يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس

8.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56171

⸱

أغسطس 20, 2017

 ,  , 
1Unitat de Biologia Cellular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة بروتوكول لاشتقاق بكفاءة وثقافة pluripotent خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الماوس في مرحلة الكيسة.

الملخص

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية (مسك) الماوس هو العملية التي pluripotent هي أنشأت خطوط الخلايا من الأجنة preimplantation. هذه الخطوط الاحتفاظ بالقدرة على تجديد ذاتية أو التفريق تحت شروط معينة. بسبب هذه الخصائص، يتم مسك أداة مفيدة في الطب التجديدي، والنمذجة المرض، ودراسات هندسة الأنسجة. توضح هذه المقالة بروتوكول بسيط للحصول على خطوط مسك مع اشتقاق عالية الكفاءة (60-80 في المائة) باستزراع blastocysts من سلالات الماوس متساهلة في تغذية الخلايا في المعرفة المتوسطة وتستكمل مع العوامل المثبطة اللوكيميا. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول كفاءة استخلاص خطوط ©جميع من سلالات الماوس غير متساهلة، بإضافة بسيطة من خليط من اثنين مثبطات جزيء صغير إلى متوسط الاشتقاق (متوسط 2 طاء). وترد الإجراءات المفصلة في إعداد والثقافة لتغذية الخلايا، جمع وثقافة الأجنة الماوس، واشتقاق والثقافة من خطوط ©جميع. هذا البروتوكول لا يتطلب معدات متخصصة ويمكن أن تنفذ في أي مختبر خبرة الثقافة الأساسية خلايا الثدييات.

المقدمة

الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) هي pluripotent الخلايا المشتقة من الأجنة بريمبلانتيشن، التي تحتفظ بالقدرة على تجديد ذاتية أو التفريق تحت ظروف محددة1. وبناء على هذه الخصائص، أصبحت ESC أداة مفيدة للطب التجديدي، والنمذجة المرض، والأنسجة الدراسات الهندسية2.

استمدت ESC للمرة الأولى من الأجنة الماوس preimplantation، تنشأ خطوط ESC (مسك) الماوس مع النجاح منخفضة3،4. لسنوات، ظلت كفاءة اشتقاق منخفضة نظراً لصعوبة الحفاظ على بلوريبوتينسي في المختبر. وإلى جانب ذلك وجود تغذية الخلايا5، مما يحسن كفاءة الاشتقاق، وتعزيز مرفق مستعمرة والاستقرار كاريوتيبيك6، عدة تعديلات للبروتوكول يؤدي إلى حدوث تحسن في الصيانة بلوريبوتينسي. كانت أهم الإضافة من اللوكيميا المثبطة عامل (LIF) إلى مسك الثقافة المتوسطة7،8، استخدام الأجنة من الخلفية الدلالية 129S29 وثقافة مسك مع المتوسطة وتستكمل مع تعريف المصل، خالية من عوامل التمايز المحتمل10. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت الأدلة الدامغة أن إضافة خليط من اثنين المغيرون جزيء صغير من مسارات الإشارات إلى مسك الثقافة المتوسطة (المعروفة باسم 2i) أفضل وسيلة للحفاظ على بلوريبوتينسي. 2 طاء كوكتيل يتكون من مجموعة المانع مجاهدي خلق PD0325901، مما يقلل من إشارات التمايز عن طريق تثبيط بروتين mitogen تنشيط المسار كيناز (MAPK)، ومثبطات GSK3β CHIR99021، مما يعزز بقاء الخلية في منخفض الكثافة بتنشيط مسار Wnt11.

في هذه المادة، يمكننا وصف بروتوكول بسيط لكفاءة استخلاص خطوط ©جميع من blastocysts الماوس. ونحن اتباع الإجراءات القياسية، استزراع الأجنة من سلالات متساهلة في تغذية الخلايا في اشتقاق المتوسطة وتستكمل مع ليف و استبدال مصل12. يمكن اشتقاق عقب هذا البروتوكول، ومسك خطوط مع الكفاءات المماثلة لتلك التي تم الحصول عليها في المتوسط 2 طاء. وعلى الرغم من ذلك، يمكن إضافة 2 طاء لتجنب المشاكل المحتملة مع الحفاظ على بلوريبوتينسي أو عند العمل مع سلالات غير متساهلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

استخدام الحيوانات في المقاطع أدناه قد تم وافقت عليها "لجنة الأخلاقيات" في الحيوان والإنسان البحث جامعة برشلونة المستقلة ود خلية ' الصيد الزراعة، راماديريا، وأنا Alimentació من محافظة كاتالونيا (بروتوكول #8741).

