفة وثاني أكسيد الكربون2 في الغلاف الجوي (407.05 جزء في المليون).
    ملاحظة: يعتمد تكرار قياس النمو على عدد الصفائح (التي يتم تحديدها في النهاية من خلال عدد الجينات والظروف التي يريد الباحث استكشافها) المستخدمة في الجري. كلما زاد عدد اللوحات المستخدمة ، كلما استغرق قارئ اللوحة وقتا أطول لإكمال الحلقة وبالتالي زاد الوقت بين القياسات (وقت القياس لكل لوحة هو ~ 45 ثانية ، اعتمادا على الأجهزة المستخدمة).
  7. بعد قياسات النمو ، استخدم نفس روبوت مناولة السوائل لنقل 1 ميكرولتر لكل بئر من الثقافات التي يسببها SGal-URA (أي تلك التي عانت من الإفراط في التعبير عن البروتين) إلى ألواح جديدة مكونة من 384 بئرا تحتوي على 45 ميكرولتر من SD-URA لكل بئر (وسط لا يسمح بالتعبير البروتيني عن البلازميد).
    1. في موازاة ذلك ، قم بإجراء التطعيمات المماثلة لمجموعة ثانية من 384 بئرا تحتوي على 45 ميكرولتر من SD-URA لكل بئر من الثقافات التي نمت في SD-URA في وجود الضغوطات (أي تلك الموجودة في الخطوة 1.5).
    2. قم بزراعة الألواح لمدة 48 ساعة عند 30 درجة مئوية إلى التشبع في غرفة رطبة (أي صندوق بلاستيكي قابل للغلق مع منشفة ورقية مبللة بداخله).
  8. خذ الألواح من الخطوة السابقة وأعد تلقيح 1 ميكرولتر لكل بئر في ألواح 384 بئرا تحتوي على 45 ميكرولتر من SD-URA. بعد ذلك ، قم بإجراء إعادة تلقيح منفصلة بمقدار 1 ميكرولتر لكل بئر من نفس لوحة المصدر في صفيحة منفصلة مكونة من 384 بئرا تحتوي على 45 ميكرولتر من SD-URA مع عامل الإجهاد.
    ملاحظة: سيحدد هذا ما إذا كانت الأنماط الظاهرية للحساسية / المقاومة للضغط مستمرة بعد توقف الإفراط في التعبير عن البروتين.
  9. ضع اللوحات على الفور مع الخلايا على مكدس صفيحة دقيقة واضبط البروتوكول لحلقة مستمرة مدتها 48 ساعة تقيس OD600 باستخدام قارئ صفيحة دقيقة في درجة حرارة الغرفة وثاني أكسيد الكربون2 في الغلاف الجوي (407.05 جزء في المليون).
  10. تصدير الوقت مقابل قياسات OD600 كجدول XY باستخدام برنامج قارئ الألواح. تجميع أعمدة OD600 لكل بيولوجي يتم تكرارها معا وحساب المتوسط. قم بإنشاء مخطط XY للوقت مقابل OD600 لإنشاء منحنيات النمو.
    1. قارن معدلات نمو الثقافات التي تعرضت للإفراط في التعبير في الماضي (أي تلك التي تم إحداثها في الأصل في وسط يحتوي على الجالاكتوز قبل إعادة التلقيح في SD-URA) مقابل الثقافات التي لم تفعل (أي تلك التي انتشرت في الجلوكوز) ، كما هو موضح سابقا < فئة الدعم = "xref">30.
  11. بالنسبة للثقافات التي تظهر اختلافات كبيرة في النمو استجابة لضغط معين ، اعتمادا على الإفراط في التعبير عن بروتين الأجداد ، خذ 1 ميكرولتر من كل تكرار بيولوجي ، وقم بتخفيفه في 10 مل من الماء ، ثم صفيحة 50 ميكرولتر على ألواح تحتوي على 5-FOA (0.74 جم من CSM-URA ، 1 جم من 5-FOA ، 50 مجم من اليوراسيل ، 6.7 غرام من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ، و 20 جم من الجلوكوز ، و 20 جم من أجار لكل لتر). تنمو عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
    1. إذا أدى ذلك إلى عدد كبير جدا أو عدد قليل جدا من المستعمرات لكل طبق ، فاضبط عامل التخفيف وفقا لذلك.
