مقالة منهجية

دليل للإنتاج وتبلور، وتصميم هيكل للبشرية IKK1/α

DOI:

10.3791/56091

⸱

نوفمبر 2, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كيناز IκB 1/α (IKK1/α الشق) هو كيناز بروتين Ser/منتدى المجالس الرومانسية التي تشارك في مجموعة متنوعة أنشطة الخلوية أساسا من خلال تفعيل عوامل النسخ نف κB. وهنا يصف لنا الخطوات الرئيسية اللازمة لإنتاج وتصميم هيكل الكريستال هذا البروتين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فئة من المحفزات خارج الخلية يتطلب التنشيط من IKK1/α للحث على جيل من وحدة فرعية NF-κB، p52، من خلال تجهيز p100 السلائف. وظائف p52 هوموديمير أو هيتيروديمير مع وحدة فرعية NF-κB آخر، ريلب. وتنظم هذه dimers بدوره التعبير عن مئات جينات المعنية بالتهاب وبقاء الخلية، ودورة الخلية. IKK1/α أساسا يظل المقترنة مع IKK2/β ونيمو كمجمع ثلاثي. ومع ذلك، يلاحظ أيضا بركة صغيرة لأنها complex(es) وزن الجزيئي منخفض. من غير المعروف إذا كان يتم تشغيل نشاط تجهيز p100 بتفعيل IKK1/α داخل أكبر أو أصغر مجموعة معقدة. تم الكشف عن نشاط المكونة من IKK1/α في العديد من أنواع السرطان والأمراض الالتهابية. لفهم الآلية لتفعيل IKK1/α، ويمكن استخدامه كهدف المخدرات، أعربنا عن المؤتلف IKK1/α في أنظمة المضيف مختلفة، مثل كولاي، والحشرات، وخلايا الثدييات. لقد نجحنا في التعبير عن IKK1/α القابلة للذوبان في باكولوفيروس إصابة خلايا الحشرات، الحصول على كميات ملغ من البروتين النقي جداً، وبلورة ذلك حضور مثبطات، وتحديد هيكلها كريستال بالأشعة السينية. هنا، نحن تصف الخطوات التفصيلية لإنتاج البروتين المؤتلف وفي التبلور، وعزمه الهيكل كريستال بالأشعة السينية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنشطة النسخي NF-κB الأسرة من عوامل النسخ dimeric مطلوبة من أجل وظائف خلوية متنوعة تتراوح بين الالتهاب والحصانة للبقاء على قيد الحياة والموت. وتخضع هذه الأنشطة صارم في الخلايا وفقدان التنظيم يؤدي إلى مختلف الحالات المرضية، بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية والسرطان1،،من23. نظراً لغياب حافز، يتم الاحتفاظ بأنشطة NF-κB تحول دون ب البروتينات IκB (المانع-κB)4. علامات الفسفرة بقايا Ser محددة على البروتينات IκB لهم أوبيكويتينيشن وتدهور proteasomal اللاحقة أو معالجة انتقائية5. اثنين مؤنزم Ser/Thr عالية مثلى، IKK2/β و IKK1/α، تعمل كوسط منظمي الأنشطة NF-κB بالاضطلاع بهذه الأحداث الفسفرة6،7.

التفاعلات بين يجند ومستقبلات ترانسدوسيس إشارة من خلال سلسلة من الوسطاء مما يؤدي إلى تنشيط عوامل NF-κB. ويمكن تصنيف عملية التنبيه NF-κB على نطاق واسع إلى مسارين متميزة-المقبول وغير المقبول (البديلة)8. وينظم نشاط IKK2/β أساسا NF-κB إشارات من مسار الكنسي الذي يعتبر أساسيا للاستجابات المناعية التحريضية والفطرية9. سمة مميزة لهذا المسار تنشيط السريع ولم تدم طويلاً من IKK2/β10 داخل إيك أونتشاراكتيريزيد المتحلل حتى الآن معقدة – يفترض أن تكون مؤلفة من IKK1 و IKK2، فضلا عن عنصر تنظيمي، نيمو (NF-κB "المغير الأساسية" )11،،من1213. بين وحدتين فرعيتين إيك الحفاز لمجمع إيك، IKK2 هو أساسا مسؤولة14 الفسفرة بقايا محددة لتنميط IκBs (α،-β، وγ) منضمة إلى NF-κB، وأيضا بروتين IκB شاذة، NF-κB1/p105، الذي تمهيدا ل وحدة فرعية p50 NF-κB5. الناجم عن الفسفرة أوبيكويتينيشن وتدهور proteasomal IκB (أو تجهيز p105) يؤدي إلى إطلاق سراح والتنشيط لمجموعة محددة من NF-κB dimers15. وقد لوحظ نشاط NF-κB الشاذة بسبب سوء تنظيم وظيفة IKK2 في العديد من أنواع السرطان، وكذلك كما هو الحال في اضطرابات المناعة الذاتية2،،من316.