1-تغذية الخلية المنظمة والتخزين

ملاحظة: القلفة البشرية الليفية (الأكايمية-1) كانت مجمدة في السابق في 1 مل من محلول التجميد التي تتكون من 90% مصل بقرى الجنين (FBS) و 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ( [دمس]) وتخزينها في النتروجين السائل حتى استخدام.

  1. ذوبان الجليد قنينة مبردة من الأكايمية-1 (1 مل) من غمر القنينة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. إضافة محتويات القنينة المبردة المذابة إلى دولبيكو المعالجون مسبقاً ' s النسر التعديل ' s المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 10% FBS لجعل 01:10 إضعاف.
  3. بذور الخلايا المخفف (10 مل) في قارورة T75 والثقافة لهم في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
    4. تغيير
  4. في اليوم التالي، على المديين المتوسط والقضاء على البقايا [دمس]. إزالة المتوسطة وإضافة 10 مل دميم دافئة قبل استكمالها مع 10% FBS.
    5. الثقافة في هفس
  5. وتغيير المتوسطة كل 48 ساعة حتى يصل إلى الثقافة مرحلة المتلاقية. قد يستغرق هذا الأمر حوالي 7 إلى 10 أيام.
  6. لإعداد حل المنظمة، وتمييع mitomycin C في دميم وتستكمل مع 10% FBS بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل. احتضان الخلايا مع حل المنظمة ح 3 في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
  7. إزالة حل المنظمة وشطف الخلايا ثلاث مرات مع 2 مل من هانكس متوازن الملح الحل (حبس) للقضاء على فلول ميتوميسين ج.
  8. لفصل الخلايا المعطل، إضافة 1 مل من قبل حرارة يدتا التربسين الحل واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
  9. مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب التأكد من أنها منفصلة (الهدف العاشر 10 مع 0.3 الفتحة العددية أو NA). إذا لم تكن كذلك، احتضان منهم لبضع دقائق إضافية في 37 درجة مئوية و 5% CO 2. فحص الخلايا مرة أخرى تحت المجهر المقلوب.
  10. "الماصة؛" الحل مع ماصة باستور كي ننأى بكتل الخلية.
  11. تحييد الحل الانزيمية بإضافة 4 مل دميم وتستكمل مع 10% FBS وريسوسبيند-
    12. تأخذ قاسمة لتعليق خلية
  12. وجعل إضعاف 1: 100 في حبس. لتحديد عدد الخلايا، تحميل 10 ميليلتر لتمييع في نويباور ' s الدائرة. عد الخلايا الموجودة في إحدى الساحات الكبيرة الدائرة بموجب مجهر مقلوب (الهدف x 20 مع نا 0.45).
    1. تكرار العد في مجموعة من أربعة مربعات كبيرة. حساب إجمالي عدد الخلايا (ن) كنون = متوسط عدد الخلايا معدود x الحجم الإجمالي x تمييع x 10 4-
  13. الطرد المركزي بقية العينة لمدة 5 دقائق في 200 x غ. تجاهل المادة طافية وبيليه مع تجميد الحل بتركيز 10 6 خلايا كل مل ريسوسبيند.
  14. قاسمة التعليق في قنينات المبردة مع 10 6 خلايا (1 مل) كل. ضع قارورة المبردة في حاوية تجميد وتجميد في-80 درجة مئوية.
  15. في اليوم التالي، تخزين القنينات المبردة في النتروجين السائل-

2. وحدة تغذية "الخلية والثقافة"