      ملاحظة: يتم تحويل 5-FOA إلى وسيط سام عن طريق مسار التخليق الحيوي لليوراسيل. سيؤدي ذلك إلى فقدان البلازميد للتعبير الذي يحمل علامة URA3 الذي تم تحويله في الخطوة الأولى.
  12. اختر 8-32 مستعمرة مفردة باستخدام أعواد أسنان معقمة وقم بتثبيتها في ألواح 96 بئرا تحتوي على 150 ميكرولتر من SD-CSM. تنمو إلى التشبع لمدة 48-72 ساعة في غرفة مرطبة عند 30 درجة مئوية. استخدم هذه المزارع لتلقيح مجموعتين جديدتين من الألواح المكونة من 96 بئرا تحتوي على 150 ميكرولتر من SD-CSM ، مع وبدون الضغوطات من الخطوة 1.11.
  13. ضع اللوحات على مكدس صفيحة دقيقة واضبط البروتوكول لقياس OD600 على حلقة مستمرة مدتها 48 ساعة.
  14. قم بتحليل البيانات كما في الخطوة 1.10 وتأكد من الحفاظ على فروق النمو الكبيرة التي شوهدت في الخطوة 1.10 بعد فقدان البلازميد.
    ملاحظة: تحتوي هذه الخلايا على حالات نمطية مستقرة قد تكون مؤشرا على الوراثة القائمة على البروتين.
  15. اختبر الخلايا التي حافظت على الأنماط الظاهرية المستحثة للسمات المميزة الكلاسيكية للوراثة القائمة على البروتين (انظر أدناه).

2. اختبارات الميراث الشبيه بالبريون

  1. "علاج" بوساطة المرافق
    1. اختبار اعتماد المرافق Hsp104.
      1. اختر مستعمرة من سلالة الخميرة التي تؤوي حالة نمطية مستقرة ، وخط إلى مستعمرات مفردة على صفيحة YPD (10 جم من مستخلص الخميرة ، و 20 جم من البيبتون ، و 20 جم من الجلوكوز ، و 20 جم من أجار لكل 1 لتر) تحتوي على 3 ملي مولار GdnHCl وتنمو عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام. في موازاة ذلك ، قم بإخراج مستعمرة من سلالة ساذجة إلى مستعمرات مفردة على YPD + 3 mM GdnHCl كعنصر تحكم بنفس الطريقة.
      2. كرر مرتين أخريين على ألواح YPD الطازجة التي تحتوي على 3 ملي GdnHCl.
      3. نظرا لأن التعرض ل GdnHCl يمكن أن يزيد من وتيرة ظهور الخلايا الصغيرة ، فاختر مستعمرات متعددة خضعت ل 3 مقاطع على GdnHCl وتحقق من تنفس الميتوكوندريا الوظيفي من خلال فحص قدرتها على النمو إلى مستعمرات مرئية على ألواح YP-Glycerol (10 جم من مستخلص الخميرة ، و 20 جم من البيبتون ، و 20 مل من الجلسرين ، و 20 جم من الأجار لكل 1 لتر) بعد 7 أيام.
      4. اختر مستعمرات متعددة من ألواح YP-Glycerol واختبر الحفاظ على حالات النمط الظاهري المستقرة باستخدام النمو في وجود المجهد مقارنة بعناصر التحكم غير "المعالجة" والساذجة (أي الخلايا المتساوية المنشأ التي لا تؤوي حالة النمط الظاهري ، مثل BY4741 MATa أحادي الصيغة الصبغية) بطريقة مماثلة كما هو موضح في الخطوة 1.13.
    2. اختبار اعتماد مرافق Hsp70.
      1. "علاج" عن طريق البلازميد.
        1. قم بتحويل كل من الخلايا الساذجة والخلايا التي تؤوي حالات نمطية مستقرة باستخدام البلازميدات التي تحمل علامة URA3 التي تعبر عن أليل سلبي مهيمن ل Hsp70 (K69M) < sup class = "xref" >25،31 من محفز تأسيسي قوي (GPD).
