يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الكشف عن استعمار الإشريكيّة القولونية Enterohemorrhagic موريني واستضافة بنظام الإضاءة الحيوية غير الغازية في فيفو

9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56169

⸱

أبريل 9, 2018

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

في هذه المقالة

ملخص

ويقدم بروتوكول مفصلاً نموذج الماوس ل enterohemorrhagic الاستعمار كولاي (الإشريكيّة) باستخدام البكتيريا المسماة الإضاءة الحيوية. يمكن المضي قدما الكشف عن هذه البكتيريا طرحه غير الغازية في فيفو التصوير النظام في الحيوانات الحية فهمنا الحالي لاستعمار القولونية.

الملخص

انتيروهيمورهاجيك كولاي (الإشريكيّة) O157:H7، الذي هو مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية التي كاوسيسديارهيا، التهاب القولون النزفي (النظام المنسق)، ومتلازمة يوريمي الانحلالي (HUS)، استعمار للامعاء للبشر. إلى دراسة مفصلة إليه القولونية الاستعمار المجراة، من الضروري أن لديها نماذج حيوانية لرصد وقياس الاستعمار القولونية. نظهر هنا نموذج استعمار القولونية ماوس عن طريق تحويل بلازميد تعرب عن طرحه القولونية لرصد وقياس الاستعمار القولونية في معيشة المضيفين. إظهار الحيوانات تلقيح مع القولونية المسمى الإضاءة الحيوية إشارات طرحه مكثفة في الفئران بالكشف مع غير الغازية في فيفو نظام التصوير. بعد أيام 1 و 2 مرحلة ما بعد الإصابة، إشارات طرحه يمكن لا يزال يتم الكشف عن في الحيوانات المصابة، مما يوحي بأن استعمار القولونية في المضيفين لمدة يومين على الأقل. نحن أيضا إثبات أن موقع هذه الإشريكيّة طرحه للامعاء الماوس، على وجه التحديد في الأعور والقولون، من صور السابقين فيفو . قد يعمل هذا النموذج الاستعمار القولونية الماوس كأداة للنهوض بالمعرفة الحالية لآلية الاستعمار القولونية.

المقدمة

O157:H7 القولونية هو ممرض الذي يسبب الإسهال1، HS2،3من الحص، و الفشل الكلوي الحاد حتى4 عن طريق الأغذية أو المياه الملوثة. الإشريكيّة انتيروباكتيريوم المسببة للأمراض، وكولونيزيس إلى الجهاز الهضمي من البشر1. عندما القولونية أولاً الانضمام إلى المضيف ظهارة الأمعاء، أنها حقن عوامل الاستعمار في الخلايا المضيفة من خلال نظام إفراز الثالث نوع (T3SS) يعمل بمثابة حقنه جزيئي الذي يحفز إرفاق ويمحوا الآفة (A/E) فيما بعد لفرض الالتصاق (الاستعمار)5. يتم ترميز هذه الجينات المشاركة في تشكيل الآفة A/E بمحور enterocyte إغاراته (لي) الإمراضية الجزيرة5.

الإضاءة الحيوية رد فعل المواد كيميائية المنتجة للضوء، في لوسيفراس الذي يحفز به لوسيفرين الركيزة لتوليد الضوء المرئي6. وتتطلب هذه العملية الانزيمية غالباً وجود الأوكسجين أو الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)6. الإضاءة الحيوية التصوير (BLI) يسمح الباحثين للتصور وتكميم التفاعلات المضيف الممرض في الحيوانات الحية7. ويمكنك تمييز BLI دورة العدوى البكتيرية في الحيوانات الحية باتباع هذه البكتيريا طرحه كما أنها تهاجر إلى غزو أنسجة مختلفة7؛ وهذا يكشف عن تطور ديناميكية للعدوى. وعلاوة على ذلك، يرتبط الحمولة البكتيرية في الحيوانات إلى إشارة طرحه8؛ وبالتالي، مؤشر مناسب لتقدير الظروف المرضية للحيوانات التجريبية بطريقة بسيطة ومباشرة.

