تطبيق متعدد الألوان فلبوت تقنية لدراسة عالية الدقة مورفولوجيس وحيد الخلية والتفاعلات بين الخلايا لإطلاق في المورفولوجية

ملخص

عرض مورفولوجيس مختلف الخلايا وإنشاء مجموعة متنوعة من التفاعلات مع جيرانهم. هذا البروتوكول يصف كيف تكشف مورفولوجية الخلايا المفردة والتحقيق التفاعل خلية-خلية باستخدام نظام التعبير Gal4/UAS الراسخة.

الملخص

تعرض الخلايا مورفولوجيس مختلفة ومعقدة من العلاقات التشريحية. كيف تتفاعل مع جيرانهم الخلايا؟ هل تختلف التفاعلات بين أنواع الخلايا أو حتى داخل نوع معين؟ ما هي أنواع القواعد المكانية أنها تتبع؟ الإجابات على هذه الأسئلة الأساسية في فيفو أعاقت حتى الآن عدم وجود أدوات لتسمية خلية مفردة عالية الدقة. ويرد هنا، بروتوكول مفصل لاستهداف الخلايا المفردة مع تقنية متعددة الألوان فلبوت (مكفو). ويعتمد هذا الأسلوب على المعلمة بشكل مختلف الصحفيين الثلاثة (هكتار، والعلم و V5) تحت سيطرة UAS التي يحتفظ بها صامتة بفاصل النسخي يحف به موقعين معاهدة سجل الأفلام (FRT-توقف-معاهدة سجل الأفلام). نبضة صدمة حرارة الحث على التعبير عن الحرارة الناجمة عن صدمة حزب العمل الفيجي recombinase، الذي يزيل أشرطة FRT-توقف-معاهدة سجل الأفلام عشوائياً في الخلايا الفردية: التعبير يحدث فقط في الخلايا التي نعرب أيضا عن برنامج تشغيل GAL4. وهذا يؤدي إلى مجموعة خلايا الملونة بشكل مختلف من نوع خلية معينة يسمح تصور مورفولوجيس الخلايا الفردية بدقة عالية. على سبيل مثال، يمكن الجمع بين تقنية مكفو مع السائقين GAL4 الدبقية محددة لتصور مورفولوجيس من مختلف الأنواع الفرعية الدبقية في الدماغ المورفولوجية الكبار.

المقدمة

إطلاق، السكان الخلايا غير العصبية للجهاز العصبي (NS)، منذ فترة طويلة ويعتقد أن توفير إطار ثابت للخلايا العصبية ولم تدرس بالتفصيل لذلك. ومع ذلك، في البشر، وإطلاق تشكل الغالبية العظمى من الخلايا الموجودة في NS (~ 90%)، وتنقسم إلى عدة فئات مختلفة، بما في ذلك أستروسيتيس، أوليجوديندروسيتيس، ميكروجليا وخلايا شوان. في المورفولوجية، يشكل إطلاق حوالي 10% الخلايا في NS. الفضول، مورفولوجيس، والوظائف ملحوظ مماثلة لتلك التي عثر عليها في الفقاريات^1،2. وتشمل على مورفولوجيس حاجز الدم – المخ (BBB) تشكيل ابيثيليا، وجرت، وأستروسيتي مثل الخلايا.

المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي (CNS....

البروتوكول

1. "إعداد الذباب" لتجارب متعددة الألوان فلبوت (مكفو)

ملاحظة: تقنية "مكفو" يشير إلى نسخة معدلة من الختان كاسيت وقف حزب العمل الفيجي بوساطة ما يسمى (فلبوت). المعدلة وراثيا مكفو الذباب حمل مروج صدمة حرارة (hsp)-التحكم في ريكومبيناسي حزب العمل الفيجي والصحفيين مختلفة تحت UAS. يتكون كل مراسل دعامة المشترك ميريستويلاتيد (myr) المجلد سوبر أخضر نيون بروتين (سفجفب)، في أي 10 نسخ من علامة حانمه (مثلاً.، هكتار أو العلم أو V5) قد تم إدراجها. تتم تسمية البروتينات الفلورية غير الناتجة عن " وحش السباغيتي الجنسانية " (سمجفبس) ¹⁴ ويمكن الكشف عنها باستخدام أجسام مضادة محددة ضد العلامات حانمه مختلفة-

1. عبر <....