على النقيض من IKK2/β، ينظم نشاط من IKK1/α NF-κB يشير المسار غير متعارف عليه، هو أمر ضروري للتنمية والحصانة. IKK1 فوسفوريلاتيس بقايا محددة من NF-κB2/p100 في جزئه IκBδ ج-الطرفية، مما يؤدي إلى المعالجة وتوليد p52. يبدأ تشكيل هيتيروديمير p52:RelB ترانسكريبتيونالي النشطة استجابة بطيئة ومتواصلة لإشارات التنموية7،17،،من1819،20. من المثير للاهتمام، جيل p52 عامل نف κB المركزية لهذا المسار اعتماداً كبيرا على عامل آخر، كيناز الذي يحفز NF-κB (NIK)21،22، لكن ليس على IKK2 أو نيمو. في الخلايا يستريح، لا يزال مستوى NIK منخفضا بسبب لها التردي المستمر تعتمد على بروتوزوم23،24،25. عند تنشيط خلايا يغاندس 'غير مقبول'، وفي بعض الخلايا الخبيثة، يصبح استقرت NIK لتوظيف وتفعيل IKK1/α-أنشطة كيناز NIK و IKK1 ضرورية لفعالية تجهيز p100 إلى p527. IKK1 و NIK فوسفوريلاتي سيرينس الثلاثة (Ser866، 870 و 872) من NF-κB2/p100 في جزئه IκBδ ج-الطرفية مما يؤدي إلى المعالجة وتوليد p52. قد تورط الشاذة تفعيل المسار غير متعارف عليه في كثير من الأورام الخبيثة بما في ذلك الورم النخاعي المتعدد26،،من2728.

عدة مثبطات كفاءة عالية ومحددة ل IKK2/β معروفة، على الرغم من أن لا شيء حتى الآن وقد اتضح أن دواء فعال. وفي المقابل، مثبطات IKK1/α-محددة متفرق. وهذا قد تنبع جزئيا من افتقارنا للمعلومات الهيكلية والبيوكيميائية على IKK1/α، مما يحد من فهمنا للأساس آليا إلى تفعيل NF-κB التي IKK1 في الخلايا، وتصميم الأدوية العقلاني. هياكل الأشعة السينية IKK2/β قدم لنا رؤى في تفعيل إليه بيتا IKK2/29؛ ومع ذلك، هذه الهياكل يمكن أن لا تكشف عن مدى اختلاف المحفزات المنبع يؤدي التنشيط IKK1/α أو IKK2/β لتنظيم مجموعات متميزة من NF-κB الأنشطة 30،31. لفهم أساس الميكانيكية الأساسية لوظيفة التنبيه متميزة IKK1/α، وإنشاء منبر لتصميم الأدوية العقلاني، ركزنا على تحديد هيكل IKK1/α.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد مناسبة للتعبير واسع النطاق من IKK1/α المؤتلف الفيروس

