ويصف هذا البروتوكول إعطاء التطعيمات للفئران 344 فيشر مع فرانسيسيلا تولارنسيس- يحاكي هذا الإجراء الرئوي تعرض البشر لهذا الوكيل بيوثريات المحتملة، ويمكن استخدامها لاختبار اللقاح والفعالية العلاجية ضد الاضطرابات الرئوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعطاء التطعيم من فيشر 344 الفئران مع فرانسيسيلا تولارنسيس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
عدوى الرئة ببكتيريا فرانسيسيلا تولارنسيس يمكن أن يؤدي إلى أمراض خطيرة ومميتة، الاضطرابات، في البشر. بسبب النقص الحالي في لقاح تولاريميا المعتمدة بالنسبة للبشر، هو ركز البحث على تطوير اللقاحات استخدام نماذج حيوانية مناسبة. فأر فيشر 344 برز كنموذج يعكس قابلية البشر للإصابة تولارنسيس واو ، وبالتالي هو نموذج جذاب لتطوير اللقاحات الاضطرابات. إعطاء التطعيم من الفئران 344 فيشر مع تولارنسيس واو يحاكي التعرض الرئوي في البشر. النجاح في إيصال إلى القصبة الهوائية الفئران حاسمة بالنسبة لإيصال الرئوية. يستخدم المنظار مع الإضاءة بشكل صحيح التنبيب tracheae تخديره من الفئران؛ يحدد موضع الصحيح داخل القصبة الهوائية بواسطة جهاز بسيط للكشف عن التنفس. بعد التنبيب، يتم تسليم ثقافة تولارنسيس واو في جرعة يقاس عن طريق الحقن. هذا الأسلوب توحد الرئوية تسليم ف. تولارنسيس داخل القصبة الهوائية الفئران لتقييم فعالية اللقاحات.
المقدمة
ف. تولارنسيس (قدم) يسبب المرض البشري والاضطرابات. عندما تكتسب البكتيريا من خلال الطريق الرئوي، هذا يؤدي إلى الاضطرابات الرئوي، وارتفاع معدلات الاعتلال والوفيات1. تولارنسيس واو يعتبر عامل بيوثريت بسبب الخطر المرتبطة بأشكال الضبوبيه، وحاليا لا يوجد لقاح المعتمدة للاستخدام البشري في الولايات المتحدة يجري حاليا بذل جهود مكثفة لتطوير لقاحات والتدابير العلاجية ضد الاضطرابات الرئوي، لحماية السكان ضد الاستخدام غير المشروع لهذه بيوثريت البكتيرية.
الكثير من البحوث الاضطرابات قد ركزت على النموذج الماوس، بسبب الحساسية المفرطة من الفئران للإصابة تولارنسيس واو ، وانتشار المواد الكاشفة. ومع ذلك، أثبتت الفئران لتكون نموذجا صعبة لتطوير اللقاحات، بسبب صعوبة إثبات نجاعة اللقاح في هذا النموذج2. في الآونة الأخيرة، وقد وضعت الفئران فيشر 344 كنموذج ل تطوير لقاح تولاريميا3. حساسية الفئران فيشر 344 لنوع مختلف من فرعي تولارنسيس واو يحاكي حساسية البشرية4، ويمكن حماية الفئران ضد التحدي الرئوية تولارنسيس ف. عن طريق التلقيح بسلالة لقاحات حية المعروفة لحماية البشر5،،من67. نظراً لأن الفئران فيشر 344 نماذج بعض ميزات تولارنسيس واو العدوى للبشر، قد يكون نموذجا مفيداً للغاية لتطوير اللقاح الذي يحمي الرئة تولارنسيس واو التعرض.