بلازميد المستخدمة هنا يتضمن مشغل لوسيفراس، لوكسكدابي، ومن بكتيريا لومينيسسينس فوتورهابدوس أن ترميز الخاصة به الركيزة لوسيفراس7،9. بتحويل هذا بلازميد معربا عن لوسيفراس إلى البكتيريا، يمكن رصد عمليات الاستعمار والعدوى عن طريق مراقبة هذه البكتيريا طرحه في الحيوانات الحية. إجمالاً، BLI والبكتيريا المسماة الإضاءة الحيوية السماح للباحثين رصد أرقام البكتيرية والموقع وبقاء البكتيريا مع العلاج/العلاج بالمضادات الحيوية، والتعبير الجيني البكتيرية في استعمار العدوى/6، 7-قد تم الإبلاغ عن العديد من البكتيريا المسببة للأمراض أن نعرب عن مشغل لوكسكدابي لفحص تعبيرها دورة و/أو الجينات الإصابة بالعدوى. هذه البكتيريا، بما في ذلك أوروباثوجينيك كولاي10، الإشريكيّة8،11،،من1213، انتيروباثوجينيك كولاي (أبيك)8، المضادات رودينتيوم،من1415، typhimurium السالمونيلا16، الليستريه المستوحدة17، واليرسينيا انتيروكوليتيكا18،19، و20من الكوليرا، وقد وثقت.

وضعت عدة نماذج تجريبية لتسهيل دراسة القولونية الاستعمار في المختبر و في فيفو21،،من2223. ومع ذلك، هناك نقص في نماذج حيوانية مناسبة لدراسة الإشريكيّة الاستعمار في فيفو، وبالتالي قلة الناتجة من التفاصيل. لتسهيل دراسة الإشريكيّة الاستعمار إليه في فيفو، أنها ذات قيمة لبناء نماذج حيوانية لمراقبة وقياس الاستعمار القولونية في الحيوانات الحية في طريقة غير الغازية.

ويصف هذه المخطوطة نموذج استعمار القولونية ماوس يستخدم نظام تعرب عن طرحه لمراقبة الإشريكيّة الاستعمار على مر الزمن في معيشة المضيفين. إينتراجاستريكالي يتم تلقيح الفئران مع القولونية المسمى الإضاءة الحيوية وتم الكشف عن إشارة طرحه في الفئران مع غير الغازية في فيفو التصوير النظام13. الفئران المصابة مع القولونية المسمى الإضاءة الحيوية أظهرت إشارات طرحه كبيرة في الأمعاء بهم بعد يومين بعد الإصابة، مما يوحي بأن المستعمر هذه البكتيريا في الأمعاء المضيف بعد يومين بعد الإصابة. السابقين فيفو بيانات الصورة أظهرت أن هذا الاستعمار على وجه التحديد في الأعور والقولون من الفئران. باستخدام هذا النموذج القولونية الماوس، يمكن اكتشاف استعمار القولونية طرحه في المضيف المعيشة في فيفو نظام، لدراسة آليات تفصيلية لاستعمار البكتيريا المعوية، التي قد تشجع على زيادة فهم في التصوير التغيرات الفسيولوجية والمرضية التي يسببها القولونية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تنبيه: O157:H7 القولونية مستوى السلامة الأحيائية 2 (BSL-2) الممرض طبقاً لمراكز "مراقبة الأمراض" والوقاية منها تعليمات السلامة الأحيائية (https://www.cdc.gov/). لذلك، يجب إجراء كافة الإجراءات التجريبية التي تشمل القولونية في منشأة BSL-2. ارتداء قفازات ومعاطف المعمل أثناء إجراء التجربة. العمل في مجلس الوزراء السلامة معتمدة (BSC). تطهير على مقاعد البدلاء التجريبية قبل وبعد الإجراء التجريبي مع الإيثانول 70%. جميع الصكوك أو معدات أنه ينبغي تطهيرها القولونية الاتصال (أو يحتمل أن تكون جهات الاتصال) مع الإيثانول 70% أو التبييض. ينبغي أن تكون النفايات الملوثة (أو يحتمل أن تكون ملوثة) مختومة ويعقم بعناية. ارتداء قناع أو حماية العين، وضعف قفازات أو بذله، إذا لزم الأمر. الفئران الإناث عمرها 6 الأسبوع C57BL/6 تم شراؤها وصيانة في الجامعة مختبر الحيوان مركز من الوطني تشنغ الكونغ (NCKU). قد أقر في التجارب على الحيوانات برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة NCKU (الموافقة رقم 104-039).