  1. إعداد الفيروس P1 32
    1. يوم 1: الخلايا Sf9 لوحة (~ 6 × 105) (رقم إصدار أقل من 10) في 2 مل من Sf900 الثالث المتوسط خلية الحشرات في كل جيد من لوحة 6-جيدا واحتضان عند 27 درجة مئوية. مرور الخلايا عندما تصل كثافة من 2 إلى 3 × 106 خلايا كل مل في تعليق بتمييع في وسائط جديدة في كثافة ~ 6 × 105.
    2. يوم 2: تمييع ميليلتر 8 من كاشف Sf9-تعداء في 100 ميليلتر من "المتوسطة الحشرات" Sf900 الثالث أو سماح بدون المضادات الحيوية والأمصال. الدوامة بإيجاز.
    3. تمييع 1 ميكروغرام لتنقية كيت باكميد المؤتلف (ترد التفاصيل في 'نتائج الممثل')32 إلى آخر ميليلتر 100 المتوسط نفسها، في أنبوب منفصل.
    4. الجمع بين الحمض المخفف وكاشف تعداء (ميكروليتر الحجم الإجمالي ~ 210-220)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-30 دقيقة.
    5. إزالة المتوسطة من البئر. أضف 1 مل متوسطة جديدة دون المضادات الحيوية والأمصال.
    6. إضافة خليط كاشف تعداء الحمض المخفف dropwise على الخلايا. ضبط حجم الانخفاض بأنه عدم إزاحة الخلايا ملتصقة.
    7. بعد ح ~ 6، إضافة 1.5 مل متوسطة جديدة في أعلى أو إزالة المتوسطة وإضافة 2.5 مل متوسطة جديدة. المتوسطة العذبة الدافئة إلى 25-27 درجة مئوية قبل الإضافة.
    8. احتضان الخلايا عند 27 درجة مئوية. تحقق من الآبار بشكل دوري كل ح ~ 12 لأعراض العدوى الفيروسية. القيام بجميع الصيانة Sf9 والتعبير عند 27 درجة مئوية.
    9. اليوم الخامس: إخراج المتوسطة التي تحتوي على خلايا ح 60-72 بعد الإصابة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ز و 4 درجات مئوية. حفظ المادة طافية؛ وهذا المخزون P1-الفيروس. تجميد مختبرين الصغيرة في-80 درجة مئوية.
  2. اختيار أفضل معربا عن استنساخ الفيروس P1.
    1. لوحة الخلايا وبالمثل كما هو موضح في الخطوة 1، 1.
    2. القادم بوست يوم أو ح ~ 6 الطلاء، إضافة ميليلتر 20 و 50 ميليلتر الأرصدة استنساخ الفيروس P1 المختلفة على الخلايا في آبار مختلفة.
    3. إزاحة الخلايا ملتصقة بلطيف بيبيتينج وحصاد الخلايا المصابة ح 60-72 وظيفة العدوى من سينتريفوجينج لمدة 5 دقائق في 500 x ز و 4 درجات مئوية. حفظ المادة طافية. وهذا المخزون الفيروسات P2. تخزين مختبرين صغيرة من المخزون الموجود في-80 درجة مئوية.
    4. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت x Laemmli الحزب الديمقراطي الصربي 2 بيليه خلية المقطوع. الحرارة في > 95 درجة مئوية للحد الأدنى 10 أجهزة الطرد المركزي (عادة 10,000 > × ز) لمدة 5 دقائق.
    5. تشغيل 10-15 ميليلتر لكل عينة من 8-10% من مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة في الخامس 120-160 حتى الجبهة صبغ يصل إلى أسفل من الجل.
    6. الكهربائية والنقل بروتوكول (20 ت، 30-45 دقيقة) نقل البروتينات تحل بمعيار شبه الجاف في غشاء النيتروسليلوز/PVDF.
    7. لطخة مع الأجسام المضادة IKK1 (تمييع ~ 1:2، 000، يجب أن يكون الأمثل) أو الأجسام المضادة بينتاهيس (تمييع ~ 1:3، 000، يجب أن يكون الأمثل) للتعبير.
    8. اختر أفضل استنساخ الفيروس P1 بمقارنة التعبير عن IKK1 المؤتلف.
  3. إعداد نطاق واسع مخزون فيروس P3.
    1. لوحة الخلايا وبالمثل كما هو موضح في الخطوة 1، 1 في لوحة 15 سم يحتوي على 25-30 مل متوسطة الثالثة Sf900.
    2. ح ~ 6 وظيفة الطلاء، وإضافة 150-300 ميليلتر مخزون فيروس P1 تعرب عن أفضل على الخلايا.
    3. بعد 72 ساعة بعد الإصابة ونضح المتوسطة بعناية من اللوحة في أنبوب مناسب (عقيمة) والطرد المركزي الأنبوب في 500-1000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل بيليه الخلية (إذا لم يتم تشكيل واحد) وحفظ المادة طافية. وهذا مخزون فيروس P3.
  4. تحديد عيار الفيروس الأمثل للتعبير البروتين واسعة النطاق
    1. لوحة خلايا في 2 مل من Sf900 الثالث المتوسط، كما هو موضح في 1-1، في لوحة 6-جيدا.
    2. إضافة 20، 30 و 40 و 50 ميليلتر من P3 مخزون الفيروس في فصل الآبار ح ~ 6 وظيفة الطلاء. إدراج عنصر تحكم غير مصاب.
    3. حصاد الخلايا من كل عدوى وظيفة جيدا 48-60 ح.
    4. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للحزب الديمقراطي الصربي لايملي X 2. الحرارة في > 95 درجة مئوية للحد الأدنى 10 أجهزة الطرد المركزي (عادة في 14,000 س ز) لمدة 5 دقائق.
    5. 10-15 ميليلتر لكل عينة في جل الحزب الديمقراطي الصربي-صفحة 8-10% حل.
    6. نقل البروتين تحل بغشاء النيتروسليلوز/PVDF كما هو مذكور في 1.2.6.
    7. لطخة مع الأجسام المضادة IKK1 (تمييع ~ 1:2000، يجب أن يكون الأمثل) أو الأجسام المضادة بينتاهيس (تمييع ~ زائداً، يجب أن يكون الأمثل).
    8. استخدم الفيروس مع أفضل معربا عن عيار لتعبيرات واسعة النطاق.

2-التعبير واسعة النطاق من 6 x له معلم البشرية IKK129،33

  1. القيام بالتعبير واسع النطاق في ثقافة وقف. تقسيم الخلايا في 1 لتر متوسطة الثالثة Sf900 في قارورة Erlenmeyer ل 2 مع سقف تنفيس. ينبغي أن تكون كثافة الخلية ~ 5 × 105 خلايا/مل.
  2. تنمو هذه الخلايا في تعليق ~ 100 لفة في الدقيقة عند 27 درجة مئوية في شاكر ~ 2 أيام حتى تصل إلى كثافة 1-2 × 106/mL. يجب إلا تتجاوز كثافة الخلية 2 × 106/mL.
  3. إضافة المبلغ المطلوب من الفيروسات P3، كما تقيم في 1.4.
  4. تنمو ثقافة ح 48-60 ~ 100 لفة في الدقيقة عند 27 درجة مئوية في شاكر المصابة.
  5. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في < ز س 1,500 في 4 درجات مئوية.
  6. حفظ بيليه الخلية وتجاهل المتوسطة.
  7. المضي قدما لتنقية البروتين مباشرة. فلاش تجميد بيليه الخلية في النتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

