مقالة منهجية

فحص الجزيئات النانوية النشطة بيولوجيا في الخلايا المناعية البلعمة لمثبطات مستقبلات تشبه تول

DOI:

10.3791/56075

⸱

يوليو 26, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, BC Children's Hospital and University of British Columbia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشبه مستقبلات تول (تلر) يلعب دورا هاما في الفيزيولوجيا المرضية للكثير من الأمراض الالتهابية البشرية، وينظم تنظيم الاستجابة تلر من قبل النانوية النشطة بيولوجيا من المتوقع أن تكون مفيدة في العديد من الحالات الالتهابية. توفر خلايا المراسل المستندة إلى الخلايا من نوع ثب-1 منصة فحص متعددة الاستخدامات وقوية لتحديد مثبطات رواية إشارات تلر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنظيم الدوائية من مستقبلات تشبه تول (تلر) ردود يحمل وعدا كبيرا في علاج العديد من الأمراض الالتهابية. ومع ذلك، كانت هناك مركبات محدودة المتاحة حتى الآن لتخفيف الإشارات تلر ولم يكن هناك مثبطات تلر المعتمدة سريريا (باستثناء هيدروكسيكلوروكين المخدرات المضادة للملاريا) في الاستخدام السريري. في ضوء التقدم السريع في تكنولوجيا النانو، والتلاعب الاستجابة المناعية باستخدام أجهزة النانو قد توفر استراتيجية جديدة لعلاج هذه الأمراض. هنا، نقدم طريقة فحص الإنتاجية العالية لتحديد بسرعة الجسيمات النانوية الحيوية النشطة التي تمنع إشارات تلر في الخلايا المناعية البلعمة. وقد بنيت هذه المنصة الفرز على خلايا مراسل الخلايا القائمة على ثب-1 مع المقايسات اللونية وسوسيفيراس. تم تصميم خلايا مراسل من خط الخلايا أحادية الخلية ثب-1 الإنسان عن طريق التكامل مستقرة من اثنين من يبني مراسل محرض. واحد يعبر عن الجينات الجنينية الفوسفاتيز الجنينية (سيب)تحت سيطرة المروج محرض من قبل عوامل النسخ نف-κB و أب-1، والآخر يعبر عن الجينات مراسل وسيفيراس يفرز تحت سيطرة المروجين تحرضها العوامل التنظيمية الإنترفيرون (إرفس) .Upon تلر التحفيز، وتنشيط خلايا مراسل عوامل النسخ ثم تنتج سيب و / أو لوسيفيراس، والتي يمكن الكشف عنها باستخدام الكواشف الركيزة المقابلة لها. باستخدام مكتبة من الجينات النانوية الببتيد الذهب (غنب) التي أنشئت في دراساتنا السابقة على سبيل المثال، حددنا واحد الببتيد-الناتج القومي الإجمالي الهجين التي يمكن أن تمنع بشكل فعال الذراعين لسلسلة إشارات TLR4 الناجمة عن يجند النموذجي، عديد السكاريد الشحمي (لس). تم التحقق من صحة النتائج من قبل التقنيات البيوكيميائية القياسية بما في ذلك إمونوبلوتينغ. وخلص تحليل آخر إلى أن هذا الهجين الرصاص له طيف مثبط واسع، يتصرف على مسارات متعددة تلر، بما في ذلك TLR2 و 3 و 4 و 5. ويسمح هذا النهج التجريبي بتقييم سريع(أو غيرها من المركبات العلاجية) يمكن أن تعدل إشارات محددة تلر في الخلايا المناعية البلعمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مستقبلات تشبه تول (تلرس) هي واحدة من العناصر الرئيسية في الجهاز المناعي الفطري المساهمة في خط الدفاع الأول ضد العدوى. تلرس هي المسؤولة عن الاستشعار عن غزو مسببات الأمراض من خلال الاعتراف ذخيرة من الأنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (أو بامبس) وتصاعد ردود الفعل الدفاعية من خلال سلسلة من التنبيه إشارة 1 ، 2 . هناك 10 تلرس الإنسان المحددة؛ باستثناء TLR10 التي تبقى فيها الليغاند غير واضحة، يمكن لكل تلر أن يعترف بمجموعة متميزة ومتحفظة من برامج تحليل الأداء. على سبيل المثال، TLR2 و TLR4، تقع أساسا على سطح الخلية، ويمكن الكشف عن البروتينات الدهنية والشحميات السكرية من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام، على التوالي. في حين أن TLR3 و TLR7 / 8 و TLR9، الموجودة أساسا في المقصورات إندوسومال، يمكن أن يشع رنا و دنا من الفيروسات والبكتيريا 3 . عندما تحفزها بامبس، تلرس تؤدي الاستجابات المناعية الأساسية عن طريق الإفراج المؤيدة لل إنفوسطاء تحريضية، وتجنيد وتفعيل الخلايا المناعية المستجيب، وتنسيق الأحداث المناعية التكيفية اللاحقة 4 .