        2. اختر محولات مفردة لكل منها ، خط إلى مستعمرات مفردة على لوحة SD-URA (0.74 جم من CSM-URA ، و 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ، و 20 جم من الجلوكوز ، و 20 جم من أجار لكل 1 لتر) ، وتنمو لمدة 3 أيام عند 30 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي2.
        3. كرر هذا المقطع مرتين أخريين على لوحات SD-URA.
        4. اختر مستعمرات متعددة وقم بربط مستعمرات مفردة على ألواح 5-FOA للتخلص من البلازميد.
        5. اختر عدة مستعمرات مفردة لكل عزلة واختبر الاحتفاظ (أو الفقدان) بحالات النمط الظاهري المستقرة بطريقة مماثلة كما هو موضح في الخطوة 1.13.
      2. "علاج" عن طريق العبور الجيني.
        1. عبر BY4741 MAT، سلالات أحادية الصيغة الصبغية تؤوي حالات نمطية مستقرة وسلالات ساذجة من نوع التزاوج المعاكس (في هذه الحالة ، BY4742 MATα) تؤوي عمليات حذف وراثية في اثنين من فقرات الخميرة الأربعة Hsp70 (ssa1Δ ssa2Δ).
          ملاحظة: هذه السلالة ناقصة في وظيفة مرافق Hsp70.
        2. حدد نمو ثنائيات الصبغيات عن طريق الخطوط إلى مستعمرات مفردة على SD-LYS-MET (0.74 جم من CSM-LYS-MET ، و 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ، و 20 جم من الجلوكوز ، و 20 جم من أجار لكل 1 لتر) وسط التسرب المزدوج.
        3. اختر مستعمرات ثنائية الصبغيات مفردة وتنمو لمدة 24 ساعة عند 30 درجة مئوية في 8 مل من وسط ما قبل التبويض (0.8٪ مستخلص الخميرة ، 0.3٪ بيبتون ، 10٪ سكر العنب ، و 100 مجم / لتر كبريتات الأدينين).
        4. قم بتدوير المزارع لمدة 3 دقائق عند 3,000 xg ، واستنشق وسط ما قبل التبويض (قبل SPO) ، واغسل الكريات مرة واحدة بالماء المعقم.
        5. أعد تعليق الكريات في 2 مل من وسط الأبواغ (1٪ أسيتات البوتاسيوم ، 0.1٪ مستخلص الخميرة ، 0.05٪ جلوكوز ، و 0.01٪ مزيج إضافي للأحماض الأمينية (2 جم من الهيستيدين ، 10 جم من الليوسين ، 2 جم من اليسين ، و 2 جم من اليوراسيل)). تنمو عند 25 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
        6. انقل المزارع إلى 30 درجة مئوية واحتضانها لمدة 48 ساعة إضافية.
        7. قم بتقييم كفاءة التبويض من خلال البحث عن وجود رباعي باستخدام المجهر الضوئي < فئة الدعم = "xref" >32.
        8. خذ 40 ميكرولتر من المزرعة ، وقم بالتدوير لمدة دقيقة واحدة عند 3,000 xg في أنبوب سعة 1.5 مل ، وأعد تعليقه في حجم متساو من مزيج إنزيم الزيمولياز (1 M sorbitol ، و 0.1 M EDTA ، و 10 مجم / مل زيموليازاز 100T)
        9. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
        10. ضع 10 ميكرولتر من المزرعة المهضومة على صفيحة أجار YPD جافة جدا ومستوية للغاية واسمح للثقافة بالانتشار ببطء أسفل اللوحة في خط مستقيم.
        11. اترك الألواح تجف لمدة 30 دقيقة على الأقل في غطاء التدفق الرقائقي.
        12. باستخدام مجهر تشريح ، افصل الجراثيم إلى رباعي وقم بترتيبها على اللوحة.
        13. اسمح للجراثيم أحادية الصيغة الصبغية الفردية بالنمو إلى مستعمرات واختبر قدرتها على النمو على SD-HIS-LEU (0.67 جم من CSM-HIS-LEU ، 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ، و 20 جم من الجلوكوز ، و 20 جم من الأجار لكل 1 لتر) ، مما يشير إلى أنها تحتوي على كلا الحذوفين الجينيين (ssa1Δ ssa2Δ).