  1. واحد إلى أربعة أيام قبل البدء في عملية الاشتقاق، إبطال ذوبان قنينة مبردة التي تتضمن 1 × 10 6 خلايا الأكايمية-1 في حمام مائي في 37 درجة مئوية.
  2. جعل إضعاف 1:6 1-الأكايمية المذابة في تسخينها قبل دميم وتستكمل مع 10% FBS والحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  3. ملء كل بئر من صفيحة 4-جيدا مع 500 ميليلتر من قبل حرارة 0.2 ٪ الجيلاتين من جلد الخنزير والاحتفاظ باللوحة في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 10
    4. إزالة 500 ميليلتر من الجيلاتين من الآبار
  4. وإضافة 500 ميليلتر لتمييع هفس. روك بلطف لوحة لضمان توزيع هفس في الجزء السفلي من الآبار بصورة موحدة. تجنب حركات دائرية، خلاف ذلك سوف تركز الخلايا في مركز البئر.
  5. احتضان لوحة مالا يقل عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% CO 2 للحصول على المونولاير هفس المعطل في كل بئر-
    6. مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب (الهدف العاشر 10 مع نا 0.3)
  6. في اليوم التالي، والتحقق من أنها تعلق والبلوتينيوم الموزعة. تغيير وسيلة للقضاء على فلول [دمس]. إزالة المتوسطة وإضافة 500 ميليلتر من دميم دافئة قبل استكمالها مع 10% FBS.

3. جمع الجنين والثقافة

  1. أربعة أيام قبل جمع الأجنة، وإدارة 5 وحدات دولية من الفرس الحامل ' s المصل تروج عن طريق الحقن داخل للفئران الإناث 6-12 أسبوع القديمة.
    ملاحظة: لقد استخدمنا الإناث من 129S2 أو من سلالات B6CFAF1، على الرغم من أن يمكن استخدام الإناث من سلالات الماوس الأخرى. ومع ذلك، عند العمل مع الإناث من سلالات غير المتساهلة (مثلاً CBA)، المتوسطة ينبغي أن تستكمل مع 2 طاء كما هو مذكور في الخطوة 4، 2-
  2. بعد 48 ساعة، إدارة 5 وحدات دولية من الإنسان المشيمية تروج عن طريق الحقن داخل، وتتزاوج الإناث مع الذكور، على الأقل 8 أسابيع من العمر، بنسبة 1:1. فصل الإناث عن الذكور في اليوم التالي-
    3. إعداد ثقافة خلية 35 ملم طبق بيتري مع عدة قطرات ميليلتر 40 كسوماج المتوسطة وتستكمل مع 4 مغ/مل ألبومين المصل البقري (BSA)
  3. اليوم قبل جمع الأجنة، وملء اللوحة مع الزيوت المعدنية تغطية كامل القطرات. احتضان الطبق على 37 درجة مئوية و 5% CO 2 حجته المتوسطة-
  4. لإعداد الماصات التلاعب بالأجنة، حرارة الجزء أرق من الزجاج طويلة ذات الرؤوس ماصة باستور استخدام موقد بنسن. بمجرد لينة، وسحبها من اللهب وسحب طرفي عن بعضها البعض. كسرها إلى الطول المطلوب. يجب أن يكون القطر الداخلي في تلميح 100-150 ميكرومتر.
  5. Euthanize الفئران الإناث بخلع عنق الرحم ح 45-48 وظيفة-كويتوم (p.c.).
  6. تشريح الفئران لفضح تجويف البطن بقطع الجلد مع منحنى سلس مقص حاد والصفاق مع مقص حاد مستقيم. انتزاع الرحم واحد مع الملقط وقطع قناة استخدام مقص حاد مستقيم، ووضعه في كزب مخزنة حبيس المتوسطة (هكزب) 13 في 37 درجة جيم تكرار العملية لإزالة في قناة أخرى.
  7. دافق أوفيدوكتس مع حقنه 1 مل محملة هكزب الذي عقد في مكان بالملقط الساعاتي لجمع الأجنة 2-خلية-
    ملاحظة: إعداد تأخذ إبرة التنظيف إبرة حقن 30 غ، قطع النهاية، والبرية إلى تلميح صراحة على حجر جلخ.
  8. باستخدام أجهزة ماصة الفم، التقاط الأجنة وغسلها في هكزب والثقافة لهم في الطبق الثقافة الجنين المجهز سابقا على 37 درجة مئوية و 5% CO 2 حتى مرحلة الكيسة. ما يصل إلى 50 الأجنة يمكن أن يكون مثقف في كل قطره 40 ميليلتر. رصد التنمية الجنين كل 24 ساعة تحت ستيريوميكروسكوبي.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، الأجنة يمكن جمعها في مرحلة الكيسة لتقصير الثقافة الجنين في المختبر. وفي هذه الحالة، euthanize الإناث في يوم p.c. 3.5-4.5، تشريح الرحم. وتدفق عليه مع هكزب-