3-تنقية صاحب IKK133

  1. في يوم 1، ريسوسبيند بيليه الخلية في 40 مل من "تحلل المخزن المؤقت" (25 مم تريس pH 8.0، 0.2% NP-40 مم 200 كلوريد الصوديوم، ايميدازول 10 ملم، 10% والغليسيرول، 5 مم β-mercaptoethanol ومثبط البروتياز كوكتيل).
    ملاحظة: بيليه الخلية الرطب الكتلة لم تحدد. بشكل عام، استخدمت ~ 2 لتر ثقافة لهذه الخطوة.
  2. الخلايا التي سونيكيشن في 60-70% واجب دورات، 5-10 نبضات مدتها 30 ثانية عند فاصل زمني من > 1 دقيقة، بالإبقاء على تعليق خلية مبردة على الثلج.
    ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة الأمثل مع كل نموذج من سونيكاتور. لا تدع العينة الاحماء أعلاه 10 ° C.
  3. توضيح بالطرد المركزي في ≥ س 28,000 ز لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  4. حجته 4 مل راتنج ني-جاتا [اغروس] مع المخزن المؤقت لتحلل، ومزيج توضيح ليستي (المادة طافية) يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  5. السماح للبروتين التي تلزم الراتنج بحضانة ح 2 في خلاط روتاري في غرفة 4 درجات مئوية.
  6. يغسل الراتنج جيدا مع تحلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 30 ملم ايميدازول. فحص تركيز البروتين في المياه والصرف الصحي بشكل دوري باستخدام "مقايسة برادفورد". المياه والصرف الصحي حتى يصل تركيز هذا البروتين في المياه والصرف الصحي إلى 0.1 مغ/مل. عادة > 20 سرير حجم المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي هو المطلوب للوصول إلى هذه النقطة.
  7. الوت البروتين صاحب معلم IKK1/α تحت تدفق الجاذبية، استخدام 20 مل من شطف المخزن المؤقت (تحلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على ايميدازول 250 ملم). جمع الكسور 1-1.5 مل.
  8. فحص نقاء التيد البروتين على هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 8 أو 10% عن طريق تحميل 5-10 ميكروليتر من عينة من جميع الكسور مختلطة مع لايملي المخزن المؤقت.
  9. تجمع الكسور الذروة (تركيز ≥ 2 مغ/مل)، وقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد.
  10. هضم مع TEV (01:30-50 (TEV البروتياز: IKK1)) مبطلات بين عشية وضحاها (ح إيه وان تو) في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تحسين مقدار حوزتي الإجمالية المطلوبة لإكمال الهضم (≥ 95 ٪) من العلامة X له 6 بداهة. تمت تنقيته حوزتي TEV في البيت.
  11. في صباح اليوم الثاني، احتضان البروتين مع 1 مم ATP حضور 20 مم مجكل2، 20 مم β-جليسيروفوسفاتي، 10 مم NaF وأورثوفاناداتي الصوديوم 1 مم ح 1 في 27 درجة مئوية.
  12. تصفية الحل البروتين من خلال عامل تصفية ميكرومترات 0.45 أو 0.22.
  13. تحميل 6 مل العينة على عمود حجم استبعاد محضرة ~ 120 مل المتصل نظام لوني سائل الآلي. حجته العمود مع المخزن المؤقت A (20 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم DTT، 5% والغليسيرول) المسبقة لتطبيق نموذج البروتين.
    ملاحظة: يمكن استخدام عمود أصغر تبعاً لعائد البروتين بعد الخطوة تنقية تقارب ني-الإدارة الوطنية للسياحة. ضبط/حساب حجم التحميل 5 في المائة من حجم العمود).
  14. تشغيل حجم الاستبعاد اللوني بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة، ورصد شطف في 280 و 254 نانومتر. جمع الكسور ذات حجم 2 مل.
  15. تحقق نقاء الكسور الذروة (عادة حول ~ 60-70 مل) على هلام الحزب الديمقراطي الصربي-صفحة 8-10%.
  16. تجمع الكسور البحتة (نقاء إيه ناين فايف % بتركيز ≥0.5 مغ/مل) والتركيز في كاتشين 10 أو 30 كاتشين الوزن الجزيئي وقف إنتاج مركزات البروتين الطرد المركزي اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  17. دورياً فحص تركيز البروتين من الركاز بواسطة الأسلوب برادفورد، والتركيز نموذج ما يصل إلى 8-12 ملغ/مل.
  18. الاستغناء عن 25 ميكروليتر مختبرين وفلاش التجميد في النيتروجين السائل. تخزين هذه العينات المجمدة فلاش في الثلاجة-80 درجة مئوية.