لقاح فعال يحتاج إلى حماية البشر ضد التعرض الرئوي إلى واو تولارنسيس. وسيكون التعرض الرئوي الأكثر احتمالاً من تسلحي تولارنسيس واو البكتيريا الضبوبيه استنشاقه إلى الرئتين8. بيد أن توليد الهباء الجوي من تولارنسيس واو خطرة ومرهقة، ويتطلب معدات متخصصة والاحتواء. طرق بديلة للتعرض الرئوية في الفئران التي ربما تكون أكثر قابلة للتكيف لمختبرات متعددة تفتقر إلى المعدات المتخصصة عن طريق إعطاء التطعيم6. ويستخدم هذا الأسلوب المنظار للموضع الصحيح من قسطرة داخل القصبة الهوائية من هو الجرذ أنيسثيتيزيد. يتم التحقق من وضع داخل القصبة الهوائية، بدلاً من المريء، بجهاز بسيط لأن يتصور تدفق الهواء من الرئتين. ف. تولارنسيس في وقت لاحق إلى الرئتين عن طريق القسطرة بتسليم الإدارة مع حقنه، تليها إدخال الهواء إلى القسطرة لضمان تسليم البكتيريا الرئوية. وفي المقابل، تشير إلى أن التطعيم داخل الآنف في الفئران جيمسكي5 ذكرت سابقا أن تولارنسيس واو تلقيح في الفئران فيشر 344 عبر الطريق داخل الآنف لا يكون مثقف من الرئتين حتى 3 أيام بعد التطعيم، لا تؤدي إلى التسليم المباشر من البكتيريا إلى الرئتين.
عامل تحديد أشكال ف. تولارنسيس (subsp.تولارنسيس ف. تولارنسيس، ف. تولارنسيس subsp. هولاركتيكا) تتطلب إجراءات الاحتواء السلامة الأحيائية المستوى 3 (BSL3)، الذي سيحول بالفيديو. ومع ذلك، ف. نوفيسيدا (الجبهة الوطنية) معفى من حالة عامل تحديد سبب لها أفيرولينسي في صحة البشر، ويمكن استخدامها بأمان تحت ظروف السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2)9،10. وعلاوة على ذلك، يخدم الجبهة الوطنية كأساس اللقاحات الموهنة الحية التي يمكن أن تحمي ضد التعرض تولارنسيس واو الرئوية عند تسليمها عن طريق إعطاء التطعيم11،،من1213. يسمح الأسلوب الذي قدم إلى هنا للدراسة للإصابات التي تحدث من خلال الطريق الرئوي استخدام الفئران كنموذج للبشر. يمكن تنفيذ هذه التقنية دون الحاجة إلى معدات متخصصة توليد الهباء الجوي. واستخدمت الجبهة الوطنية للتقنيات التي تم تصويرها هنا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هذا العمل قد أنجز يتفق بشكل صارم مع التوصيات الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "المعاهد الوطنية للصحة". وافق الحيوانية البروتوكولات التي تنطوي على القوارض بجامعة تكساس في "سان أنطونيو رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) تحت بروتوكول MU009(RA).
1. إعداد القسطرة ومؤشر القصبة الهوائية والعدوى تولارنسيس ف.
قطع- تحضير القسطرة (20 × 2 في)
- 20 x 2 في الإبرة وطحن غيض إبرة حادة والسلس مع الانتهاء أداة دوارة.
ملاحظة: ينبغي السماح طول الإبرة يتثلم تلميح المعدنية ﻹلغاء ما يقرب من 3 مم إلى الأكمام القسطرة عند موضعها تماما على الإبرة يتثلم. إبرة يتثلم يعطي الصلابة الهيكلية قسطرة للسماح بوضع القسطرة في القصبة الهوائية، وغياب طرف إبرة يتثلم جاحظ من الأكمام القسطرة يمنع الإصابة إلى القصبة الهوائية. - تنظيف يتثلم الإبر واستخدام الإيثانول 70% بالقسطرة وتعقيم تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية على 15 دقيقة
- 20 x 2 في الإبرة وطحن غيض إبرة حادة والسلس مع الانتهاء أداة دوارة.