        14. اختبار كل منها للحفاظ على حالة النمط الظاهري في خلفية Hsp70 الناقصة بطريقة مماثلة كما هو موضح في الخطوة 1.13.
          ملاحظة: يجب ألا يؤدي عبور هذه الجراثيم مرة أخرى إلى سلالة من النوع البري باستخدام وظيفة Hsp70 المستعادة إلى استعادة النمط الظاهري للبريون.
  2. اختبار الميراث غير المندلي.
    1. عبر BY4741 MATسلالات أحادية الصيغة الصبغية تؤوي حالات نمطية مستقرة وضوابط ساذجة متساوية الوراثة لسلالة ساذجة متساوية الجين من نوع التزاوج المعاكس (في هذه الحالة ، BY4742 MATα).
    2. حدد نمو ثنائي الصبغيات عن طريق الخطوط إلى مستعمرات مفردة على وسط التسرب المزدوج SD-LYS-MET.
    3. اختر مستعمرات ثنائية الصبغيات مفردة وتنمو لمدة 24 ساعة عند 30 درجة مئوية في 8 مل من وسط ما قبل التبويض.
    4. كرر الخطوات 2.2.2.3-2.2.2.12، كما هو موضح أعلاه.
    5. اسمح للجراثيم أحادية الصيغة الصبغية الفردية بالنمو إلى مستعمرات واختبر كل منها للحفاظ على حالة النمط الظاهري من خلال الانقسام الاختزالي باستخدام مقايسة النمو ، كما في الخطوة 1.13.
      ملاحظة: السمة المميزة الأخرى للبريونات هي أنه يمكن التخلص منها وراثيا من خلال إزالة البروتين العرضي الأصلي. وبالتالي ، فإن عبور سلالة البريون مع سلالة تؤوي الحذف الجيني للبروتين المستحث الأصلي سيؤدي إلى إلغاء الأنماط الظاهرية للبريون في الجراثيم التي ترث الحذف. لاحظ أيضا أنه من الممكن الحفاظ على البريون في حالة "خفيفة" في مثل هذا الطفرة إذا كان الجين المحذوف مطلوبا لإظهار النمط الظاهري للبريون ولكن ليس لنشر البريون نفسه. للتمييز بين هذين الاحتمالين ، اعبر الجراثيم مرة أخرى إلى سلالة من النوع البري الساذج واختبر ما إذا كان النمط الظاهري للبريون يظهر مرة أخرى في خلفية وراثية ثنائية الصبغيات ، حيث تمت استعادة وظيفة الجين.
  3. التنشئة الخلوية.
    1. قم بإنشاء سلالة مستلم BY4742 الأولية.
      1. من خلال التحويل ، أدخل أليل KAR معيبا (kar1-15) يمنع الاندماج النووي أثناء التزاوج < فئة الدعم = "xref">23.
      2. اجعل هذه السلالة "صغيرة" (أي غير كفؤة لتنفس الميتوكوندريا) عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة في مرق YPD ببروميد الإيثيديوم بنسبة 0.25٪.
      3. قم بزراعة المزرعة عند 30 درجة مئوية حتى المرحلة الأسية / الثابتة المتأخرة (OD600 ~ 1).
      4. خفف 1: 1,000 في YPD الطازج مع 0.25٪ بروميد الإيثيديوم وكرر مرتين.
      5. بمجرد أن تصل الثقافة إلى المرحلة الأسية المتأخرة / الثابتة المبكرة (OD600 0.8-1.2) ، صفيحة إلى مستعمرات مفردة عن طريق تخفيف 1: 10،000 في ماء معقم وطلاء 50 ميكرولتر على لوحة YPD. بعد النمو لمدة 3 أيام عند 30 درجة مئوية ، اختر مستعمرات متعددة واختبر كل منها لعدم كفاءة التنفس من خلال فحص قدرتها على النمو لتصبح مستعمرات مرئية على ألواح YP-Glycerol بعد 7 أيام.
    2. قم بإجراء الاستقراء الخلوي الأولي في BY4742.