1-المسمى بيولوسيفيراسي القولونية بكتيريا جيل

  1. ميكس 50 نانوغرام الحمض الخلوي الصبغي (DNA)، ميكروليتر 1 كل من 10 ميكرومترات إلى الأمام وعكس الإشعال، 2 ميكروليتر 2.5 مم deoxynucleotides (دنتبس)، 2 ميكروليتر 10 × المخزن المؤقت، 0.2 بوليميراز الدنا ميكروليتر، والماء المقطر المزدوجة العقيمة (ddH2س) لوحدة تخزين نهائي من 20 ميكروليتر تضخيم كاناميسين المضادة الكاسيت، نبتيي الجينات24. قالب الحمض النووي من pBSL18024، والتي يتم شراؤها من المشروع بيوريسورسي الوطنية (نبرب). بكر الشروط المدرجة في الجدول 1 وتسلسل التمهيدي متاح في الجدول 2.
  2. اضطر منتجات PCR لناقل استنساخ تجاري بعد عدة البروتوكول (انظر الجدول للمواد).
  3. المكوس في نبتيي الجينات جزء من ناقل الاستنساخ نسيي و سماي واستنساخ في pBBR1MCS4، الذي يهضم نسيي و سكاي من pAKlux29 لإنشاء بلازميد مقاومة كاناميسين، pWF27813.
  4. المكوس مشغل لوكسكدابي ، من لوسيفراس الإعراب عن بلازميد9، pAKlux2، سبيي-التردد وسي واستنساخ سبيي-التردد و سماي هضمها pWF278 لتوليد كاناميسين مقاومة والإعراب عن بلازميد، pWF27913لوسيفراس.
    ملاحظة: للاستخراج بلازميد وتنقية يفتت قصت، استخدام استخراج بلازميد التجارية وأدوات استخراج هلام، على التوالي. لأنزيم الهضم، مزيج 100 نانوغرام الحمض الخلوي الصبغي، العازلة 10 x ميكروليتر 1، 1 ميكروليتر كل إنزيم التقييد المحدد، والعقيمة ddH2س إلى إجمالي حجم 10 ميكروليتر، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 2.5-3.
  5. تحويل بلازميد pWF279 كولاي O157:H7 EDL933 الخلايا المختصة انهانسر مع 2,500 الخامس لمرض التصلب العصبي المتعدد 4.
  6. احتضان خلايا البكتيريا المحولة في 1 مل بيرتاني لوريا (رطل) المتوسطة في 37 درجة مئوية ح 1.
  7. لوحة البكتيريا على صفيحة أجار رطل وتستكمل مع 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين في 37 درجة مئوية ح 16-18.
  8. التحقق من إشارة طرحه بليت في فيفو التصوير الجهاز في اليوم التالي. اختيار مستعمرة واحدة من اللوحة والثقافة أنه في 3 مل رطل وتستكمل مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين في 37 درجة مئوية ح 16-18.
  9. إعداد البكتيريا المتوسطة الأسهم بتمييع والغليسيرول 100% في ddH العقيمة2س لجعل الحل والغليسيرول 30%.
  10. تجميد كاناميسين مقاومة البكتيريا O157:H7 EDL933 كولاي إيواء بلازميد لوسيفراس كمخزون بكتيرية في كريوفيال ملولبة كنسبة 1:1 من البكتيريا الحل والغليسيرول الثقافة و 30% في-80 درجة مئوية. تركيز والغليسيرول النهائي هو 15%.