4-الشاشة من أجل بلورة حالة IKK1

  1. حساب المبلغ الإجمالي (من حيث الحجم) من البروتين المطلوب للشاشة لبلورات اتباع الأساليب المذكورة أدناه.
  2. حاول مثبطات مختلفة (مثبطات كيناز عامة: أمبنب، وستوروسبوريني؛ إيكسبيسيفيك مثبطات: MLN120B ومجمع بايك-المانع الثاني عشر) لإجراء الفحص للتبلور. جعل الحلول المخزون من هذه المركبات اتباع إرشادات الشركة المصنعة. ضمان عدم تجاوز أقصى تركيز المجمع في حل الأسهم 20 ميكرومتر.
  3. إعداد IKK:inhibitor معقدة للشاشة تبلور بخلط ميكرومترات 100 من IKK1 مع 200 ميكرومتر المانع، واحتضان في 18-20 درجة مئوية للطرد المركزي 30-40 دقيقة هذا الخليط في > ز س 15,000 لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. حفظ المادة طافية لبلورة الشاشة.
  4. استخدام شاشات تبلور المتاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد).
  5. "الماصة؛" 80-100 ميكروليتر من كل بلورة الكاشف (خزان الحلول)، استخدام ماصة متعددة القنوات أو روبوت، وخزان لصفيحة 96-جيدا. اللوحة جاهز الآن لإعداد قطرات. تأكد من أن اللوحة يستوعب تبلور 2 إلى 3 قطرات حتى أنه يمكن أن يكون فحص مثبطات 2 إلى 3 في لوحة واحدة.
  6. استخدام روبوت تبلور، الاستغناء عن ومزيج 0.2-0.25 ميكروليتر IKK1:inhibitor المعقدة مع نفس الحجم من خزان الحل.
    ملاحظة: الفحص وتتم يدوياً باستخدام وحدات تخزين أكبر من انخفاض (0.5-1.0 ميكروليتر IKK1:inhibitor المعقدة مع نفس الحجم من خزان الحل). ومع ذلك، سيساعد استخدام روبوت حفظ قيمة الكواشف.
  7. ختم اللوحات فورا بعد وضع القطرات مع الأفلام واضحة بصريا لتجنب التبخر. ختم بشكل صحيح باستخدام المحاليل المناسبة. جعل لوحات متماثلة لكل مجموعة المانع. احتضان لوحة واحدة في 18 درجة مئوية، والأخرى في غرفة باردة (درجة الحرارة نطاق ~ 4 – 6 درجة مئوية). تأكد من أن الحاضنات لا تتأثر بالاهتزاز.
  8. استخدام ستيريوميكروسكوبي مع المستقطب للتحقق من ظهور البلورات في كل قطره كل يوم في الأيام السبعة الأولى، ومن ثم على فترات أطول. بشكل منهجي ملاحظة ونقاط هذه الملاحظات.
    ملاحظة: استخدام ستيريوميكروسكوبي مع المستقطب بحيث يمكن تقييم عيوب النمو في بلورات بصريا. هنا، بلورات ظهرت في حالة حيث حل الخزان الواردة 3% w/v ديكستران كبريتات الصوديوم ملح مص 5,000، 0.1 M بيسين pH 8.5، 15% w/v البولي إثيلين غليكول 20,000. ونما بلورات IKK1 إلا بحضور الثاني عشر إيك-المانع.

5. الكريستال النمو الأمثل29،33

  1. إعداد حلول الأسهم.
    1. إعداد 30% w/v الحلول من كبريتات ديكستران مختلفة الوزن الجزيئي (متوسط ميغاواط 5,000، 8,000، 15,000، دا 40,000) في منزوع ح2حل تصفية O. استخدام 0.22 ميكرومتر مرشحات.
    2. إعداد الأرصدة م 1 أو 0.5 متر من مخازن مختلفة في نطاق درجة الحموضة 6.5 إلى 9. تصفية الحلول استخدام 0.22 ميكرومتر مرشحات.
    3. إعداد 25% أو 50% (w/v) شماعة حلول مختلفة الوزن الجزيئي (avg. MW:1000، 1,500، 3,350، 4,000، 6,000، 8,000، 10,000، 12,000، دا 20,000). تصفية الحلول استخدام 0.22 ميكرومتر مرشحات.
    4. أداء شاشة شبكة قبل متفاوتة بشكل منهجي الأس الهيدروجيني ونوع المخزن وتركيز ونوع من شماعة وكبريتات ديكستران.
  2. تحسين الكشف في 18 درجة مئوية، وفي غرفة باردة (درجة الحرارة نطاق ~ 4-6 درجة مئوية).
  3. مزيج من مبلغ مساو من IKK1:Inhibitor المعقدة مع الحل جيدا واحتضان عبر الحل جيدا في بيئة مغلقة. يمكن إجراء هذه الخطوة يدوياً أو باستخدام روبوت الاستغناء عن.
    ملاحظة: هنا، بلورات أكبر ومحددة تحديداً جيدا (حسب تقييم لون موحد تحت المستقطب الذي أشار إلى نمو موحد) تم الحصول عليها تحت الظروف التالية: 100 مم بسترس pH 7.0، 2.8 إلى 3.5 في المائة من "كبريتات ديكستران" (متوسط 15 ميغاواط كاتشين)، 20% 8.5-10 ربط كاتشين في غرفة باردة.