      1. امزج خلايا السلالة المانحة BY4741 التي تؤوي حالة نمطية مستقرة مع خلايا سلالة المتلقي الساذجة BY4742 kar1-15 على سطح صفيحة أجار YPD.
      2. تنمو لمدة 24 ساعة عند 30 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي2 (407.05 جزء في المليون) ونقلها إلى وسط تسرب الميثيونين الذي يحتوي على الجلسرين (SGly-MET: 0.74 جم من CSM-MET ، 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ، 20 مل من الجلسرين ، و 20 جم من أجار لكل 1 لتر).
        ملاحظة: يختار هذا كلا من العلامات النووية BY4742 ، إلى جانب السماح باستعادة الميتوكوندريا الوظيفية عن طريق التبادل السيتوبلازمي.
      3. بعد 3-5 أيام ، اختر عدة مستعمرات مفردة وقم بإجراء جولة أخرى من الاختيار على SD-MET (0.74 جم من CSM-MET ، و 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ، و 20 جم من الجلوكوز ، و 20 جم من أجار لكل 1 لتر).
      4. في موازاة ذلك ، تأكد من أن المستعمرات ليست ثنائية الصبغيات من خلال المرور على وسيط SD-LYS-MET.
    3. إجراء عمليات التكوين الخلوي العكسي.
      1. امزج سلالات المتبرعين الجديدة (هذه المرة ، BY4742 kar1-15 الناجحة ، مقربات الخلايا الخلوية) مع خلايا BY4741 الساذجة الصغيرة (التي تم إنشاؤها على النحو الوارد أعلاه) على أجار YPD.
      2. كرر التكريات الخلوية ، كما هو موضح سابقا (الخطوات 2.3.2.1-2.3.2.4) ، باستثناء اختيار العلامات النووية المتلقية BY4741 على وسط الجلسرين الذي يفتقر إلى الليسين (SGly-LYS: 0.74 جم من CSM-LYS ، 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ، 20 مل من الجلسرين ، و 20 جم من أجار لكل 1 لتر).
      3. اختر العديد من المقربات الخلوية واختبر الحفاظ على حالات النمط الظاهري المستقرة باستخدام مقايسة النمو ، كما كان من قبل في الخطوة 1.13.
  4. تحول البروتين.
    1. تحضير المحلل.
      1. تنمو 50 مل من الخلايا التي تؤوي حالات نمطية مستقرة في YPD لمدة 18 ساعة عند 30 درجة مئوية.
      2. حبيبات المزارع على حرارة 3,000 × جم لمدة 4 دقائق ثم اغسلها مرتين: مرة في H2O المعقم ثم في 1 M sorbitol.
      3. أعد تعليق الخلايا في 200 مل من محلول SCE (1 M sorbitol ، 10 mM EDTA ، 10 ملي DTT ، 100 ملي سترات الصوديوم ، و 1 قرص مثبط للبروتياز خال من EDTA لكل 50 مل ، درجة الحموضة 5.8) مع 50 وحدة / مل من إنزيم الخميرة المحلل 100T.
      4. احتضن المزيج عند 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      5. قم بإجراء صوتنة للخلايا عند 20 كيلو هرتز وكثافة 20٪ لمدة 10 ثوان على الجليد باستخدام جهاز ثنائي صوتي.
      6. قم بإزالة بقايا الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      7. انقل المواد الطافية إلى أنبوب نظيف وأضف RNase I و DNase البيوتينيل بزيادة 3 أضعاف (كما تحددها وحدات النشاط) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      8. قم بإزالة DNase I عن طريق إضافة حبات الستربتافيدين الاغاروز الزائدة ، واحتضانها لمدة 5 دقائق ، والتكوير عن طريق الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 1.5 دقيقة.
      9. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
    2. تحضير الكروبلاستيدات المتلقية.
      1. تنمو 5 مل من الخلايا المتلقية الساذجة في YPD إلى منتصف المرحلة الأسية (OD600 تتراوح من 0.5-1).
      2. حصاد بالطرد المركزي (3,000 × جم لمدة 4 دقائق) واغسلها 4 مرات: مرتين في H2O ومرتين في 1 M سوربيتول.
      3. أعد تعليق الخلايا في 1 M sorbitol الذي يحتوي على 200 U / mL إنزيم حالل خميرة واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند 35 درجة مئوية لهضم جدران الخلايا.