2. إعداد البكتيريا القولونية طرحه للتطعيم عن طريق الفم

ملاحظة: المخطط الانسيابي الخط الزمني للإجراءات التجريبية لإعداد القولونية والماوس عن طريق الفم تزقيمية مدتها يرد في الشكل 1 للمساعدة في إعداد تجريبية.

  1. الانتصارات البكتيريا O157:H7 EDL933 كولاي إيواء بلازميد لوسيفراس على صفيحة أجار رطل مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين من المخزون-80 درجة مئوية. تنمو هذه البكتيريا ح 16-18 في 37 درجة مئوية.
  2. اختيار مستعمرة واحدة من لوحة بين عشية وضحاها والثقافة في المتوسط 3 مل رطل مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين ح 16-18 في حاضنة 37 درجة مئوية 220 لفة في الدقيقة.
  3. ثقافة فرعية البكتيريا (تخفيف 1: 100) إلى كاناميسين (50 ميكروغرام/مل) تحتوي على مرق رطل ح 2.5-3 في حاضنة 37 درجة مئوية 200 لفة في الدقيقة. (على سبيل المثال، إضافة 2 مل مثقف بين عشية وضحاها البكتيريا إلى متوسط 200 مل رطل مع كاناميسين (50 ميكروغرام/مل) تكمل).
  4. احتضان البكتيريا عن 2.5-3 ح وقياس قيمة الكثافة الضوئية في 600 نانومتر (OD600) حتى القيمة ما بين 0.9 إلى 1. عدد الخلايا البكتيرية في كثافة مستعمرة8 حوالي 10 وحدات تشكيل (زيمبابوي)/مل.
  5. الطرد المركزي إعادة استزراع البكتيريا في س 8,000 ز لمدة 30 دقيقة، 4 درجة مئوية.
  6. تجاهل المادة طافية دون التحريض بيليه البكتيريا وغسل بيليه مع 100 مل 0.9% عقيمة المالحة العادية بالانفعالات لطيف.
  7. كرر الخطوات من 2.5 و 2.6 مرة واحدة.
  8. بعد الغسيل، الطرد المركزي ثقافة البكتيرية في 8,000 ز خ ل 30 دقيقة، 4 درجة مئوية، وتجاهل المادة طافية بلطف.
  9. المكثفات بيليه في 100-fold مع المحلول الملحي العادي العقيمة 0.9 في المائة. على سبيل المثال، إذا كان يتم فصل البكتيريا 200 مل، إضافة 2 مل المحلول الملحي العادي تعليق بيليه.
  10. تأكيد البكتيريا زيمبابوي (وينبغي أن يكون حوالي 109 زيمبابوي/100 ميكروليتر بعد التكثيف في المحلول الملحي العادي) بطلاء البكتيريا مركزة من خلال تمييع مسلسل إذ25.

3-الماوس تزقيمية الشفوي من القولونية

  1. علاج الفئران C57BL/6 أنثى عمرها 6 الأسبوع مع الماء ستربتوميسين (5 غرام/لتر) من أجل ح 24.
  2. بعد 24 ساعة، قم بالتبديل إلى مياه الشرب العادية لآخر 24 ساعة قبل تزقيمية مدتها. بعد التعامل مع المياه العادية ح 24، الفئران جاهزة تزقيمية الشفوي من القولونية.
  3. ملء المحاقن مع 100 ميكروليتر القولونية البكتيريا عن طريق سحب مرة أخرى على المكبس. ضمان لا فقاعات الهواء في المحاقن. إزالة الفقاعات عن طريق العض المحاقن مع الأصابع.
  4. رفع الحيوان برفق ووضعه على قمة القفص مع الرعاية.
  5. أمسك الماوس بالذيل بعناية، وسوف قبضة الجزء العلوي من القفص الحيوان ومحاولة التحرك بعيداً.
  6. كبح الماوس برفق باستيعاب الجلد فضفاض من الرقبة ومؤخرة الحيوان بالإبهام والسبابة للحيلولة دون نقل رأس الماوس.
  7. أمسك الماوس في وضع عمودي لإدراج إبرة تزقيمية مدتها وضمان رأس الماوس المعطل تداولها والعمودي.
  8. أدخل إبرة تزقيمية مدتها في الفم الماوس بعد سقف الفم وتحريك لأسفل إلى المريء والمعدة.
  9. عند الإبرة المدرج نصف أو ثلثي طول في الماوس، حقن البكتيريا القولونية 100 ميكروليتر، التي تحتوي على حوالي 109 خلايا زيمبابوي.

