استخدام كبسولات لالتلطيخ السلبي من العينات الفيروسية ضمن بيوكنتينمنت

ملخص

يوفر هذا البروتوكول تعليمات لعينات فيروس تلطيخ السلبية التي يمكن استخدامها بسهولة في بسل-2، -3، أو -4 المختبرات. ويشمل استخدام كبسولة المعالجة المبتكرة، الذي يحمي شبكة المجهر الإلكتروني انتقال ويوفر للمستخدم التعامل أسهل في البيئات أكثر اضطرابا ضمن بيوكنتينمنت.

الملخص

يستخدم انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) لمراقبة البنية التحتية للفيروسات ومسببات الأمراض الميكروبية الأخرى مع قرار نانومتر. معظم المواد البيولوجية لا تحتوي على عناصر كثيفة قادرة على تشتت الإلكترونات لخلق صورة؛ وبالتالي، وصمة عار السلبية، الذي يضع أملاح المعادن الثقيلة الكثيفة حول العينة، مطلوب. من أجل تصور الفيروسات في تعليق تحت تيم يجب تطبيقها على شبكات صغيرة المغلفة مع سطح شفاف فقط نانومتر سميكة. ونظرا لصغر حجمها وهشاشتها، يصعب التعامل مع هذه الشبكات وتتحرك بسهولة بواسطة التيارات الهوائية. يتم تلف السطح الرقيق بسهولة، وترك العينة صعبة أو مستحيلة للصورة. يجب التعامل مع الفيروسات المعدية في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (بسك) وبعضها يتطلب بيئة مختبرية حيوية. تلوث الفيروسات في مستويات السلامة الحيوية (بسل) -3 و -4 يشكل تحديا خاصا لأن هذه البيئات أكثر اضطرابا والفنيين مطلوب to ارتداء معدات الوقاية الشخصية (ب)، مما يقلل من البراعة.

في هذه الدراسة، قمنا بتقييم جهاز جديد للمساعدة في الفيروسات تلطيخ السلبية في بيوكنتينمنت. الجهاز هو كبسولة التي تعمل بمثابة طرف ماصة المتخصصة. مرة واحدة يتم تحميل شبكات في كبسولة، المستخدم ببساطة ينضح الكواشف في كبسولة لتسليم الفيروس والبقع إلى شبكة مغلفة، وبالتالي القضاء على التعامل مع المستخدم من الشبكات. على الرغم من أن هذه التقنية تم تصميمها خصيصا للاستخدام في بسل-3 أو -4 بيوكنتينمنت، فإنه يمكن تخفيف إعداد العينات في أي بيئة المختبر من خلال تمكين السهل تلطيخ السلبية من الفيروس. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة نفسها لإعداد عينات تيم الملون السلبي من الجسيمات النانوية، والجزيئات الكبيرة وعينات مماثلة.

المقدمة

انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) هو أداة فعالة لعرض التشكل والبنية التحتية من العينات البيولوجية التي هي صغيرة جدا أن ينظر إليها مع المجهر الضوئي التقليدي ^{1 ، 2 ، 3 ، 4} . تيمس تبادل لاطلاق النار الإلكترونات من خلال عينة رقيقة جدا تنتج صورة عالية الدقة والإلكترونات لديها طول موجي أقصر بكثير من الضوء. المناطق من العينة التي ثني أو منع الإلكترونات تظهر مظلمة، في حين أن المناطق التي الإلكترون لوسنت تظهر بيضاء.

عدم وجود مادة كثيفة الإلكترون....

البروتوكول

1. إعداد التجربة في بيئة بسل-2 قبل العمل مع عينات الفيروسات

1. إعداد أو شراء فورمفار وشبكات النحاس المغلفة الكربون تيم، وعادة 200-400 شبكة.
2. إدراج شبكات تيم المغلفة في كبسولات.
   1. استخدام عدسة مكبرة لجعل هذه العملية سهلة لأداء. يمكن إدراج واحد أو اثنين من الشبكات في كل كبسولة. يمكن شراؤها كبسولات محملة مسبقا للقضاء على هذه الخطوة إذا رغبت في ذلك.

النتائج

طريقة كبسولة تنتج نوعية جيدة تلطيخ سلبي للتصوير تيم:

أولا، قمنا بتقييم جودة الصور التي تم إنشاؤها باستخدام كل من طريقة قطيرة اليدوي وطرق كبسولة لتلطيخ سلبي فيروس زايير إيبولافيروس. الفيروسات الإيبولافيروسية هي أعضاء في عائلة فيلوفيريداي ، جنبا إلى جنب مع فيروس ماربورغ. وعادة ما يكون إيبولافيروس 80 إلى 100 نانومتر في القطر ويمكن أن يزيد عن 100.......

المناقشة

تلطيخ السلبية هي تقنية تيم قيمة لتقييم وتحجيم الفيروسات والمجمعات البروتين والجسيمات النانوية. وقد تم إعداد قطرات من هذه العينات عن طريق التحرك اليدوي للشبكات من كاشف إلى البقع السلبية البروتوكول الكلاسيكي لأكثر من نصف قرن. إنها عملية بسيطة، ولكنها تتطلب الخبرة المكتسبة من خلال التدريب لإنجازها بنجاح. لا يزال يعتبر التلطيخ السلبي ممتازة من مجموعة من أحدث المهارات والمطلوب للغاية في العديد من مختبرات تيم. طريقة الكبسولة لديها العديد من المزايا المميزة على طريقة قطرات اليدوي، وخاصة .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Formvar / الكربون المغلفة TEM شبكات	SPI	3420C-MB	200 شبكة Cu Pk / 100
mPrep / g كبسولات	EMS	85010-01	box
mPrep / f قارنات	EMS	85010-11	قياسية 16 / Pk
glutaraldehdyde	EMS	16320	محلول 50٪ ، EM الصف
أوزميوم رباعي أكسيد	EMS	19190	4٪ محلول
أسيتات اليورانيل	EMS	22400	مسحوق
حمض الفوسفوتونغستيك البوتاسيوم	EMS	19500	مسحوق
ورق ترشيح	واتمان	1450-090	حجم 50
مجهر إلكتروني نقل	JEOL	JEM-1011	TEM

مائي