نموذج إعداد وتحليل البيانات التعبير الجيني على أساس رناسيق من الزرد

Timothy L. Hostelley; Jessica E. Nesmith; Norann A. Zaghloul

doi:10.3791/56187

Method Article

نموذج إعداد وتحليل البيانات التعبير الجيني على أساس رناسيق من الزرد

DOI:

10.3791/56187

⸱

October 27th, 2017

Timothy L. Hostelley*¹ , Jessica E. Nesmith*¹ , Norann A. Zaghloul¹

¹Division of Endocrinology, Diabetes and Nutrition, Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يقدم نهجاً لتحليل الترنسكربيتوم كله من الأجنة الزرد، اليرقات، أو فرز الخلايا. نحن تشمل عزلة من الجيش الملكي النيبالي، وتحليل المسار للبيانات رناسيق، والمستندة إلى بكر qRT التحقق من صحة التغييرات التعبير الجيني.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل التغيرات التعبير الجيني العالمي أداة قيمة لتحديد مسارات الرواية الأساسية تعمل الملاحظة. الزرد نموذج ممتاز للتقييم السريع لأسرة الترنسكربيتوم من السكان الخلية الحيوانية أسرة أو فرد بسبب السهولة لعزل الحمض النووي الريبي من إعداد كبيرة من الحيوانات. ويرد هنا بروتوكولا لتحليل التعبير الجيني العالمي في الأجنة الزرد استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي (رناسيق). يصف لنا إعداد الجيش الملكي النيبالي من الأجنة كله أو من السكان الخلية التي تم الحصول عليها باستخدام الخلية الفرز في الحيوانات المحورة وراثيا. كما يصف لنا نهج لتحليل البيانات رناسيق لتحديد مسارات المخصب وشروط الجينات علم الوجود (GO) في مجموعات البيانات التعبير الجيني العالمي. وأخيراً، نحن نقدم بروتوكول للتحقق تغييرات التعبير الجيني باستخدام المنتسخة العكسية الكمي PCR (قرت-PCR). يمكن استخدامها لتحليل مقارن للتحكم ومجموعات تجريبية من الزرد لتحديد التغييرات التعبير الجيني رواية هذه البروتوكولات، والتبصير الجزيئية تعمل لمصلحة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل مقارن للتعبير الجيني العالمي أداة قيمة لتحديد الجينات الجديدة المساهمة تعمل الملاحظة. هذه التحليلات عادة تعتمد على التقييم الكمي لوفرة نسخة مقارنة بين التجريبية والتحكم في العينات. النهج المستهدفة، مثل قرة-بكر نسبيا سريعة ودقيقة لتحقيق تغييرات التعبير الجيني واحد. تسلسل الحمض النووي الريبي (رناسيق) يقدم نهجاً واسع النطاق وخالية من فرضية لتحديد التغيرات الهامة في التعبير الجيني بين العينات، مما يجعل الآن معياراً لمثل هذه التحقيقات عبر أنظمة تجريبية.

وظهرت الزرد نموذجا بارزا عبر مجالات أمراض عديدة. وضعت أصلاً لفائدتها في دراسات علم الأحياء التنموي، نظراً للخصوبة العالية والتكلفة المنخفضة نسبيا للصيانة، والاستخدام التجريبي من الزرد تطورت لتشمل طائفة واسعة من تعمل من الجنينية إلى مراحل الكبار، وكذلك مجموعة واسعة من الجزيئات فحوصات¹^،^،من²³. في الواقع، هذه المزايا تجعل الدراسات الميكانيكية الجزيئية السريعة والفعالة من حيث التكلفة بسبب سهولة الحصول على كميات كبيرة من المواد جنبا إلى جنب مع سهولة التلاعب الوراثية والبيئية على السواء في جميع مراحل الحياة. وعلاوة على ذلك، الطبيعة الشفافة لليرقات والأجنة الزرد تجعله مثاليا لتوليد خطوط مراسل المعدلة وراثيا المحددة للخلايا والأنسجة مما يسمح في فيفو التصور لخلية منفصلة السكان⁴. استغلال هذه الخطوط يسمح تحليل التعبير الجيني العالمي في أنواع الخلايا المعزولة محددة استناداً إلى مراسل الجينات.