4. اشتقاق الخلايا الجذعية

    1. من إعداد لوحات الاشتقاق في اليوم من زرع الجنين، إعداد المتوسطة الاشتقاق بتكميل المتوسطة دميم مع 100 ميكرومتر 2-β ميركابتوثانول، 1 x "الأحماض الأمينية" الأساسية عدم ، 20% لاستبدال المصل، و 10 3 U/mL ليف.
    2. إذا رغبت في ذلك، أيضا إضافة 1 ميكرومتر من مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 و 3 ميكرومتر مثبطات GSK3 CHIR99021 للحصول على متوسط 2 طاء-
    3. تأخذ لوحة 4-جيدا مع أحادي الطبقة هفس المعطل (الخطوة 2، 6) من حاضنة. إزالة المتوسطة وإضافة 800 ميليلتر من الاشتقاق قبل حرارة متوسطة لكل بئر. العودة اللوحة للحاضنة.
  2. إزالة Zona pellucida والجنين البذر
    1. إعداد ثقافة خلية 35 ملم طبق بيتري مع قطرات ثلاث 30 ميليلتر من تيرودي الحمضية ' s الحل 14 وقطرات ثلاث 30 ميليلتر من المتوسطة الاشتقاق. تغطية القطرات مع الزيوت المعدنية وإبقاء الطبق على 37 درجة مئوية.
    2. أخذ الطبق الثقافة الجنين من الحاضنة. واحداً تلو الآخر، نقل بلاستوسيستس من قطرات الثقافة إلى تيرودي حمضية ' s حل انخفاض استخدام ماصة تلاعب الأجنة. إذا كان ذلك ممكناً، حدد فقط blastocysts الموسعة لبدء عملية الاشتقاق.
    3. مراقبة الهضم zona pellucida تحت ستيريوميكروسكوبي. حالما يختفي بيلوسيدا زونا، نقل الكيسة إلى انخفاض متوسط اشتقاق من أجل تغسل تيرودي الحمضية ' حل s-
    4. تأخذ لوحة الاشتقاق 4-جيدا من حاضنة والبذور واحدة خالية من زونا الكيسة على وحدة التغذية خلايا في كل بئر-
    5. عودة لوحة الاشتقاق 4-جيدا للحاضنة والثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
  3. تغير نمو الخلايا الجذعية الرصد والمتوسطة
    1. رصد ثقافات كل 24 ساعة تحت مجهر مقلوب (الهدف X 20 مع نا 0.45). من المهم ملاحظة ما إذا كانت هناك علامات على تمايز الخلايا الجذعية، مثل تورم الخلايا الانكسار المحيطة بثمرة أو حتى دفع التغذية الخلايا جانبا.
    2. كل يوم، تغيير وسيلة للثقافة. تأخذ اللوحة 4-جيدا من الحاضنة وإزالة المتوسطة من كل بئر وإضافة 800 ميليلتر من المتوسطة اشتقاق المعالجون قبل استكمالها مع ليف و 2 طاء، إذا ما استخدمت. الحفاظ على الثقافة حتى هي لاحظت أووتجرووثس (6-8 أيام)-

5. زراعة الخلايا الجذعية وصيانة

  1. تحضير يشار تشبه مقابض والماصات التلاعب بالخلايا الجذعية. اتبع الخطوة 3.4 بإعداد الماصات التلاعب بالخلايا الجذعية مع قطر داخلي في غيض من 250-300 ميكرون. استخدم الجزء الآخر من ماصة باستور سحبت لإعداد المؤشر مثل يشار. الحرارة والشكل حتى الحصول على هوك-
  2. لوحة الثقافة 4-جيدا خارج الحاضنة وتحديد موقع ثمرة تحت ستيريوميكروسكوبي. استخدم المقبض لدفع بعيداً الخلايا المتمايزة ومغذيات التي تحيط ثمرة.
    ملاحظة: لتجنب التفريق في نهاية المطاف من ثمرة، من المهم لإزالة جميع الخلايا المتمايزة من الحافة من ثمرة.
  3. نضح ثمرة مع ماصة تلاعب خلايا الجذعية، ووضعه في طبق جديد في قطره 50 ميليلتر التربسين-يدتا.
  4. استخدام مشرط لقطع ثمرة في عدة أجزاء من أجل تفصيل ذلك ميكانيكيا وانزيماتيكالي على السواء-
  5. على الفور، نقل أجزاء ثمرة إلى قطره جديدة من الاشتقاق المتوسطة لتحييد عمل التربسين.
  6. نقل أجزاء ثمرة لصفيحة 4 آبار جديدة مع أحادي الطبقة مغذيات. نقل الأجزاء يصل إلى 10 في كل بئر والثقافة لهم مع اشتقاق المتوسطة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
  7. الحفاظ على الثقافات الشبيهة بالخلايا الجذعية لمدة ستة أسابيع على الأقل قبل النظر في السطر مسك المنشأة. تغيير المتوسط كل يوم وثقافة فرعية أخرى منها مرة واحدة في أسبوع-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في أعقاب هذا البروتوكول، ما يزيد على 95% تكوين ثمرة يجب أن يتحقق بعد الأسبوع الأول من الثقافة (الشكل 1A). إنشاء خطوط ©جميع بعد ستة ممرات متغيراً بين replicates التجريبي، مع نجاح متوسط من 60-80%. إضافة 2 طاء لا يحسن إلى حد كبير النتائج عند العمل مع سلالات الماوس المتساهلة، مثل تلك التي مع خلفية 129S2، ولكن من الضروري عند العمل مع سلالات غير متساهلة.