- إعداد مؤشر القصبة الهوائية
- تقليم تلميح ماصة ميليلتر 1,000 للسماح التلميح الجلوس في افتتاح قسطرة وشكل ختم الغلق.
- إزالة عامل تصفية من 200 ميليلتر الأيروسول الحاجز ماصة نصيحة ومكان داخل نصيحة ماصة ميليلتر 1,000 سابقا المشذبة.
- ضمان عامل التصفية يمكن أن تتحرك بحرية داخل الحافة ماصة ميليلتر 1,000 عندما أشار في التلميح تلميح إلى أسفل.
- العدوى تولارنسيس ف.
- سلالة تنمو ف. تولارنسيس بين عشية وضحاها على طبق أجار المناسبة في 37 درجة جيم كشط ما يقرب من 100 ميليلتر من الحشيش البكتيرية من لوحة أجار مع عقيمة تطعيم حلقة وتستخدم لتطعيم 500 مل قارورة Erlenmeyer الذي يحتوي على 250 مل متوسط النمو السائلة المناسبة (للجبهة الوطنية: فول الصويا تريبتيك مرق (TSB) تستكمل مع 0.1% L-سيستين هيدروكلورايد مونوهيدرات) واحتضان المصافحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: ف. نوفيسيدا المستخدمة في الفيديو قد نمت على طبق أجار (TSA) فول الصويا تريبتيك تكملة مع 0.1% L-سيستين هيدروكلورايد مونوهيدرات. - الطرد المركزي ثقافة السائل نمت بين عشية وضحاها في س 4,221 ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق وإزالة المادة طافية دون تعطيل بيليه البكتيريا.
تنبيه: يرجى اتباع مؤسسة ' s توصيات السلامة الأحيائية لتجاهل المادة طافية. - بلطف إعادة تعليق بيليه البكتيرية مع 25 مل متوسطة السائل المناسب (Fn: TSB تستكمل مع 0.1% L-سيستين هيدروكلورايد مونوهيدرات) تتضمن والغليسيرول 10%، باستخدام ماصة 25 مل.
- باستخدام ماصة 1 مل، قاسمة ثقافة البكتيرية ريسوسبينديد إلى 500 ميليلتر مختبرين في قارورة، تجميد في حمام الثلج الجاف/إيثانول، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- لتحديد عيار القنينات المجمدة الثقافة، إزالة اثنين القنينات المجمدة مخزنة في-80 درجة مئوية وذوبان الجليد على الجليد، وإجراء تخفيف المسلسل في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) متبوعاً بالطلاء على متوسط النمو المناسب (Fn: حساب السياحة الفرعي الذي يحتوي على 0.1% L-سيستين هيدروكلوريد). لوحات المحتضنة ح 24-48 في 37 درجة مئوية، ويتم تعداد وحدات تشكيل مستعمرة (زيمبابوي) لحساب عدد الخلايا البكتيرية داخل قارورة الثقافة المجمدة (متوسط قنينات اثنين)-
- تعد العدوى البكتيرية من ذوبان قنينة مجمدة في الجليد ومن ثم تضعف الثقافة مع برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي 10 7 زيمبابوي/100 ميليلتر. ينبغي أن تكون العدوى بتركيز سوف تسفر عن زيمبابوي المرجوة في 100 ميليلتر (تركيز النهائي والغليسيرول داخل العدوى لا يمكن أن يكون أكثر من 3%، للحيلولة دون خنق الفئران). يمكن استخدام قنينات الثقافة المجمدة مخزنة في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر بعد التحضير.
- سلالة تنمو ف. تولارنسيس بين عشية وضحاها على طبق أجار المناسبة في 37 درجة جيم كشط ما يقرب من 100 ميليلتر من الحشيش البكتيرية من لوحة أجار مع عقيمة تطعيم حلقة وتستخدم لتطعيم 500 مل قارورة Erlenmeyer الذي يحتوي على 250 مل متوسط النمو السائلة المناسبة (للجبهة الوطنية: فول الصويا تريبتيك مرق (TSB) تستكمل مع 0.1% L-سيستين هيدروكلورايد مونوهيدرات) واحتضان المصافحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
2. فأر التخدير
- الاتصال في دائرة التخدير المرذاذ isoflurane التشغيل بشكل صحيح من جهاز التخدير.