ويمكن تصنيف تنبئ التشوير تلر ببساطة إلى مسارين رئيسيين 5 و 6 . واحد يعتمد على محول البروتين عامل التمايز النخاعي 88 (MyD88) - مسار تعتمد على MyD88. تستخدم جميع تلرس باستثناء TLR3 هذا المسار لتفعيل عامل كابا-ليت-شينر العامل النووي من الخلايا B المنشطة (نف-κB) و كيناسيس البروتين المرتبط بالميتوجين (مابس)، مما يؤدي إلى التعبير عن وسطاء مؤيد للالتهابات مثل TNF- α، إيل-6 و إيل-8. المسار الثاني يستخدم تير-دومين-كونتينينغ-إنفوسد إنترفيرون-β (تريف) - المسار المستقل الذي يعتمد على تريف أو MyD88 - لتفعيل العوامل التنظيمية للإنترفيرون (إفرس) و نف-κB، مما يؤدي إلى إنتاج اكتب I إفنس. إشارات تلر سليمةأمر بالغ الأهمية لحمايتنا اليومية من الالتهابات الميكروبية والفيروسية. يمكن أن تؤدي العيوب في مسارات إشارات تلر إلى نقص المناعة وغالبا ما تكون ضارة بصحة الإنسان. 7

ومع ذلك، الإشارات تلر هو "سيف ذو حدين" والتنشيط المفرط وغير المنضبط تلر ضارة. تساهم ردود الفعل تلر أكثر نشاطا في التسبب في العديد من الأمراض الالتهابية الحادة والمزمنة الإنسان 8 ، 9 . على سبيل المثال، تعفن الدم الذي يتميز التهاب الجهازية والإصابة بأعضاء متعددة، ويرجع ذلك أساسا إلى الاستجابات المناعية الحادة الساحقة نحو الالتهابات، مع TLR2 و TLR4 لعب دورا حاسما في الفيزيولوجيا المرضية الإنتان 10 ، 11 ، 12 . وبالإضافة إلى ذلك، تم العثور على TLR5 للمساهمة في التهاب الرئة المزمن من المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي 13، 14 . وعالوة على ذلك، يرتبط ارتباط إشارات تلر إندوسومال) مثل TLR7 و TLR9 (بقوة مع تطور وتطور العديد من أمراض المناعة الذاتية بما في ذلك الذئبة الحمامية الجهازية والتهاب المفاصل الروماتويدي) را ( 15 ، 16 . هذه الخطوط المتقاربة من الأدلة تحدد إشارات تلر كهدف علاجي محتمل للعديد من الأمراض الالتهابية 17 .

على الرغم من أن تنظيم الدوائية من الردود تلر ومن المتوقع أن تكون مفيدة في العديد من الحالات الالتهابية، للأسف، هناك حاليا عدد قليل جدا من المركبات المتاحة سريريا لمنع إشارات تلر 9 ، 17 ، 18 . ويرجع ذلك جزئيا إلى تعقيد وتكرار مسارات تلر المشاركة في التوازن المناعي وأمراض الأمراض. لذلك، والبحث عن رواية، بوتينيمكن أن تساعد العوامل العلاجية لاستهداف مسارات إشارات متعددة تلر على سد فجوة أساسية، والتغلب على التحدي المتمثل في دفع مثبطات تلر إلى العيادة.

