Method Article

استخدام كبسولات لالتلطيخ السلبي من العينات الفيروسية ضمن بيوكنتينمنت

DOI:

10.3791/56122

⸱

July 19th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pathology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID), 2Diagnostic Systems Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID), 3Microscopy Innovations LLC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول تعليمات لعينات فيروس تلطيخ السلبية التي يمكن استخدامها بسهولة في بسل-2، -3، أو -4 المختبرات. ويشمل استخدام كبسولة المعالجة المبتكرة، الذي يحمي شبكة المجهر الإلكتروني انتقال ويوفر للمستخدم التعامل أسهل في البيئات أكثر اضطرابا ضمن بيوكنتينمنت.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) لمراقبة البنية التحتية للفيروسات ومسببات الأمراض الميكروبية الأخرى مع قرار نانومتر. معظم المواد البيولوجية لا تحتوي على عناصر كثيفة قادرة على تشتت الإلكترونات لخلق صورة؛ وبالتالي، وصمة عار السلبية، الذي يضع أملاح المعادن الثقيلة الكثيفة حول العينة، مطلوب. من أجل تصور الفيروسات في تعليق تحت تيم يجب تطبيقها على شبكات صغيرة المغلفة مع سطح شفاف فقط نانومتر سميكة. ونظرا لصغر حجمها وهشاشتها، يصعب التعامل مع هذه الشبكات وتتحرك بسهولة بواسطة التيارات الهوائية. يتم تلف السطح الرقيق بسهولة، وترك العينة صعبة أو مستحيلة للصورة. يجب التعامل مع الفيروسات المعدية في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (بسك) وبعضها يتطلب بيئة مختبرية حيوية. تلوث الفيروسات في مستويات السلامة الحيوية (بسل) -3 و -4 يشكل تحديا خاصا لأن هذه البيئات أكثر اضطرابا والفنيين مطلوب to ارتداء معدات الوقاية الشخصية (ب)، مما يقلل من البراعة.

في هذه الدراسة، قمنا بتقييم جهاز جديد للمساعدة في الفيروسات تلطيخ السلبية في بيوكنتينمنت. الجهاز هو كبسولة التي تعمل بمثابة طرف ماصة المتخصصة. مرة واحدة يتم تحميل شبكات في كبسولة، المستخدم ببساطة ينضح الكواشف في كبسولة لتسليم الفيروس والبقع إلى شبكة مغلفة، وبالتالي القضاء على التعامل مع المستخدم من الشبكات. على الرغم من أن هذه التقنية تم تصميمها خصيصا للاستخدام في بسل-3 أو -4 بيوكنتينمنت، فإنه يمكن تخفيف إعداد العينات في أي بيئة المختبر من خلال تمكين السهل تلطيخ السلبية من الفيروس. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة نفسها لإعداد عينات تيم الملون السلبي من الجسيمات النانوية، والجزيئات الكبيرة وعينات مماثلة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) هو أداة فعالة لعرض التشكل والبنية التحتية من العينات البيولوجية التي هي صغيرة جدا أن ينظر إليها مع المجهر الضوئي التقليدي 1 ، 2 ، 3 ، 4 . تيمس تبادل لاطلاق النار الإلكترونات من خلال عينة رقيقة جدا تنتج صورة عالية الدقة والإلكترونات لديها طول موجي أقصر بكثير من الضوء. المناطق من العينة التي ثني أو منع الإلكترونات تظهر مظلمة، في حين أن المناطق التي الإلكترون لوسنت تظهر بيضاء.

عدم وجود مادة كثيفة الإلكترون....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد التجربة في بيئة بسل-2 قبل العمل مع عينات الفيروسات

  1. إعداد أو شراء فورمفار وشبكات النحاس المغلفة الكربون تيم، وعادة 200-400 شبكة.
  2. إدراج شبكات تيم المغلفة في كبسولات.
    1. استخدام عدسة مكبرة لجعل هذه العملية سهلة لأداء. يمكن إدراج واحد أو اثنين من الشبكات في كل كبسولة. يمكن شراؤها كبسولات محملة مسبقا للقضاء على هذه الخطوة إذا رغبت في ذلك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة كبسولة تنتج نوعية جيدة تلطيخ سلبي للتصوير تيم:

أولا، قمنا بتقييم جودة الصور التي تم إنشاؤها باستخدام كل من طريقة قطيرة اليدوي وطرق كبسولة لتلطيخ سلبي فيروس زايير إيبولافيروس. الفيروسات الإيبولافيروسية هي أعضاء في عائلة فيلوفيريداي ، جنبا إلى جنب مع فيروس ماربورغ. وعادة ما يكون إيبولافيروس 80 إلى 100 نانومتر في القطر ويمكن أن يزيد عن 100.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلطيخ السلبية هي تقنية تيم قيمة لتقييم وتحجيم الفيروسات والمجمعات البروتين والجسيمات النانوية. وقد تم إعداد قطرات من هذه العينات عن طريق التحرك اليدوي للشبكات من كاشف إلى البقع السلبية البروتوكول الكلاسيكي لأكثر من نصف قرن. إنها عملية بسيطة، ولكنها تتطلب الخبرة المكتسبة من خلال التدريب لإنجازها بنجاح. لا يزال يعتبر التلطيخ السلبي ممتازة من مجموعة من أحدث المهارات والمطلوب للغاية في العديد من مختبرات تيم. طريقة الكبسولة لديها العديد من المزايا المميزة على طريقة قطرات اليدوي، وخاصة .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات الواردة في هذه المادة هي تلك من المؤلفين وليس بالضرورة أيد من قبل الجيش الأمريكي أو وزارة الدفاع.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونود أن نعرب عن شكرنا للدكتور جون كارا وروينا شكمان على تقديمه إيبولا نانو-فلبس المنقى والدكتور راجيني مدهساني لتوفير فيروس تشيكونغونيا والدكتور تشارلز (جيسون) لإيصال فئران الفئران المختبرية التي تعبر عن البروتينات السكرية لفيروس إيبولافيروس. نود أيضا أن نشكر ماج كارل سوفلر على تسهيل برنامج التدريب الصيفي (سيب) وبرنامج التلمذة الصناعية والهندسية (سيب) والدكتورة كاثرين فيلهلمسن للتدريب على السلامة في المختبر.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Formvar / الكربون المغلفة TEM شبكاتSPI3420C-MB200 شبكة Cu Pk / 100
mPrep / g كبسولاتEMS85010-01box
mPrep / f قارناتEMS85010-11قياسية 16 / Pk
glutaraldehdydeEMS16320محلول 50٪ ، EM الصف
أوزميوم رباعي أكسيدEMS191904٪ محلول
أسيتات اليورانيلEMS22400مسحوق
حمض الفوسفوتونغستيك البوتاسيومEMS19500مسحوق
ورق ترشيحواتمان1450-090حجم 50
مجهر إلكتروني نقلJEOLJEM-1011TEM
مائي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
  3. Curry, A., Appleton, H.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Negative StainingTEM GridsBiocontainmentVirus TEMCapsule MethodElectron MicroscopyGlutaraldehyde FixativeUranyl AcetatePhosphotungstic AcidOsmium Tetroxide

Related Articles