      4. احصد البلاستيدات الكروية الناتجة بالطرد المركزي اللطيف عند 600 × جم لمدة 5 دقائق واغسلها ب 1 مل من 1 متر من السوربيتول ثم مرة أخرى ب 1 مل من المخزن المؤقت STC (1 م سوربيتول ، 10 ملي تريس درجة الحموضة 7.5 ، و 10 ملي كلوريدالكالسيوم 2).
      5. أعد تعليق البلاستيدات الكروية المغسولة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت STC.
        ملاحظة: استخدم المقص لقطع آخر ~ 0.7 سم من طرف الماصة. سيؤدي ذلك إلى إنشاء فم أوسع ويمنع تحلل البلاستيدات الكبروية.
    3. تحويل الخلايا الساذجة بالبروتين.
      1. قم بتحويل 50 ميكرولتر من الأجزاء الكروية مع 50 ميكرولتر من محللة المتبرع ، و 20 ميكرولتر من الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون (2 مجم / مل) ، و 5 ميكرولتر من بلازميد الاختيار المميز ب URA3 (على سبيل المثال ، pAG426-GFP) < فئة الدعم = "xref" >28 ، < فئة الدعم = "xref">33.
      2. احتضن المزيج عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      3. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 600 × جم لتجميع البلاستيدات الكروية وإعادة تعليقها في 150 ميكرولتر من SOS-buffer (1 متر سوربيتول ، 7 ملي كلوريدالكالسيوم 2 ، 0.25٪ مستخلص خميرة ، و 0.5٪ بيبتون).
      4. استرجع لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية.
      5. ضع الثقافة بأكملها على لوحات SD-URA.
        6. قم
      6. بتراكب المزرعة المطلية بسرعة ب SD-URA دافئ (~ 45 درجة مئوية) يحتوي على 0.8٪ أجار < / > ملاحظة: سيمنع هذا البلاستيدات الكروية من الانفجار
      7. احتضان لوحات التحويل لمدة 2-3 أيام عند 30 درجة مئوية.
      8. باستخدام عود أسنان ، اختر الخلايا النامية بنجاح من الصفيحة المتراكبة وأعد خطها إلى مستعمرات مفردة على ألواح SD-URA.
      9. اختر العشرات من المستعمرات لكل منها وقم بخطها على ألواح 5-FOA للتخلص من البلازميد الناقل الذي يحمل علامة URA3.
      10. اختر المستعمرات التي تنمو على ألواح 5-FOA واختبر نقل حالات النمط الظاهري المستقرة باستخدام مقايسة النمو ، كما كان من قبل (الخطوة 1.13).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" > من المعروف أن الإفراط في التعبير عن البروتين يغير بشكل كبير الأنماط الظاهرية الخلوية < فئة sup = "xref" >27. في الواقع ، مع نهج الفحص الأولي ، تم استرداد مئات الأنماط الظاهرية الجديدة بشكل متكرر من الإفراط في التعبير عن المستنسخة من الخميرة ORFeome باستخدام عشرة ضغوطات فقط. ومع ذلك ، فإن المقايسات الموضحة أعلاه تسمح بتقييم ما إذا كانت الخلايا تحتفظ بأي أنماط ظاهرية مستقرة طويلة المدى بعد هذا الإفراط في التعبير. أحد البروتينات القادرة على تشفير مثل هذه الحالة هو Psp1. Ps...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وحددت البريونات الخميرة الأولى تعمل غير عادية وأنماط محيرة من الميراث. خصائص هذه البريونات ثم استخدمت لبناء الخوارزميات والأدوات الحاسوبية للشاشة لبروتينات بريون إضافية. الأسلوب الموصوفة هنا، على النقيض من ذلك، التجريبية وتعتمد على overexpression عابرة لإنشاء دائم التغير في ثابت ترميز الدولة في تشكيل البروتين. ومع ذلك، إذا كفاءة "بذر" بريون الجمعية التي أوفيريكسبريشن لأي بروتين معين منخفض جداً، ستخرج هذا البروتين باستمرار كصورة سلبية كاذبة في شاشات overexpression من هذا النوع. واحد مثل هذا التعديل لتصحيح هذا سيكون استخدا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر تشاكرابورتي سوني وساندرا جونز وديفيد غارسيا، بولار بهوبيندر، تشانغ إميليا، أنها ريتشارد وسوزان لندكست لمساعدتها في تطوير الاختبارات المستخدمة في هذه الورقة، فضلا عن المراجعين لتعليقاتهم مدروس.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Guanidine hydrochlorideSigmaCat # G3272-25Gكلوريد المنغنيز الكيميائي
SigmaCat # M8054-100Gبروميد الإيثيديوم الكيميائي
SigmaE1510كيميائي
5-حمض الفلوروروتيكSigmaCat # F5013-50MGكيميائي
BY4741 MATa (his3 & Delta; 1 ليو2 ودلتا. 0 LYS2 met15 & Delta ؛ 0 ura3 & دلتا ؛ 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998N / Aسلالة الخميرة
BY4741 MAT & alpha; (هي3 & دلتا; 1 ليو2 ودلتا. 0 lys2 & دلتا ؛ 0 MET15 ura3 & Delta ؛ 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998N / Aسلالة الخميرة
Hsp70 (K69M) Jarosz et al. ، 2014bN / APlasmid
FLEXGene libraryHu et al. ، 2007N / Aمكتبة البلازميد
سكر العنب (الجلوكوز)Fisher ScientificD16-3مكون الوسائط
RaffinoseSigmaR0250-25Gمكون الوسائط