في ضوء التقدم السريع في مجال علم النانو وتكنولوجيا النانو، نانودفيسس آخذة في الظهور كما الجيل القادم من المحولات تلر نظرا لخصائص فريدة من نوعها 19 ، 20 ، 23 . حجم النانو يسمح لهذه النانو العلاجات أن يكون التوزيع الحيوي أفضل واستمرار تداول 24 ، 25 ، 26 . ويمكن أن تكون فونكتيوناليزد أكثر لتلبية المطلوب الدوائية والدوائية ملامح 27 ، 28 ، 29 . أكثر إثارة، والنشاط الحيوي من هذه نانوديفيسس الرواية ينشأ من الخصائص الجوهرية، والتي يمكن أن تكون مصممة لبدلا من مجرد التصرف كوسيلة تسليم لعامل علاجي. على سبيل المثال، تم تصميم بروتين شحمي عالي الكثافة (هدل) لتثبيط إشارات TLR4 عن طريق مسح جزيئات TLR4 لس 23 . وبالإضافة إلى ذلك، قمنا بتطوير نظام الهجين الجسيمات النانوية الببتيد الذهب، حيث الببتيدات مزينة يمكن أن تغير خصائص سطح الجسيمات النانوية الذهب، والسماح لهم أن يكون مختلف الأنشطة الحيوية 30 ، 31 ، 32 ، 33 . وهذا يجعلها فئة خاصة من المخدرات (أو "نانو المخدرات") كما الجيل القادم من العلاجات النانو.

في هذا البروتوكول، نقدم نهجا لتحديد فئة جديدة من الجسيمات النانوية الببتيد الذهب (الببتيد-غنب) التي يمكن أن تمنع بقوة مسارات الإشارات متعددة تلر في الخلايا المناعية البلعمة 32 ، 33 . ويستند هذا النهج على تجاريا المتاحة ثب-1 خطوط خلية مراسل. تتكون خلايا المراسل من اثنين من بنيات مراسل مستقر، محرض: واحد يحمل يفرز الجنينية الفوسفاتيز القلوية الجنينية (سيب) تحت سيطرة المروج محرض من قبل عوامل النسخ نف-κB والبروتين المنشط 1 (أب-1). والآخر يحتوي على جينات مراسل لوسيفيراس يفرز تحت سيطرة المروجين محرض من العوامل التنظيمية الإنترفيرون (إيرفس). عند التحفيز تلر، تنبئ إشارة يؤدي إلى تفعيل نف-κB / أب-1 و / أو إيرفس، الذي يتحول الجينات مراسل إلى سيب سرية و / أو لوسيفيراس. يمكن الكشف عن مثل هذه الأحداث بسهولة باستخدام الكواشف الركيزة المقابلة مع الطيفي أو لومينوميتر. وباستخدام هذا النهج لفحص المكتبة التي تم إنشاؤها سابقا من الهجين الببتيد-غنب، حددنا المرشحين المحتملين التي يمكن أن تمنع بقوة مسارات إشارات TLR4. النشاط المثبط للببتيد الرصاص -ثم تم التحقق من صحة الهجين الناتج القومي الإجمالي باستخدام نهج الكيمياء الحيوية آخر من إمونوبلوتينغ، وتقييمها على مسارات تلر أخرى. هذا النهج يسمح لفحص سريع وفعالة من العوامل الجديدة التي تستهدف مسارات إشارات تلر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد ثقافة الثقافة وسائل الإعلام والكواشف