4-التصور

  1. بعد تزقيمية الشفوي، الكشف عن الإشارات طرحه في أيام 1 و 2.
  2. قبل دراسة الإشارات طرحه من الحيوانات، تخدير عليها قبل وضعها في دائرة isoflurane 2.5% مع الأكسجين 1.5 لتر في الدقيقة.
  3. انتظر لمدة 2-5 دقائق حتى تصبح جميع الفئران فاقداً للوعي وتوقف نقل. الحيوانات على استعداد للكشف في فيفو للإضاءة الحيوية.
  4. الكشف عن والصورة إشارات طرحه من الحيوانات التي في فيفو نظام التصوير. الرجاء مراجعة القسم 5 "الحصول على البيانات" لتشغيل البرنامج. وتخضع جميع الحيوانات أثناء عملية التصوير، إمداد المستمر isoflurane 2.5% مع الأكسجين 1.5 لتر في الدقيقة.
    1. انقر فوق ملف > التركيز يدوياً ويعيش على الماوس.
    2. تحديد كثافة التعرض الوقت والليزر.
    3. انقر فوق الحصول على > التقاط.
  5. لتصوير السابقين فيفو ، euthanize الفئران بخلع عنق الرحم وإزالة الأمعاء أسرة من الفئران المصابة. ضع الأمعاء في طبق بتري 9-سم والصورة في فيفو نظام التصوير. الإعداد هو نفسه في فيفو التصوير إلا إذا تم تعيين حقل الرؤية ألف/باء الرجاء مراجعة القسم 5 "الحصول على البيانات" للحصول على التفاصيل.
    ملاحظة: الأسلوب للتفكك عنق الرحم: كبح جماح الفئران أعلى القفص باستيعاب الذيل مع يدا واحدة حتى أن الحيوانات قبضة القفص. ضع قلم علامة أو الإبهام والإصبع الأول من ناحية أخرى ضد الجزء الخلفي الرقبة في قاعدة الجمجمة. بسرعة قدما باليد أو كائن أثناء تقييد الرأس وسحب إلى الخلف باليد عقد الذيل.
    التحقق عن كثب لتأكيد اعتقال الجهاز التنفسي، ولا نبض القلب.

5. الحصول على البيانات

ملاحظة: يتم سرد البرامج المستخدمة للحصول على البيانات في الجدول للمواد.