GalactoseFisher ScientificBP656-500مكون الوسائط
CSMSunrise العلوم1001-100مكون الوسائط
CSM-URAعلوم شروقالشمس 1004-100مكون الوسائط
CSM-LYSعلوم شروقالشمس 1032-100مكون الوسائط
CSM-METعلوم شروقالشمس 1019-100مكون الوسائط
CSM-LYS-METعلوم الشروق1035-100مكون الوسائط
مستخلص الخميرةفيشر ScientificBP1422-2مكونات الوسائط
الببتونمنتجات الأبحاث الدوليةP20240-5000مكون الوسائط
باكتو ببتونBD211677مكون الوسائط
الجلسرينEMD MilliporeGX0185-2مكون الوسائط
النيتروجين الخميرة بدون الأحماض الأمينيةBD291920أجار مكون الوسائط
IBI IB49172الوسائط: مكون وسائل
العلمية ، كبريتات الأدينين، SigmaA3159-25G، مكون الوسائط
، أسيتات البوتاسيوم، SigmaP1190-500G، مكون الوسائط
، UracilSigmaU0750-100Gمكون الوسائط
، هيستيدينسيجماH8000-100G، مكون الوسائط
، LeucineSigmaL8000-25Gمكون الوسائط
LysineSigmaL5501-25Gمكون الوسائط
RNase I Thermo Fisher ScientificEN0601إنزيم
البيوتينيل DNaseThermo Fisher ScientificAM1906إنزيم
زيموليز 100T (إنزيم خميرة لايتي)شروق الشمس ScienceN0766555إنزيم
قارئ صفيحة دقيقةBioTekSynergyH1 Equipment
Microplate المعبئBioTekBioStack3لوحة المعدات
حشوBiotTekEL406معدات
روبوت مناولة السوائلBeckman CoulterBiomek FXEquipment
قاعدة الإعلام ،

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
  2. Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).
  3. Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
  4. True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
  5. Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
  6. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
  7. Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
  8. Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
  9. Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
  10. Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
  11. Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
  12. Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
  13. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
  14. Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
  15. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
  16. Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
  17. Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
  18. Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
  19. King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
  20. Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
  21. Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
  22. Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
  23. Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
  24. Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
  25. Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
  26. Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
  27. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  28. Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
  29. Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
  30. Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766(2016).
  31. Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
  32. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  33. Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425(1992).
  34. Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
  35. Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
  36. Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
  37. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
  38. Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
  39. Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
  40. Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
  41. Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
  42. Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
  43. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein based InheritanceYeast ORFeome ScreeningHigh throughput PhenotypingPrion Protein DetectionManganese Chloride StressorHSP104 DisaggregasePSP1 Open Reading FrameNon mendelian InheritanceYeast Prion FieldEpigenetic Screening

Related Articles