  1. إعداد كاملة زراعة الخلايا المتوسطة R10 عن طريق إضافة ملاحق من 10٪ مصل بقري جنيني (فبس)، 2 ملي L- الجلوتامين و 1 ملي بايروفات الصوديوم في وسط رمي-1640.
    1. إعداد وسط ثقافة الاختيار R10-Z عن طريق إضافة المضادات الحيوية زيوسين (200 ميكروغرام / مل) إلى R10 للحفاظ على التعبير عن سيب تحت سيطرة نف-κB / أب-1 التنشيط. لتحديد للخلايا معربا عن كل من سيب وجينات مراسل لوسيفيراس، إضافة كل من زيوسين (100 ميكروغرام / مل) و بلاستيسيدين (10 ميكروغرام / مل) إلى R10 (كما R10-زب).
  2. إعداد الحل سيب الركيزة عن طريق إذابة كيس واحد من مسحوق الركيزة (ه . ، كوانتي-الأزرق) إلى 100 مل من النقاء العالي، الذيفان الداخلي الماء مجانا في نظيفة 125 مل الزجاج قارورة.
    1. دوامة الحل بلطف واحتضان ذلك في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لضمان حل كامل من ركائز.
      2. <لي> تصفية الحل باستخدام غشاء 0.2 ميكرون لضمان عقمها (اختياري)، وتخزينه في 4 درجات مئوية تصل إلى 2 أسابيع قبل الاستخدام.
  3. إعداد حل الركيزة لوسيفيراس عن طريق إذابة كيس واحد من مسحوق الركيزة (على سبيل المثال ، كوانتي لوك) إلى 25 مل من النقاء العالي، الذيفان الداخلي الماء مجانا في العقيمة 50 مل أنبوب الطرد المركزي.
    1. بعد حل مسحوق تماما، استخدم الحل فورا. بدلا من ذلك، تخزين الحل في 4 درجات مئوية (تصل إلى أسبوع) أو في -20 درجة مئوية (تصل إلى شهر) قبل الاستخدام.
      تنبيه: كل من الحلول الركيزة حساسة للضوء، ويجب تجنب التعرض للضوء كلما كان ذلك ممكنا. دورات تجميد ذوبان متعددة من الحل يمكن أن يسبب عدم استقرار الركيزة وتقصير عمرها الافتراضي.
  4. إعداد محلول المخزون من فوربول 12-ميريستات 13 خلات (بما) في الصف الجزيئي ثنائي ميثيل سلفوكسيد (دمسو) أن يكون تركيز 500 ميكروغرام / مل. جعل أليكوتس من الحل الأسهم (10 ميكرولتر في أنبوب 500 ميكرولتر) وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  5. إعداد لس (E- القولونية K12) حل الأسهم في العقيمة، الذيفان الداخلي المياه الحرة بتركيز 5 ملغ / مل، وجعل قسامة للتخزين على المدى الطويل في -20 درجة مئوية. إعداد حل لس العمل عن طريق تمييع لس لس في الفوسفات مخزنة المالحة (بس) بتركيز 100 ميكروغرام / مل وتخزينها في -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    تنبيه: يجب أن يتم إعداد كاشف لاستخدامات الثقافة في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، وينبغي تعقيم جميع الحاويات قبل استخدامها. يجب تجنب دورات تجميد الذوبان المتكررة من سلطة النقد الفلسطينية وحلول لس.

2. ثقافة ثب-1 مراسل الضامة المستمدة من الخلايا

  1. استخدام اثنين من خطوط الخلايا مراسل ثب-1: ثب-1-زبلو وخلايا ثب-1 المزدوجة. الأول لديه جين مراسل سيب التي تسيطر عليها نف-κB / أب-1، وهذا الأخير لديه نظام مزدوج الجينات مراسل، نفس سيب مراسل الجينات و إيرف تسيطر الجينات لوسيفيراس. الإر إجراءات متطابقة باستثناء وسائل الإعلام ثقافة الاختيار.