النتائج

ويوضح هذا القسم أمثلة على النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام تقنية مكفو في الدماغ المورفولوجية الكبار. ويبين الشكل 3 تخطيطي للأسلوب. وتحتفظ غشاء الموسومة بشكل مختلف الصحفيين الثلاثة (myr-سمجفب-ها myr-سمجفب-العلم و myr-سمجفب-V5)، تحت سيطرة UAS صامتة بفاصل النسخي يحف به موقعين معاهدة سجل الأفلام (FRT-توقف-معاهدة سجل الأفلام). نبضة صدمة حرارة الحث على التعبير عن ريكومبيناسي حزب العمل الفيجي الذي يزيل أشرطة FRT-توقف-معاهدة سجل الأف.......

المناقشة

ويصف هذا البروتوكول طريقة سهلة وفعالة لدراسة مورفولوجية أنواع الخلايا المختلفة داخل أنسجة للاهتمام بدقة عالية. مع تقنية مكفو، تستخدم الصحفيين متعددة مع العلامات حانمه مختلفة في تركيبة لوسم العشوائية متعددة الألوان (الشكل 2). مماثلة إلى أساليب أخرى مثل برينبوو/فليبو^15،،من¹⁶¹⁷، مكفو يزيد تنوع التسمية من خلال كوكسبريشن ماركر، السماح لتصور حدود الخلية لدراسات التفاعل خلية خلية. على سبيل المثال، مع الصحف.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حمام مائي	منحة	GD100
	Sarstedt	72.737.002
ملقط	دومون	11251-20
طبق تشريح 30 مم × 12 ملم	علوم المجهر الإلكتروني	70543-30	طبق تشريح زجاجي
Pyrex 3 لوحة بقعة زجاجية للاكتئاب	Corning	7223-34	ألواح تشريح الزجاج
سيلجارد بلاك	سيلجارد ، سيجما ألدريتش	805998	منزلي مصنوع من الفحم
ExpressFive S2 وسط زراعة الخلايا	Invitrogen	10486-025
20٪ PFA	علوم المجهر الإلكتروني	15713
Triton X-100	Roth	3051.3
مصل الماعز العادي	مختبرات جاكسون	005-000-121
عادي مصل الحمار	مختبرات جاكسون	017-000-121
مصل الأبقار الألبومين	Sigma	A9647
الأرنب HA-tag	إشارة الخلية	C29F4	الجسم المضاد الأساسي ، التخفيف 1: 500
الفئران FLAG-tag	Novus Biologicals	NBP1-06712	الجسم المضاد الأساسي ، التخفيف 1: 100
الفأر V5-tag: DyLight 549	AdSerotec	0411	مترافق الجسم المضاد ، التخفيف 1: 200
مضاد للأرانب AlexaFluor 488	Invitrogen	A11034	الجسم المضاد الثانوي ، التخفيف 1: 250
مضاد للفئران DyLight 647	Jackson Laboratories	712-605-153	الجسم المضاد الثانوي ، التخفيف 1: 100
مختبرات Vecta Shield	Vector	H-1000
SlowFate Gold	Invitrogen	S36937
الختم الآمن	جريس بيولابس		اتصل بالشركة لطلب
زجاج غطاء مجهر 22 × 60 ملم	مارينفيلد	101152
غطاء مجهر زجاجي 22 × 22 ملم	روث	H874
مجهر ستيريو ، لايكا MZ6	لايكا
مسح ليزر متحد البؤر LSM710	زايس
ايمرسول	زايس	518 فهرنهايت	زيت غمر للفحص المجهري الفلوري ، خالي من الهالوجين
Immersol	Zeiss	W 2010	سائل غمر لأهداف الغمر في الماء ، خالي من الهالوجين
R56F03-GAL4 (EG)	مركز بلومنجتون للمخزون	39157	GAL4 سائق
R86E01-GAL4 (ALG)	تشغيل Bloomington Stock	Center 45914	GAL4
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5	Bloomington Stock Center	64085	UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
فيجي (الصورة J)			برنامج تحليل الصور
زايس		ماكرو متعدد الأوقات	للمسح الآلي

أنابيب PCR فاصل مجهر برنامج برنامج