الخميرة المعدلة اختبار واحد الهجين وصفها هنا هو امتداد الخميرة الكلاسيكية واحد الهجين (Y1H) فحص لدراسة والتحقق من صحة البروتين هيتيروميريك معقدة التفاعل الحمض النووي في نظام غير متجانسة لأي دراسة الجينوم وظيفية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
A الخميرة تعديل واحد نظام هجين ل هيتيروميريك البروتين مجمع دنا التفاعل الدراسات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
على مر السنين، وقد أثبتت الخميرة اختبار واحد الهجين لتكون تقنية هامة لتحديد والتحقق من التفاعلات المادية بين البروتينات مثل عوامل النسخ (تفس) وهدف الحمض النووي. الطريقة المعروضة هنا تستخدم المفهوم الأساسي لل Y1H ولكن يتم تعديلها كذلك لدراسة والتحقق من صحة المجمعات البروتين ملزمة للحمض النووي المستهدف. وبالتالي، فإنه يشار إلى الخميرة المعدلة واحد الهجين (Y1.5H) فحص. هذا الفحص هو فعالة من حيث التكلفة ويمكن تنفيذها بسهولة في إعداد المختبر العادية. على الرغم من استخدام نظام غير متجانسة، يمكن أن تكون الطريقة الموصوفة أداة قيمة لاختبار والتحقق من صحة بروتين هتيروميريك مجمع ملزم لهدفها (ق) الحمض النووي لعلم الجينوم وظيفية في أي نظام للدراسة، وخاصة الجينوم النبات.
المقدمة
بشكل عام، لفهم التفاعلات البروتين الحمض النووي، وفحص Y1H هو النظام المفضل تستخدم بنجاح في إعداد مختبر 1 . يتضمن مقايسة Y1H الأساسية عنصرين: أ) بناء مراسل مع الحمض النووي من الفائدة المستنسخة بنجاح المنبع من الجينات ترميز بروتين مراسل. و ب) بناء التعبير الذي سيولد البروتين الانصهار بين تف الفائدة ومجال تنشيط النسخ الخميرة (أد). ويشار إلى الحمض النووي من الفائدة عادة باسم "الطعم" في حين أن البروتين الانصهار المعروف باسم "فريسة". في السنوات الماضية، وقد وضعت إصدارات متعددة من مقايسة Y1H لتناسب احتياجات محددة مع مزاياها الخاصة 2 . ويمكن تنفيذ مقايسة Y1H الحالية بنجاح لتحديد والت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إنشاء والمراسل إعداد البلازميد
- ير تضخيم مناطق المروج / "شظايا" (ويفضل ~ 250 - 500 نقطة أساس) من الحمض النووي المستهدف ليتم تحليلها لمزيد من الاستنساخ في ناقلات دخول باستخدام E. القولونية (TOP10).
- على تأكيد التسلسل، سوبكلون استنساخ إيجابي في متجه التعبير بلاتشي متوافق 7 كما هو موضح سابقا 8 ، 9 ، 10 ، 11 .
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إعداد لوحة العامة الإجراء لإجراء التحول المشترك من مناطق الحمض النووي في خلايا الخميرة مع البروتين من الفائدة ( الشكل 2 ). يمكن إعداد لوحة المتابعة وفقا للحاجة إلى التجربة وعدد من مناطق الحمض النووي / شظايا اختبارها. بعد يوم 5 من البروتوكول لوحة ناضجة بشكل إيجابي وإيجابية يجب أن تكون مرئية كما هو الحال في الشكل 3 . في دراستنا، تم تقسيم المنطقة المروج من 2600 بي بي المنبع من بداية موقع بدء .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الإجراء القياسي Y1H الحالي هو مناسبة لتحديد فريسة واحدة من البروتين فريسة ملزمة لطعم الحمض النووي. مع التعديلات الفنية المختلفة، تم تسخير النظام الحالي لتحديد الشبكات التنظيمية النسخي. ومع ذلك، من المعروف أن تفس تعمل كجزء من المجمعات التي تنطوي على اثنين أو أكثر من تفس أو البروتينات، مع بعض فقط من تف قادرة على ربط الحمض النووي. البروتينات أو تفس التي تمتلك فقط المجالات ملزمة البروتين وعدم القدرة على ربط الحمض النووي هم أكثر عرضة للعمل في مجمع، ويفضل مع تف التي هي قادرة على ربط الح.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يعلن المؤلفون أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر سس وانغ، M. عمار و A. غالا على قراءة نقدية للمخطوطة. تم دعم البحوث الواردة في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة RO1GM067837 و RO1GM056006 (إلى ساك). المحتوى هو فقط من مسؤولية المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest مجموعة نظام هجين مزدوج |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two مجموعة نظام هجين ؛ تم تعديل هذا vecor. إنه pDEST32 ناقص مجال ربط الحمض النووي |
| pENTR / D-TOPO طقم استنساخ | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 سلالة | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER نظام هجين |
| واحد pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest اثنين من مجموعة الأنظمة الهجينة |
| GATEWAY LR Clonase II مزيج الإنزيم | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD الحد الأدنى من الوسائط | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg / ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 قاع دائري جيدا Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| بئر 96 عميقة | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1896-2000 | |
| رقائق قابلة للغلق | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 2923-0110 | |
| أراسيل | إكسل Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | فيشر Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | سيجما ألدريتش | S3139 | |
| KCL | فيشر العلمي | BP366-500 | |
| MgSO4 | سيجما ألدريتش | 83266 | |
| HCL | فيشر Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | جهاز الطرد المركزي 5810R | |
| قارئ الألواح | الجهاز الجزيئي | SPECTRAMAX PLUS مقياس الطيف | |
| الضوئي الدقيقحاضنة | ثيرمو فيشر | موديل رقم 5250- 37 درجة ، 6250-30 درجة | |
| حاضنة شاكر | نيو برونزويك | ||
| حمام مائي | ثيرمو فيشر | إيزوتيمب 205 | |
| مثقاب | |||
| 50 مل فالوك | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150 مم) | Greiner bio-one |
المراجع
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012). <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