6-ونمو البلورات بإعداد كبيرة

  1. إعداد الحلول الأسهم التالية وتصفية منهم خلال 0.22 ميكرومتر تصفية.
    1. إعداد 0.5 م بيستريس pH 7.0، ودرجة الحموضة البروبان بيستريس 7.0 و 7.5.
    2. إعداد 30% (w/v) "كبريتات ديكستران" (كاتشين "ميجاوات متوسط" ~ 15). مخزن في 4 درجات مئوية.
    3. إعداد 50% شماعة (كاتشين "ميجاوات متوسط" ~ 12).
  2. استخدام 24 جيدا معلقة لوحات قطره.
  3. تطبيق تسرب الشحوم على الحلقات التي أثيرت من كل بئر.
  4. إعداد الحل جيدا كما يلي (تركيز النهائي): 100 مم بسترس 7.0 درجة الحموضة – 7.5، 2.8 – 3.5% كبريتات ديكستران ~ 15 كاتشين، ربط 8.5 – 10% ~ 12 كاتشين. إعداد 1 مل الحل جيدا في أنابيب 1.5 مل.
    ملاحظة: قد لوحظ تباين طفيف في حالة تبلور تبعاً لهذه الدفعة من البروتين، و/أو "كبريتات ديكستران"، وبالتالي محاكمة طائفة ضيقة المستحسن. بسترس وبسترس البروبان المخازن المؤقتة لنفس الرقم الهيدروجيني النطاق تؤدي بلورات مفردة.
  5. الاحتفاظ بحلول جيدا ولوحات مدهون في الغرفة الباردة على الأقل ح 1.
  6. إعداد IKK1:Inhibitor معقدة كما هو موضح في 4.3. نقل الحلول جيدا من أنابيب 1.5 مل إلى الآبار الفردية للوحة جيدا 24.
  7. تنظيف siliconized (تجارية أو داخلية (سيليكونيزيشن/سيلانيزيشن)) الزجاج كشوف الغطاء باستخدام مناديل خالية من الوبر وتطبيق الضغط العالي أوضحت الطائرات الجوية استخدام خرقه الهباء الجوي المتاحة تجارياً.
  8. ضع ميكروليتر 1 – 1.5 من حل جيد في كشف غطاء نظيف. "الماصة؛" تساوي حجم IKK1:inhibitor المعقدة، وتخلط بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 3-4 مرات. بدوره بكشف غطاء الزجاج ومكان في كل منهما جيدا مع الملقط وختم البئر بالضغط على الشحوم.
  9. بعد إعداد جميع قطرات من صفيحة 24-حسنا، احتضان اللوحة في الغرفة الباردة في الظلام. أحياناً التحقق من قطرات تحت مجهر لظهور ونمو البلورات.
    ملاحظة: فإنه لم يتم اختباره سواء تفرخ لوحات الكريستال تحت الضوء تغيير النتيجة. بيد أنه من الحاسم، أن هي المحتضنة اللوحات في بيئة مع الاهتزاز الحد الأدنى/لا.

7-البرد حماية البلورات

  1. إعداد حلول البرد.
    1. إعداد Cryo A (كبريتات ديكستران ~ 2%، % ~ 10 ربط 12000، 60 ملم البروبان بسترس (من الرقم الهيدروجيني نفسها كحل جيدا المقصود)، 5 ملم تريس درجة الحموضة 7.5، 40-50 مم كلوريد الصوديوم، 2.5% والغليسيرول).
    2. إعداد ب Cryo (~0.3% "ديكستران كبريتات"، ~ 10% ربط 12000، 60 ملم البروبان بسترس (من الرقم الهيدروجيني نفسها كحل جيدا المقصود)، 5 ملم تريس درجة الحموضة 7.5، 40-50 مم كلوريد الصوديوم، 20 أو 25% والغليسيرول أو 20 أو 25% جليكول).
      ملاحظة: اختبار الريفيين البرد المختلفة بالإضافة إلى الجلسرين وجليكول (مثلاً، ربط 200، 400 ربط، وربط 550 مدام، ربط 1000).
  2. بلطف إزالة بكشف غطاء الزجاج الذي يحتوي على البلورة ووضعه على سطح صلب مع انخفاض كريستال تواجه صعودا. إضافة 10 ميكروليتر من حل البرد على رأس هذا الانخفاض بلطف، وتخلط بلطف من بيبيتينج حيث أنه لم يتم التطرق الكريستال.
    ملاحظة: هذا ينظف سطح الكريستال من الحطام ويساعد حجته الكريستال مع المخزن المؤقت cryo الأولى. تجنب الإجهاد الميكانيكية والحرارية للبلورة. تنفيذ كافة الخطوات اللاحقة تحت المجهر لتجنب أي ضرر للبلورة.
  3. إزالة بعض السائل من البلورة ببطء وتبقى حول 5-8 ميكروليتر من الحل. تجنب جفاف الكريستال. اتخاذ الحذر الشديد لتجنب الإجهاد الميكانيكي والجفاف من الكريستال في جميع الخطوات اللاحقة.
  4. بلطف إضافة 2.5 – 4 ميكروليتر من محلول ب البرد على الانخفاض، وتخلط بلطف جداً من بيبيتينج. تغطية مع صحن بيتري صغيرة لتجنب تدفق الهواء مباشرة عبر البلورة. انتظر دقيقة 5 دائماً احرص على البلورة لا تعاني التغيرات السريعة للضغط الاسموزي أو الجفاف.
  5. كرر الخطوة 7، 4 أربع مرات للتأقلم الكريستال ببطء إلى حل البرد.
  6. يبقى 10 – 20 ميكروليتر من الحل البرد في هذه المرحلة (أيالسماح الكريستال أن حمم في حوالي 20-25% cryo-بروتيكتانت التي تحتوي على الحل). نقع لفترات مختلفة من الوقت (دقيقة 5 إلى ح 1) في البرد-الحل النهائي.
  7. تجميد بلورات متعددة في نقاط زمنية مختلفة.
  8. بعناية اختيار بلورة مفردة من الانخفاض في حلقة البرد مناسبة التي شنت على قاعدة سليمة وتجميد يغرق في سائل ن2. تنفيذ هذه الخطوة بسلاسة وبسرعة لتجنب تشكيل الجليد على البلورة.
    ملاحظة: اختيار كريستال استخدام حلقة قطرها أكبر قليلاً من المحور أطول من الكريستال بحيث يمكن تركيبها في جونيوميتير الروبوتية المستخدمة في "مصدر متقدم فوتون"، مختبر أرغون الوطني.
  9. تخزين البلورة تحتوي على حلقات البرد في كرات الصولجان مغمورة في سائل ن2. تخزين هذه كرات الصولجان في سائل ن2 قارورة ديوار حتى تكون جاهزة للشحن حيود الأشعة السينية في السنكروتروني. الشروع في جمع البيانات حيود الأشعة السينية وتجهيز (المادتان 8 و 9).
    ملاحظة: البيانات الحيود من بلورات IKK1 من مصادر الأشعة السينية المنزل لم القرار عالية بما يكفي للمحاكمات تصميم الهيكل، على الرغم من أنه أشار إلى نوعية البلورات تفتيش عند السنكروتروني. جمعت كل حيود المعطيات في بيملينيس مختلفة (أساسا 19ID) "مقدما فوتون المصدر"، "مختبر أرغون الوطني"، الولايات المتحدة الأمريكية.