  1. للحصول على الصور، افتح "لوحة التحكم اقتناء" البرمجيات (الشكل 2).
  2. حدد "الإنارة"، "صورة"، و "تراكب".
  3. تعيين وقت التعرض "تلقائي". تعيين Binning أنها "متوسطة".
  4. تعيين ƒ/إيقاف ك 1 للإنارة و 8 للصورة. ضوابط ƒ/إيقاف تلقي كمية الضوء الكاشف اتفاقية مكافحة التصحر.
  5. تعيين مجال الرؤية استناداً إلى حقل الصور التي تهم حيازة. الخيار "د" يمكن أن تناسب خمس عمرها 6 الأسبوع الفئران وصورة لهم جميعا في وقت واحد. يمكن الصورة "ج" فئران عمرها 6 الأسبوع ثلاثة في حقل واحد.
  6. مرة واحدة الفئران/النماذج جاهزة للتصوير، انقر فوق "الحصول على" للحصول على الصور.
  7. فتح بيانات الصورة التي تم الحصول عليها.
  8. فتح "لوح ألوان أداة" لوحة (الشكل 3).
  9. حدد أدوات العائد على الاستثمار. ونحن نوصي الدائرة (من أقصى اليسار) نطاق منطقة طرحه على الصور (الشكل 4).
  10. انقر فوق "في تدبير رويس" (رمز القلم الرصاص) لقياس كثافة طرحه السطحية (الشكل 3). تظهر لوحة "قياس العائد على الاستثمار" وقيم القياس الكمي (الشكل 5).
  11. استخدام "تكوين القياس" على الجانب الأيمن من لوحة "قياس العائد على الاستثمار" لتحديد القيم/المعلومات المطلوبة (الشكل 6)، وإلا انقر فوق "تصدير" تصدير هذا الجدول البيانات وحفظها كملف.csv (الشكل 5).
  12. استخدام القيم الموجودة في العمود "مجموع الجريان (p/s)" كتقدير كثافة طرحه في ملف.csv.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نحن تدار الإضاءة الحيوية المسمى القولونية (~ 109 الخلايا البكتيرية) للفئران C57BL/6 الإناث 6-الأسبوع القديمة قبل تزقيمية الشفوي. بعد التطعيم عن طريق الفم القولونية للفئران داخل ح 1، بحثت الحيوانات لإشارة طرحه في فيفو نظام التصوير كما هو مبين في الشكل 7. وأظهرت النتائج إشارة قوية بطرحه في الفئران تزقيمية مع القولونية المسمى الإضاءة الحيوية. قمنا بفحص الإشارات في 2 يوما بعد الإصابة. كما هو موضح في الشكل 8 أ، تلق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وأفيد أن تتحول مع بلازميد لوسيفراس القولونية قد استخدمت لدراسة عن التعريب في المضيفين أو مورثة تعبير في فيفو8،،من1112. كما أبلغ نموذج مورين تظاهروا اليوم للكشف عن توقيت القولونية المستعمر والتعريب في المضيف مورين8. ومع ذلك، نحن نقدم البروتوكول من التفصيل كيفية إدارة التلقيح القولونية للفئران إينتراجاستريكالي وكيفية إعداد البكتيريا طرحه بعناية تزقيمية الشفوي. لمنصب رئيس الماوس وخاصة للماوس تزقيمية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونعترف تشن تشونغ تشي من إدارة "البحوث الطبية"، المركز الطبي لمي تشي (تاينان، تايوان) للمساعدة في الماوس العدوى، والدعم المقدم من مركز جامعة تشينغ كونغ الوطنية الحيوانات المختبرية. هذا العمل معتمد من قبل "وزير العلوم" والتكنولوجيا (معظم) يمنح (الأكثر 104-2321-ب-006-019، 105-2321-ب-006-011،-005 and106-2321-ب-006) CC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حاضنة شاكر حاضنةالبكتيريا YIH DERLM-570R 
حاضنة الاهتزاز المداريFIRSTEKS300حضانة البكتيريا 
pBSL180لجين nptII
pAKlux2مصدر لوكسCDABE أوبرون
T & مجموعة استنساخYeastern BiotechFYC001-20Pتستخدم لاستنساخ TA   ؛
Nsi< / em> INEBR0127Sيستخدم لاستنساخ البلازميد 
Sca< / em> INEBR0122Sيستخدم لاستنساخ البلازميد 
Spe< / em> استخدام I-HFNEBR0133Sلاستنساخ البلازميد 
Sma I استخدام NEBR0141Sلاستنساخ البلازميد 
استخدام T4 ligaseNEBM0202Sلاستنساخ البلازميد 
استخدام Ex TaqTaKaRaRR001Aلتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل
10X Ex Taq BufferTaKaRaRR001Aللاستخدام لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل
dNTP Mix TaKaRaRR001Aاستخدام لتضخيم PCR
آلة PCRالمطبقة Biosystem 2720 Thermal cycler   لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل
استخدام الجلسرينSIGMAG5516-1Lلمحلول تخزين البكتيريا
NaClSigma31434-5KG-Rالكيميائية لصنع LB وسط ، 10 جم / لتر
TryptoneCONDA pronadisaCat 1612.00مادة كيميائية لصنع LB متوسط ، 10 جم / لتر
مسحوق مستخلص الخميرةAffymetrix23547-1 كجممادة كيميائية لصنع رطل متوسط ، 5 جم / لتر
AgarCONDA pronadisaCat 1802.00مادة كيميائية لصنع LB agar
kanamycin المضادات الحيوية SigmaK4000-5G، تستخدم في seleciton
streptomycin  ؛المضادات الحيوية SigmaS6501-100G، والقضاء على الجراثيم في الفئران