المستعمرات ESC الماوس ينبغي أن يقدم مورفولوجيا عادي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على الرغم من أن مسك خط الاشتقاق إجراء معروفة تستخدم بشكل روتيني في العديد من المختبرات، كفاءتها ليس دائماً مرتفعا كما هو متوقع بسبب العوامل المتعددة التي يمكن أن تخل بصيانة بلوريبوتينسي. في هذه المادة ونحن إظهار، خطوة بخطوة، كيفية إنشاء خطوط مسك بكفاءة عالية باستخدام بروتوكول بسيط ويمكن الاعتماد عليها. هذه الفعالية مماثلة لتلك التي ذكرت في الأدبيات.

لضمان أقصى قدر من الكفاءة، من المهم مراقبة الخلايا يوميا أو مرة كل يومين، منذ الساعة النقاط التي أشارت إلى توضيحية فقط. من الضروري تجنب فرط المستع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونحن نشكر لوكاس Jonatan له المساعدة التقنية مع تغذية الخلية والثقافة، سيرفي استابولاري de la اتحاد المصارف العربية لرعاية الحيوان ومارتن دومينيك لتسجيل الفيديو. حظي بدعم هذا العمل من الوزارة دي ايكونوميا y AGL2014 كومبيتيتيفيداد-52408-R ودي محافظة كاتالونيا SGR 2014-524. بعثة التحقق المشتركة مستفيدة زمالة PIF-اتحاد المصارف العربية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل sryringeBD & nbsp ؛309628
2-&>-mercaptoethanolLife Technologies31350-010
4-well plateThermo Scientific Nunc176740
محلول التيرود الحمضي محلية الصنعانظر الوصفة في Nagy et al ، 2003. للتخزين قصير الأجل (حتى شهر واحد) احتفظ به عند 4 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، للتخزين طويل الأجل ، احتفظ به عند -20 درجة مئوية. إذا تضاءلت كفاءة المحلول ، فيجب تحمضه عن طريق إضافة قطرة صغيرة من حمض الهيدروكلوريك 1M.
BSASigmaA3311
الدجاج المضاد للفأر IgG ، Alexa Fluor 488مجسات جزيئية - InvitrogenA-212001: 500 التخفيف. الجسم المضاد الثانوي للأجسام المضادة للفأر Oct4 و Tuj1 و alpha و AFP.
CHIR990212Axon Medchem 1386إعادة التكوين مع 2.15 مل DMSO لكل ملغ من المسحوق ، للحصول على محلول مخزون 1 ملليمتر. Aliquot بالحجم المطلوب وتخزينه عند -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان.
CryoTubeThermo Scientific Nunc3754518
DMSOSigma41640
DMEMBioWestL0107
FBSBioWestS1810قم بإلغاء تنشيطه قبل استخدامه عن طريق التسخين لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية Aliquot وتخزينه في -20 & ordm ؛ C
إبرة التنظيفBD & nbsp ؛304000قطع نهاية الإبرة وطحنها إلى طرف غير حاد على حجر كاشطة
الجيلاتين من جلد الخنازيرFluka48724تمييع بنسبة 0,2٪ في الماء المقطر والأوتوكلاف. يمكن استخدام كل تخفيف لمدة شهر.
الماعز المضادة للأرانب IgG ، Alexa Fluor 594المجسات الجزيئية - InvitrogenA-110371: 500 التخفيف. الجسم المضاد الثانوي للجسم المضاد للأرانب Sox2. 
HBSSBioWestL0611
HEPES-buffered CZB محلي الصنعانظر التكوين في Chatot et al، 1989
الغدد التناسلية المشيمية البشريةDivasa-FarmavicVeterin-Corion 3000 UIتمييع في كلوريد الصوديوم 0.9٪ عند 50 وحدة دولية / مل. Aliquot في 1 مل وتخزينها في -20 & ordm. C لمدة تصل إلى شهرين. بمجرد إذابتها لا تتجمد مرة أخرى.
الخلايا الليفية للقلفة البشريةATCCATCCSCRC-1041للتخزين طويل الأجل ، يوصى بتخزينها في النيتروجين السائل.
KnockOut مصل استبدالتقنيات الحياة  10828-028حساسة للضوء. يوصى بتخزينه بكميات صغيرة مثل 10 مل وتخزينه في -20 & ordm; ج (تحقق من تاريخ انتهاء الصلاحية). تجنب دورات التجميد والذوبان.    