8-الأشعة السينية جمع البيانات

  1. جمع البيانات حيود الأشعة السينية في بيمليني ID19 مصدر السنكروتروني وكالة الأنباء الجزائرية، باستخدام بيانات الاستشعار عن بعد مجموعة البرمجيات34.
    ملاحظة: ما يزيد عن 100 من بلورات تم اختبارها لخصائص الحيود. البلورات ديفراكتيد بشكل روتيني إلى قرار من 7-11، إلا في حالات نادرة البلورات التي ديفراكتيد لتتجاوز 5 تم ملاحظتها، وفقط واحد كريستال كبيرة ديفراكتيد تتجاوز 4.5. منذ البلورات التهاوي السريع أثناء جمع البيانات، تم جمع مجموعات البيانات في أجزاء مختلفة من نفس البلورة. كان هذا ممكناً نظراً للبلورات كبيرة (أكبر من 400 ميكرون)، وكانت قطر شعاع يستخدم 100 ميكرومتر.

9. تجهيز البيانات بالأشعة السينية

  1. دمج جميع مجموعات البيانات التي تم جمعها في أجزاء مختلفة من كريستال نفس34.
    ملاحظة: تم دمج مجموعات البيانات السبعة من الكريستال أفضل وكان 93% كاملة من البيانات الناتجة. عموما أنا كان σ ~ 6.8) وكان رميرجي 89% في بن القرار أعلى (5.4-4.5 Å).
  2. مجموعات البيانات العملية مع HKL200034 للحصول على مجموعة مساحة وأبعاد الخلية وحدة ومحتوى المذيبات والمعقول تشكيل الوحدة غير متماثل.

10-هيكل الحل

  1. إعداد نماذج البحث
    1. استناداً إلى النماذج الهيكلية المتاحة من hIKK2 (pdb معرف 4E3C و 4KIK35)، إنشاء سلسلة من dimers مع توجهات مختلفة دينار كويتي الطرفي ن (أن يجعل فتح 30 و 62، بين P578 دينار كويتي اثنين في ديمر). أيا من هذه النماذج جلب حل بحث استبدال جزيئي بعد محاكمات واسعة النطاق.
    2. إنشاء مخطط ل IKK1 من بيانات مفرد-الجسيمات cryo-م33.
    3. إنشاء نموذج IKK1 البشرية من أعلى هيكل القرار IKK2 (pdb معرف 4KIK).
    4. قفص الاتهام في المجالات الفردية من طراز IKK1 البشرية في الخريطة الكثافة م البرد من IKK1 البشرية باستخدام أبله36. هذا استدارة اتجاه دينار كويتي حوالي 24 درجة وتعديل الانفتاح ~ 58 Å ن--المحطة الطرفية.
    5. تطبيق اتجاه دينار كويتي من طراز cryo-م تركيب (مونومر) لجميع dimers التي تم إنشاؤها في 10.1.1.
  2. استبدال الجزيئية
    1. استخدام dimers من 10.1.1 و 10.1.5 كنماذج البحث في البرامج فيزر37ومولريب38 و39،الجهاز العصبي المركزي40.
      ملاحظة: هنا، استخدام أحد dimers من 10.1.5 (52 Å الافتتاحية) كنموذج البحث، dimers ستة (اثنين هيكساميرس) تقع في الوحدة غير متماثلة باستخدام مولريب. Å 52 فتح في نموذج البحث مشابه لافتتاح Å 49-50 dimers (جميع dimers ستة) في هيكل المكرر.