    1. ذوبان الجليد مخزون خلية العمل (~ 5 × 10 6 خلايا) في 10 مل من R10 المتوسطة، وتدور أسفل الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق. ريسوسبيند الخلايا في 10 مل من R10 المتوسطة، ونقلها إلى قارورة ثقافة T75. تبادل وسط الثقافة كل 2-3 أيام حتى تصل الخلايا إلى كثافة 1 × 10 6 خلايا / مل.
    2. عندما يصل نمو الخلايا إلى قدرته، وخلايا مرور للحد من كثافة الخلايا إلى في حدود 2-5 × 10 5 خلايا / مل، وبالتالي فإن الخلايا يمكن أن تستمر في النمو.
    3. بعد مرور واحد على الأقل، تبدأ في ثقافة الخلايا في وسط ثقافة الاختيار: R10-Z ل ثب-1-زبلو، و R10-زب ل ثب-1-ثنائي. بعد زراعة الخلايا مع وسط ثقافة الاختيار لمدة 1 على الأقل مرور، والخلايا جاهزة للتجربة.
      تنبیھ: یمکن أن تؤدي عملیة زیادة الخلایا إلی موت خلوي کبیر. يجب الحفاظ على بقاء الخلية> 98٪. الاحتفاظ بسجل لعدد مرور كما سيللس قد تتصرف بشكل مختلف بعد العديد من الممرات (> 20 ممرات).
      ملاحظة: قوارير ثقافة الخلية يمكن إعادة استخدامها عدة مرات لتوفير التكاليف. ومع ذلك، فإن هذه الممارسة قد تزيد من خطر التلوث العام والتلوث المتبادل بين قوارير مختلفة (إذا كان التعامل مع خطوط الخلايا المختلفة في نفس الوقت). خلال تبادل وسائل الإعلام ومرور الخلية، يتم تعيين الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
  2. لإجراء فحص خلية مراسل، خلايا البذور إلى 96-جيدا لوحة مسطحة الخلية القاع ثقافة وتمييزها في الضامة. ويرد وصف الإجراءات في ما يلي.
    1. نقل الخلايا من قارورة إلى أنبوب الطرد المركزي، وتدور أسفل الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق، و ريسوسبيند لهم في وسط R10 بتركيز 1 × 10 6 خلايا / مل. إضافة أليكوتس من حل سلطة النقد الفلسطينية في تعليق خلية مع تركيز النهائي من 50 نانوغرام / مل.
    2. نقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر من 96-نحنليرة لبنانية لوحة باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية (في حاضنة ثقافة الخلية) لمدة 24 ساعة.
    3. بعد الحضانة، وإزالة بعناية وسط ثقافة باستخدام الشافطة فراغ (أو مع ماصة متعددة القنوات)، وغسل بلطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني (100 ميكرولتر / جيدا) مرتين. إضافة 100 ميكرولتر من المتوسطة R10 الطازجة في كل بئر. بقية الخلايا لمدة 2 أيام في حاضنة قبل إجراء الفحص المراسل.
      تنبيه: خطوة يستريح مهم جدا للسماح للخلايا لتهدئة بعد التحفيز سلطة النقد الفلسطينية إلى وضعهم الهدوء الطبيعي. وهذا يمكن أن تقلل بشكل كبير من إشارات الخلفية للجينات مراسل تحت ظروف أونستيمولاتد.
      ملاحظة: بعد 24 التحفيز مع سلطة النقد الفلسطينية، وتتميز الخلايا في النمط الظاهري مثل البلاعم، مع سمة من التصاق الخلايا في الجزء السفلي من البئر، وميزة المورفولوجية من كاذب.