KSOMaag EvolveZenith BiotechZEKS-050مع 4 مجم / مل BSA. التوازن عند 37 & ordm; C و 5٪ CO2 في اليوم قبل الاستخدام.
عامل مثبط سرطان الدم ميركميليبورESG1106
الفئران  نهر تشارلز / هارلانيوصى باستخدام الفئران من سلالة متساهلة من حيث اشتقاق mESC (مثل 129S2 أو C57BL). ومع ذلك ، فإن سلالات زواج الأقارب أقل كفاءة في إنتاج الأجنة. لذلك ، يوصى باستخدام سلالة هجينة ، مثل 129S2 x C57BL أو B6CBAF1 للاستفادة من القوة الهجينة.
تم اختبار الزيوت المعدنيةSigmaM8410Embryo. حساسة للضوء. 
Mitomycin CServa2980501إعادة تكوين المسحوق بماء MilliQ بمعدل 0.5 مجم / مل. C محمي من الضوء. انتبه, أنها ضارة ويشتبه في أنها تسبب السرطان. 
الفأر المضادة للتوبولين & III (Tuj1)BiolegendMMS-435P1: 500 تخفيف
الماوس أحادي النسيلة مضاد لألفا ؛ SMASigmaA52281: 200 تخفيف
الماوس أحادي النسيلة المضاد ل AFPR & D أنظمةMAB13681:50 تخفيف
الماوس أحادي النسيلة المضاد Oct3 / 4   ؛سانتا كروزSC-52791:50 تخفيف
الأحماض الأمينية غير الأساسيةتقنيات الحياة11140-035
PD0325901Axon Medchem 1408إعادة التكوين مع 2.08 مل DMSO لكل ملغ من المسحوق ، للحصول على محلول مخزون 1 مل. Aliquot بالحجم المطلوب وتخزينه عند -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان.
طبق بتري (35 مم)صحن بتري 153066
Nunc (60 مم)Thermo Scientific Nunc150288
مصل الفرس الحامل موجهة الغدد التناسليةFoligonFoligon-1000 UIمخفف في كلوريد الصوديوم 0.9٪ عند 50 وحدة دولية / مل. Aliquot في 1 مل وتخزينه في -20 & ordm; C لمدة تصل إلى شهرين. بمجرد إذابتها لا تتجمد مرة أخرى.
أرنب بوليكلونال مضاد ل Sox2Merck MilliporeAB56031: 200 تخفيف
T75 فالكونThermo Scientific130190
Trypsin-EDTA 10xBioWestX0930تمييع 1:10 في HBSS للحصول على محلول 1x
موجهة مكمل Thermo Scientific

المراجع

  1. Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).
  2. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
  3. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
  6. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
  7. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
  8. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  9. Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
  10. Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
  11. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  12. Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
  13. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
  14. Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
  15. Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
  16. Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
  17. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
  18. Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
  19. Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

خلايا الجنين الجذعية للفئرانزراعة الأجنةتحضير الخلايا المغذيةاشتقاق الكيسة الأروميةالعامل المثبط للوكيمياوسط 2iإزالة المنطقة الشفافةاستزراع الخلايا الجذعيةمؤشرات تعدد القدراتتمايز الطبقات الجرثومية
اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.