11-هيكل الصقل

  1. هيكل التحسين الداخلي
    1. تصحيح اتجاه وموقف من هذا النموذج الأولى بصقل هيئة جامدة في الجهاز العصبي المركزي (cns_solve_1.3)39،40.
    2. تحسين الهيكل كذلك استخدام تدنية ومحاكاة الصلب مع دالة هدف الحد أقصى لاحتمال وتصحيح معظم المذيبات شقة استخدام39،نظام الجهاز العصبي المركزي40.
    3. بناء نموذج يستند إلى 2 واوس-وج وخرائط Fo-نادي باستخدام إكستالفيو41.
      ملاحظة: تنطبق صقل دن ساعدت42 وكبح جماح النيجيرية خلال التحسينات لأفضل دقة النموذج. في الواقع، صقل دن تحسنت بشكل كبير R-العوامل للهيكل، وهندستها ومعامل البحث والتطوير 22.2 في المائة والحرة R عامل كان 27.8 في المائة للنموذج النهائي. يجب أن يكون التحسن الكبير للبحث الحر بسبب نموذج عالية الدقة IKK1 المجالات التي تم إنشاؤها من طراز IKK2 (4KIK).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاستنساخ والتعبير عن نيات مختلفة من IKK1/α
طول كامل تم استنساخ البشر IKK1/α في بفاستباتشتا ناقلات التعبير باكولوفيروس داخل مواقعها تقييد اكوري و NotI للحصول على سداسي-الحامض الأميني الطرفي ن المعلمة IKK1. يمكن إزالة العلامة بحوزتي TEV الهضم. منذ طول كامل IKK1/α تحتوي على مناطق مرنة على كلا الطرفين، ومناطق مرنة تجعل عادة بروتين صعبة لبلورة، نحن استنساخ مختلف أجزاء مبتوراً من IKK1/α داخل المواقع المذكورة أعلاه لناقل بفاستباتشتا. مختلف طفرات الاقتطاع من IKK1/α تم إنشاؤها...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حل الإنتاج وتبلور وهيكل من اثنين من البروتينات إيك ذات الصلة
لقد حددنا لتحديد هيكل الكريستال الأشعة السينية IKK1/α مع الفكرة القائلة أنه سيكون عملية معقدة نسبيا نظراً لتجربتنا مع IKK2/β إنتاج البروتين والتبلور، وتصميم الهيكل. ومع ذلك، فوجئنا بدرجة عالية أن هذه البروتينات ذات الصلة اثنين تصرفت بطريقة مختلفة جداً فيما يتعلق بسهولة تبلور. وعلى الرغم من الجهود المبذولة من عدة مختبرات رفيعة، استغرق تصميم هيكل IKK1 ما يقرب من عقدين. وهذا ينبع إلى حد كبير من اختناقات رئيسية قليلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية أو غيرها تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر الموظفين في 19ID بيملينيس، 24ID، و 13ID في "المتقدم فوتون المصدر"، ولاية، وايل، للدعم المقدم من خلال جمع البيانات عن بلورات مختلف. نحن ممتنون لديمتري ليومكيس، ومعهد سولك لجلب لنا خريطة م البرد دقة منخفضة في المراحل المبكرة من م خريطة/نموذج البناء، الذي كان يستخدم لبناء نموذج البحث استبدال الجزيئية IKK1 الأولى. البحوث المؤدية إلى هذه النتائج تلقت تمويلاً من المعاهد الوطنية للصحة منح AI064326 و CA141722 و GM071862 جيغاغرام. SP هو حاليا "ويلكوم ترست DBT الهند الوسيطة زميل".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

تم الآن

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إيقاف إنتاج Cellfectin / Cellfectin IIThermo Fisher Scientific10362100Cellfectin ، واستبداله ب Cellfectin II
Sf900 III خلية الحشرات المتوسطةThermo Fisher Scientific12658-027
خلايا SF9Thermo Fisher Scientific12659017
الأجسام المضادة المضادة ل IKK1Novus BiologicalsNB100-56704تم بيعها سابقا بواسطة Imgenex
يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة المضادة ل PentaHisQiagen34460
PVDF غشاءMilliporeIPVH00010النيتروسليلوز
Ni-NTA agaroseQiagen30210
كاشف فحص برادفوردBioRad500001
Superdex 200 عمودمكثف GE Healthcare28989335
AmiconMilliporeUFC801008 ، UFC803008 ، UFC201024 ، UFC203024
مركب A باير
كالبيوكيم مثبط IKK XIIكالبيوكيم401491
StaurosporineSIGMAS4400
MLN120Bالألفيةهدية
عنصر AMPPNPSIGMAA2647
كبريتات ديكسترانSIGMA51227 ، 42867 ، 31404 ،
كبريتات ديكسترانAlfa AesarJ62101
PEGSIGMA93593 ، 81210 ، 88276 ، 95904 ، 81255 ، 89510 ، 92897 ، 81285 ، 95172بعضها جديد Cat # في كتالوج SIGMA. ما كان لدينا في الأصل من Fluka الذي كان له قطة مختلفة #.
شاشات التبلور:
شاشة كريستال I و II (شاشة كريستالية HT) ،هامبتون ريسيرشHR2-130
، فهرس HTHampton ResearchHR2-134
PEG / Ion و PEG / Ion2 (PEG / Ion HT) ،Hampton ResearchHR2-139
PEGRX 1 و PEGRx 2 (PEGRx HT) ،هامبتون ريسيرشHR2-086
، SaltRx 1 و SaltRx 2 (SaltRx HT)هامبتون للأبحاثHR2-136
يتصاعد كريستالهامبتون للأبحاثHR8-188 ، 190 ، 192 ، 194
السنكروترونمصدر الفوتون المتقدم (APS) في وزارة الطاقة الأمريكية s مختبر أرجون الوطنيBeamline 19 IDمصدر الفوتون المتقدم (APS) في وزارة الطاقة الأمريكية يوفر مختبر أرجون الوطني حزما فائقة السطوع وعالية الطاقة من حلقات التخزين للبحث في جميع التخصصات العلمية تقريبا.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

IKK1 AlphaProtein ExpressionInsect CellsBaculovirus SystemProtein PurificationSize Exclusion ChromatographyProtein CrystallizationX ray CrystallographyMolecular ReplacementStructure Determination

مقالات ذات صلة