3. فحص ل TLR4 المحتملة مثبطات نانو باستخدام خلايا مراسل

ملاحظة: بما أن إشارات TLR4 تستخدم كلا من المسيرتين المعتمدتين على أساس MyD88 والمسارات المعتمدة على تريف، فإنها تحدد كهدف أساسي يشمل مجموعة واسعة من مسارات تشوير تلر. وتستخدم خلايا مراسل ثب-1-زبلو لدراسة أساسا تنشيط نف-κB / أب-1 في حين أن خلايا ثب-1-دوال هي لتفعيل إيرف من تنبيغ إشارة تعتمد على تريف.

  1. تحديد الجرعة الأمثل لس عن طريق توليد منحنى الجرعة والاستجابة قبل الفحص.
    1. تمييع حل لس العمل لتركيز النهائي من 0.01 - 100 نانوغرام / مل في وسط R10 (جعل التخفيف في مقياس log10). تخطيط تصميم لوحة وجعل التخفيف في 96-جيدا جولة-- أسفل لوحة الثقافة. تأكد من أن كل بئر لديه الحد الأدنى من 110 ميكرولتر من الحل بعد التخفيف.
    2. إزالة بلطف مستنبت من لوحة الخلية الخلوية (من 2.2.3) باستخدام الشافطة فراغ.
    3. نقل لس تحتوي على R10 المتوسطة أعدت في لوحة التخفيف (3.1.1) طنتو لوحة الثقافة وفقا لتخطيط العينات. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية (في حاضنة ثقافة الخلية) لمدة 24 ساعة.
    4. في 24 ساعة، ونقل بعناية سوبرناتانتس (80 ميكرولتر / جيدا) في لوحة جديدة 96-جيدا جولة القاع. إجراء قياس اللمعان اللونية و / أو لوسيفيراس على هذه الحلول على الفور أو تخزينها في 4 درجات مئوية (عدة ساعات) أو -20 درجة مئوية (أيام) قبل تطوير الفحص.
      ملاحظة: يجب أن يكون تصميم تخطيط لوحة بسيطة وواضحة للتجربة وتحليل البيانات. ولكل حالة، ينبغي النظر في 2-4 مكررات. احرص دائما على تضمين مجموعة تحكم سلبية (لس نول). فمن المستحسن استخدام خلايا ثب-1-زبلو لتفعيل نف-κB / أب-1 كما الخلايا المزدوجة لديها خلفية عالية نسبيا من نف-κB / أب-1 تفعيل بعد أن متباينة في الضامة. ومع ذلك، فمن الممكن استخدام الخلايا المزدوجة للإبلاغ عن كل من نف-κB / أب-1 و إيرف تفعيل.
  2. تطوير اللونإيميتريك ل نف-κB / أب-1 تفعيل وسوسيفيراس التلألؤ الفحص لتفعيل إيرف.
    1. لتقييم نف-κB / أب-1 التنشيط، ونقل 20 ميكرولتر من طاف من كل عينة في لوحة جديدة مسطحة 96-لوحة مسطحة القاع. وإضافة 180 ميكرولتر من قبل تحسنت سيب حل الركيزة في كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 - 2 ساعة للسماح لتطوير اللون (الوردي إلى الأزرق الداكن). جمع امتصاص في 655 نانومتر على قارئ لوحة.
      تنبيه: يمكن أن تختلف فترة حضانة على أساس تطوير اللون (30 دقيقة حتى الحضانة بين عشية وضحاها). فمن المستحسن أن تنتظر حتى تصل الكثافة البصرية (أود) من أحلك اللون فوق 1، مع تجنب تشبع تطور اللون (أود> 3).
    2. لتحليل تفعيل إيرف، ونقل 10 ميكرولتر من طاف من كل عينة في لوحة بيضاء مسطحة 96-جيدا واضحة. إضافة حل لوسيفيراس (50 ميكرولتر) وعلى الفور جمع التلألؤ ثإل جيدا.
      ملاحظة: ينصح بشدة لاستخدام قارئ لوحة التلألؤ مع وظيفة حقن السيارات لضمان الاتساق في قراءة التلألؤ من جيدا إلى جيدا ومن لوحة إلى لوحة. إذا تم حقن حلول الركيزة يدويا، يرجى التأكد من وقت حضانة متسقة وقراءة انشاء لكل بئر.
  3. إجراء فحص الفرز على مختلف الهجين الببتيد-غنب مع 10 نانوغرام / مل التحفيز لس (على أساس 3.1). اتبع نفس الإجراء في 3.2 لمراسل تطوير مقايسة.
    1. تركيز الهجين الببتيد-غنب إلى 200 نانومتر في المتوسط ​​R10 باستخدام طريقة الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي 20 مجلدا من الحل الهجين (10 نانومتر) في 18،000 x ج لمدة 30 دقيقة، وتجاهل بعناية سوبيرناتانتس. جمع الهجينة (في الجزء السفلي من الأنبوب) في أنبوب، وغسلها مع برنامج تلفزيوني مرتين، وإعادة تعليق الهجينة في حجم واحد من وسط R10.
    2. خلط كميات متساوية من الهجينة المركزة ولس (20 نانوغرام / مل) التي تحتوي على R10 المتوسطة أن يكون تركيز النهائي من الهجينة و لس لتكون 100 نانومتر و 10 نانوغرام / مل، على التوالي.
    3. إزالة وسط الثقافة من لوحة مثقف (2.2.3) وإضافة 100 ميكرولتر من محلول مختلطة في كل بئر (3 مكررات لكل حالة). وتشمل السيطرة السلبية (المتوسطة فقط) والتحكم لس (10 نانوغرام / مل لس دون الهجينة).
    4. بعد 24 ساعة حضانة عند 37 درجة مئوية، ونقل وسيلة من كل بئر في أنبوب وأجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 18،000 x ج، 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. جمع سوبرناتانتس (50-80 ميكرولتر / أنبوب) في لوحة 96-جيدا جولة القاع، وأداء الفحص المراسل كما هو موضح في 3.2.
      تنبيه: عند التخلص من سوبرناتانتس بعد الطرد المركزي، لا تحريك الهجينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
      ملاحظة: الطرد المركزي في الخطوة 3.3.4 مهم جدا لإزالة الهجينة الجسيمات متناهية الصغر غير الداخلية من وسط الثقافة، ويمكن تجنب تدخل من الهجينة مع شركةلوريمتريك / التلألؤ القراءات. وذلك لأن الجسيمات النانوية الذهب يمكن أن تمتص موجات واسعة من الضوء اعتمادا على حجمها والتكتل.

4. التحقق من التأثير المثبط للمرشحين المحتملين

ملاحظة: لتأكيد تأثير مثبط للمرشحين المحتملين من الفرز، يتم استخدام نهجين. واحد هو لفحص ردود جرعة من المنشطات (لس) في تركيز هجين ثابت (أو العكس). والآخر هو أن ننظر مباشرة في تثبيط على إشارات نف-κB / أب-1 و IRF3 عن طريق إمونوبلوتينغ.