- توصيل الغاز مسح أنبوب في دائرة التخدير بالغاز مسح النظام.
- فتح تدفق الأوكسجين على جهاز التخدير إلى 4 لتر/دقيقة
- تعيين المبخر إيسوفلوراني إلى 5%-
- وضع الفئران في غرفة التخدير.
ملاحظة: نحن عادة استخدام الفئران بين 8-10 أسابيع من العمر (130-180 ز)؛ الفئران الشابة صعبة لتطعيم عن طريق هذا الأسلوب نظراً لصغر حجم تجويف الفم. - عندما تقلد التخدير قد حدث، الحفاظ على الفئران في إيسوفلوراني 5%، الأكسجين 2 لتر في الدقيقة للغاية. وهذا يستغرق حوالي 3-10 دقيقة
- تحديد عمق التخدير بنوعية ومعدل التنفس وضربات القلب، ورد فعل منعكس التحفيز كما هو الحال في اختبار قرصه تو. تتم الإشارة إلى العمق المثالي للتخدير من 1-1.5 s العد بين كل التنفس.
3. إعطاء التطعيم
- إزالة الفئران من دائرة التخدير ومكان الفئران دورسالي على الوقوف تنبيب القوارض. إرفاق الأسنان الأمامية من الفئران لحامل لإبقاء الجرذ في المكان-
ملاحظة: إذا كان يبدأ الفئران توقظ أثناء الإجراء، يمكن إزالة القسطرة والفئران عادت إلى دائرة التخدير للوصول إلى طائرة أعمق من التخدير. - استخدام اليد المهيمنة لتحريك اللسان لنفس الجانب كجهة الدعم مع نقطة عريضة خلع الملابس ملقط الإبهام.
- استخدام دعم اليد وتأمين اللسان بالمنظار ضد الفئران ' s الفك السفلي ووضع تصور للقصبة الهوائية والمريء من الحيوان. القصبة الهوائية وسوف تفتح وتغلق كما يتنفس الفئران.
- إدراج القسطرة التي تحتوي على 20-قياس حدث-إبرة، إعداد في الخطوة 1، 1، في القصبة الهوائية. قد تكون هناك مقاومة طفيفة، وقد يكون الإدراج في القصبة الهوائية " وعرة " بسبب القسطرة فرك غضاريف القصبة الهوائية. بسبب الرطوبة أو التنفس الضحلة، يمكن أن تغطيها القصبة الهوائية ابيجلوتيس الذي يمنع التصور من القصبة الهوائية. سيتسبب بلطف لمس حافة الغضروف epiglottis رفرف الغضروف لفتح وكشف القصبة الهوائية.
- إزالة الإبرة حدث من القسطرة مع ضمان القسطرة تظل في القصبة الهوائية-
- السماح لبضع ثوان لتمرير للفئران ليتمكن من التنفس حول القسطرة إدراجها في القصبة الهوائية-
- مقعد بثبات المؤشر القصبة الهوائية على القسطرة فتح. سوف تبين حركة الحاجز الأيروسول القسطرة يتم إدراجها بشكل صحيح في القصبة الهوائية-
- التأكد من أن الفأر هو زرع على الوقوف تنبيب أن يواجه الصدر الحيوان عمودي على الطائرة من الموقف تنبيب.
- إزالة المؤشر القصبة الهوائية وتسليم 100 ميليلتر (10 7 زيمبابوي) من العدوى التي تحتوي على تولارنسيس واو استخدام تلميح ماصة 200 ميليلتر، إيمانا راسخا الجلوس تلميح ضد فتح القسطرة.
- إرفاق 1 مل زلة نصيحة حقنه السلين مليئة بالهواء وتسليم 300 ميليلتر من الهواء للتأكد من وصول العدوى إلى رئات الفئران.