EDL933 الخلية المختصةطريقة محلية الصنععلى وثيقة تكميلية   ؛
المثقور الكهربائيMicroPulserللتثقيب الكهربائي
CuvettesGene Pulser / MicroPulser1652086للتثقيب الكهربائي
جهاز طرد مركزي عالي السرعةBeckman CoulterAvanti ، J-26S XPيستخدم لبكتيريا الطرد المركزي   ؛
الدوار ذو الزاويةالثابتة Beckman CoulterJA25.5لبكتيريا الطرد المركزي   ;
الدوار ذو الزاويةالثابتة Beckman CoulterJLA10.5لبكتيريا الطرد المركزي   ؛
زجاجات الطرد المركزيبيكمان كولترREF357003استخدامها لبكتيريا الطرد المركزي 
زجاجات الطرد المركزيThermo Fisher العلمية3141-0500تستخدم لبكتيريا الطرد المركزي   ؛
Eppendorf Biophotometer Plus eppendorfAG 22331 هامبورغلقياس قيمة OD600 للبكتيريا
C57BL / 6 الفئران  مركز المختبر لمعطف مختبر NCKU
، قفازاتلحماية الأفراد   ؛
إيزوفلوران بانيون & شركة BF Biotech Inc.G-8669للتخدير الفئران ، حقنة 1 مل من الدرجة الصيدلانية
  ؛استخدام للتزقيم عن طريق الفم للفئران
قابلة لإعادة الاستخدام 22 جم إبرة& phi ؛ 0.9 مم × طول 50 ممتستخدم للتزقيم الفموي للفئران
الجراحية   مقص  استخدام لتجربة الفئران
التصوير Xenogen IVIS 200طيفPerkin ElmerIVIS لالتقاط الصور الحيوية   ؛
يستخدم برنامج الصور الحيةPerkin Elmerالإصدار 4.1لقياس بيانات الصورة
مصدر استخدام استخدام تغذية كروية نظام استخدام

المراجع

  1. Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
  2. Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
  3. Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
  4. Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
  5. Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90(2012).
  6. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
  7. Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
  8. Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
  9. Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
  10. Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
  11. Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
  12. Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
  13. Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82(2016).
  14. Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
  15. Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
  16. Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
  17. Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
  18. Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
  19. Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
  20. Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
  21. Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977(2013).
  22. Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013(2014).
  23. Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
  24. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  25. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
  26. Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud'homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
  27. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  28. Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
  29. Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
  30. Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
  31. Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
  32. Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
  33. Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M. II, Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
  34. Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
  35. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  36. Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بكتيريا الإشريكية القولونية المسببة لنزيف الأمعاءالتصوير بالتلألؤ البيولوجيالتصوير الحينموذج استعمار الفئرانتقنية التزقيم الفمويقياس الكمية الضوئيةاستعمار الأعوراستعمار القولونالتصوير خارج الجسمالكشف غير الجراحي
الكشف عن استعمار الإشريكيّة القولونية Enterohemorrhagic موريني واستضافة بنظام الإضاءة الحيوية غير الغازية في فيفو
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.