  1. في نهج واحد، إجراء فحص المراسل مع 100 نانومتر من الهجين الرصاص واثنين من تركيزات لس في 1 نانوغرام / مل و 10 نانوغرام / مل اتباع نفس الإجراءات الموصوفة في 3.3. تضمين هجين غير نشط (استنادا إلى نتائج الفرز) كسيطرة هجين للمقارنة.
  2. لنهج إمونوبلوتينغ، يرجى اتباع ه القياسيةالإجراءات التجريبية.
    1. خلايا ثب-1 الثقافة في المتوسطة R10، البذور الخلايا في لوحة الثقافة 12 جيدا (2 × 10 6 خلايا / جيدا)، وتمييزها في الضامة عن طريق علاج الخلايا مع سلطة النقد الفلسطينية 50 نانوغرام / مل ل 24 ساعة تليها الراحة لمدة 2 أيام.
    2. بعد تمايز الخلايا، وتحفيز الخلايا مع 10 نانوغرام / مل لس مع / بدون الهجينة (100 نانومتر) مع مرور الوقت (تصل إلى 4 ساعات). في نقاط زمنية مختلفة (0، 5، 15، 30، 60، 120 و 240 دقيقة)، وإعداد ليسيتس الخلية ل إمونوبلوتينغ. تضمين هجين غير نشط كعنصر تحكم.
    3. دقق إشارات IκBα، P65 فوسفهوريلاتد، و IRF3 فوسفهوريلاتد لفحص تأثير مثبط من الهجين الرصاص على تفعيل نف-κB و IRF3. دقق في إشارات β-أكتين وإجمالي IRF3 كضوابط داخلية.
      ملاحظة: تنبيغ الإشارة غالبا ما يحدث أسرع بكثير (في بضع ساعات) ثم التعبير عن الانزيمات مراسل سيب و لوسيفيراس (24 ساعة). فمن المستحسن جدا ل بيرفور أيضااما اختبار الجدوى من الهجينة اختبار في 24 ساعة كطريقة أخرى للتحقق من الصحة.

5. تقييم خصوصية تلر

ملاحظة: للتحقيق في خصوصية تلر من الهجين الببتيد-غنب، يتم اختبار مسارات الإشارات الأخرى تلر، بما في ذلك TLR2 و TLR3 و TLR5. يتم استبعاد TLR7 و 8 و 9 لأن الضامة المستمدة من ثب-1 لا تستجيب بشكل جيد لتحفيز هذه تلرس نظرا لعدم وجود تعبير TLR7 و 8 و 9 في البلاعم 34 .