- قم بإزالة القسطرة من القصبة الهوائية والفئران من منهاج العمل الجراحي.
- تسمح للفئران لإيقاظ والعودة إلى القفص. تأكد من أن التنفس قد عادت إلى وضعها الطبيعي.
- تحديد زيمبابوي في تولارنسيس ف. العدوى كما هو موضح في الخطوة 1.3.5 لتأكيد زيمبابوي تسليمها في القصبة الهوائية-
- كرر الخطوات 3.1-3.9 في الحيوانات المحصن (السذاجة) مع 100 ميليلتر PBS بدلاً من العدوى.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن تحديد استجابة خلطيه لإعطاء التطعيم من واو تولارنسيس في الفئران بواسطة مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA) ضد البكتيريا إبطال الأشعة فوق البنفسجية، كما هو موضح سابقا11. وكانت استجابة "ز الغلوبولين المناعي" (IgG) مجموع الفئران فيشر 344 للبكتيريا خلية كله المعطل التطعيم إعطاء منصب المقررة مع عبئا الموهنة للجبهة الوطنية (107 زيمبابوي العدوى) في يوم 14 ويوم 28 (الشكل 1). وتلقت الفئران تطعيم وهمية إينتراتراتشيلي ب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
فأر فيشر 344 أصبحت نموذجا هاما ل تطوير لقاح تولاريميا3. التعرض إلى واو تولارنسيس الطريق الرئوي من خلال أمر حاسم لإثبات فعالية ضد أشكال تسلحي ف. تولارنسيس، لأن هذه يتم تسليمها كالهباء الجوي. وتسهل إعطاء التطعيم من الفئران تعرض الرئتين الفئران إلى واو تولارنسيس دون الحاجة للأيروسول كبيرة ومكلفة ومعقدة أجهزة توليد. جميع التجارب التي تستخدم عامل تحديد أشكال تولارنسيس ف. بالإضافة إلى ذلك يتطلب الاحتواء BSL3، التي تحدث عادة في الفضاء مقيدة بشدة. وهكذا، هذا الأسلوب يقل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
شكر وتقدير
أيد هذه الدراسة وكالة الحد من تهديد الدفاع (متخصصون) وبموجب العقد HDTRA1-14-ج-0116، والمركز للتفوق في "علم الجينوم العدوى" (DOD #W911NF-11-1-0136).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شفرة الألياف البصرية GreenLine مقاس 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh الملف الشخصي الأمريكي |
| نظام GreenLight مقبض منظار الحنجرة | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet IV قسطرة | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| محاقن معقمة ذات طرف انزلاق 1 مل | BD | 309659 | |
| ملقط ضمادة الإبهام | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 & طرف حاجز L | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 & طرف الماصة L | أوليمبوس بلاستيك | 24-173 | |
| Dremel 3000-2 / 28 مجموعة الأدوات الدوارة | Dremel | 3000228 | |
| حامل التنبيب القوارض | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| آلة تخدير القوارض | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| غرفة تخدير القوارض | برينتري العلمي | AB 1 |
المراجع
- Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. Tularemia. Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).
- Lyons, C. R., Wu, T. H. Animal models of Francisella tularensis infection. Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).
- Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4. Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).
- Ray, H. J., et al. The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies. PloS one. 5, e9952(2010).
- Jemski, J. V. Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats. Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).
- Wu, T. H., et al. Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains. Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).
- Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains. Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).
- Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis. Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).
- Kingry, L. C., Petersen, J. M. Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida. Front Cell Infect Microbiol. 4, 35(2014).
- Rohmer, L., et al. Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains. Genome Biol. 8 (6), R102(2007).
- Chu, P., et al. Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates. PLoS Pathog. 10 (10), e1004439(2014).
- Signarovitz, A. L., et al. Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112ΔiglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model. PloS one. 7 (10), e47639(2012).
- Cunningham, A. L., et al. Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB. Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