  1. اختبار تركيزات مختلفة (1 نانوغرام / مل إلى 25 ميكروغرام / مل) من بروابط محددة ل TLR2 (Pam3CSK4)، TLR3 (بولي I: C) و TLR5 (فلاجلين) على كل من خلايا مراسل المستمدة الضامة للحصول على التركيز الأمثل بعد نفس الإجراء في 3.1 و 3.2.
  2. علاج الخلايا مع مخاليط من الهجين الرصاص (100 نانومتر) وكل يجند تلر في تركيز تم الحصول عليها من 5.1 لتقييم خصوصية مثبطة من الرصاص hيبرد وفقا للإجراءات التجريبية الموصوفة في 3.3. تضمين هجين غير نشط كسيطرة للمقارنة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويوضح الشكل 1 النهج التجريبي الشامل. وتستخدم خطوط الخلايا مراسل ثب-1 اثنين، ثب-1-زبلو و ثب-1-المزدوج لسرعة الشاشة الردود تلر من خلال التحقق من تفعيل نف-κB / أب-1 و إيرفس، على التوالي. يمكن الكشف عن تفعيل نف-κB / أب-1 من قبل مقايسة اللونية سيب، في حين يتم رصد تنشيط إيرف بواسطة التلألؤ لوسيفيراس. خلايا ثب-1 أحادي يمكن أن تكون مشتقة بسهولة في الضامة لعرض نانوديفيسس للنشاط المناعية على الخلايا المناعية البلعمة الفطرية. مع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ تلرس تشارك في التسبب في العديد من الأمراض الالتهابية، فقد برزت كأهداف علاجية لتشكيل الاستجابات المناعية والظروف الالتهابية. ومع ذلك، فإن التطور السريري من العلاجات لمنع مسارات إشارات تلر كان نجاح محدود حتى الآن. هيدروكسيكلوروكين المخدرات المضادة للملاريا الذي يثبط TLR7 و TLR9 في الاستخدام السريري 35 ، 36 . وبالمثل، لم يتقدم سوى عدد محدود من المركبات للتجارب السريرية بما في ذلك إريتوران، وهو مضاد TLR4، التي أظهرت آثار م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدعم المقدم من برنامج أستاذ التعيين الخاص (الباحث الشرقي) في مؤسسات شنغهاي للتعليم العالي (هي)، وصندوق البداية من مستشفى الشعب الأول في شنغهاي (هي)، ودعم غاوفنغ الطب السريري منحة من شنغهاي جياوتونغ (هي)، والتمويل من مؤسسة كرون والتهاب القولون في كندا (سفك) (سيت و هي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
THP-1-XBlue خلية مراسلInvivoGenthpx-spتحافظ على مرور ثقافة الخلية تحت 20
THP-1-Dual repoter cellInvivoGenthpd-nfisتحافظ على مرور ثقافة الخلية أقل من 20
RPMI-1640 (بدون L-glutamine) GEHealth CareSH30096.02الاحماء حتى 37 درجة ؛ ج قبل الاستخدام ؛ أضف مكملات غذائية لعمل
مصل بقري للجنين R10 متوسط كامل (مؤهل)Thermo Fisher Scientific12484028معطل بالحرارة ؛ 10٪ في RPMI-1640
L-glutamineThermo Fisher ScientificSH30034.022 mM في الوسط الكامل R10
بيروفات الصوديومThermo Fisher Scientific11360-0701 ملي مولار في الوسط الكامل R10
محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ، 1X ، بدون كالسيوم ، مغنيسيومGE Health CareSH30028.02يستخدم لغسل الخلايا وتحضير
الكاشف QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1ركيزة SEAP
QUANTI-LucInvivoGenrep-qlc2Luciferase الركيزة
ZeocinInvivoGenant-zn-1اختيار المضادات الحيوية لخلايا
المضادات الحيوية BlasticidinInvivoGenanti-bl-1لخلايا المراسل
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) للبيولوجيا الجزيئيةSigmal-AldrichD8418-100MLاستخدم لتحضير الكاشف
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) للبيولوجيا الجزيئيةSigmal-AldrichP1585-1MGاستخدام لتمايز الخلايا
عديد السكاريد الدهني (LPS) من الإشريكية القولونية K12InvivoGentlrl-eklpsTLR4 ligand
Pam3CSK4InvivoGentlrl-pmsTLR2 / 1 ligand
Poly (I: C) HMWInvivoGentlrl-picTLR3 ligand
Flagellin من S. Typhimurium (FLA-ST) ، فائق النقاءInvivoGentlrl-epstflaTLR5 ligand
SpectraMax Plus 384 قارئ صفيحة دقيقةالأجهزة الجزيئيةN / Aقراءة الفحص اللوني
قارئ الألواح الدقيقة Infinite M200 Pro متعدد الأوضاع مع حاقناتTecanN / Aقراءة جهاز الطرد المركزي luminiscience
Microfuge 22Rجهازمركزي صغير يتم التحكم في درجة حرارته (حتى 18,000 جم)
جهاز طرد مركزي Allegra X-15Rجهازمركزي للأغراض العامة يتم التحكم فيه في درجة الحرارة (لاستخدام زراعة الخلايا)
لوحة فحص كوستار ، 96 بئر بيضاء مع قاع مسطح شفاف ، معالج بأنسجةCorning Costar3903تستخدم لفحص اللمعان
المراسلاختيار طرد طرد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
  4. Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
  5. Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461(2014).
  6. Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
  7. Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
  8. Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
  9. O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
  10. Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
  11. Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
  12. Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
  13. Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
  14. Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
  15. Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265(2014).
  16. Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
  17. Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
  18. Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
  19. Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
  20. Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
  21. Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
  22. Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
  23. Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
  24. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
  25. Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
  26. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
  27. Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374(2011).
  28. Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
  29. Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
  30. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
  31. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
  32. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
  33. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  34. Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
  35. Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
  36. Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
  37. Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
  38. Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
  39. Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
  40. Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
  41. Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
  42. Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
  43. Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

THP 1 SEAP NF kappaB AP1 IRF

مقالات ذات صلة