وهنا يقدم بروتوكول شامل لتحليل التعبير الجيني العالمي باستخدام رناسيق بعد ثقافة الأجنة الزرد. التلاعب التجريبية الوراثية، بما في ذلك morpholino (ميسوري)-ضربة قاضية على أساس الجينات عابرة أو تحرير كريسبر بوساطة الجينوم، وقد عرضت في مكان آخر⁵^،^،من⁶⁷. ولذلك نحن التركيز على بروتوكول مفصل لعزل الحمض النووي الريبي من الأجنة كله أو فرز الخلايا المحورة وراثيا معربا عن مراسل متبوعاً بالتحليل الحسابي البسيط للنتائج رناسيق باستخدام أدوات المسار ومصطلحات علم الوجود (GO) الجينات. أخيرا، لقد شملت استراتيجية من أجل التحقق من صحة التغييرات التعبير الجيني بالكمية عكس المنتسخة بكر (قرت-PCR). هذه البروتوكولات قابلة للتطبيق للأجنة الزرد التعرض لمجموعة واسعة من الظروف التجريبية، بما في ذلك مقارنة من طفرات وراثية أو الظروف البيئية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كافة البروتوكولات الحيوانية المبينة أدناه وفقا وأقرتها جامعة "ميريلاند رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك)-

1-"إعداد الجنين"

^،

توليد أجنة عن طريق التزاوج الطبيعي
1. ثقافة الأجنة لمدة 3 أشهر عمر، الإنجابية النضج ⁵ ⁸.
2. فصل الأسماك الذكور والإناث البالغين من سلالة المرجوة في صهاريج التزاوج مقسمة في المساء قبل جمع الأجنة، وإضافة 2 من الذكور والإناث 3 لكل صهريج.
  ملاحظة: تحليل β-خلايا البنكرياس يسمح باستخدام سلالة مراسل الفلورسنت المعدلة وراثيا insulin2a:mCherry.
3. خزان المياه العذبة نظام نقل الأسماك للتزاوج وإزالة الفاصل فور الأضواء تأتي في الصباح اليوم التالي-
4. تسمح للسمك إلى رفيقه بطبيعة الحال حتى الأجنة ولوحظت في أسفل دبابة. جمع الأجنة في فترات 30 دقيقة حتى يتم جمع المبلغ المطلوب. تخزين كل تجمع نقطة الوقت في أطباق بتري منفصلة في وسائل الإعلام الجنين في 28.5 درجة مئوية.
5. أداء microinjection من المواد الجينية أو التنسيب في وسائل الإعلام ثقافة تجريبية ⁶، إذا رغبت في ذلك، وثقافة الأجنة في هانك الطازجة ' s الجنين المتوسط ⁸ في أطباق بتري 10 سم في 28.5 درجة مئوية.
  ملاحظة: لتحليل التعبير الجيني في morpholino (MO) حقن أو الحيوانات المسخ، ملاحظة أن كل تلاعب قد آثار عرضية على التعبير الجيني. يمكن أن يحمل طفرات التعويض الوراثية على مستوى النسخ التي لا تحترم بالجينات مو على أساس استهداف ⁹.
الأجنة مرحلة
1. ثقافة الأجنة في مجموعات من 50 – الأجنة 75 كل طبق بيتري 10 سم النهوض بتوقيت التنموية تتسق جميع أجنة.
2. رصد مورفولوجية التنموية باستخدام مجهر تشريح في مراحل بلاستوميري، وابيبولي، وسميط لضمان التقدم التنموي ¹⁰-
  ملاحظة: إزالة أي الأجنة يموتون أو تالف لمنع تأخر في النمو في الطبق.
3. فصل الأجنة على أساس السن التنموية. قياس عمر الجنين باستخدام رقم سوميتي بعد تجزئة (gastrulation بعد، ح 10.33 وظيفة التسميد (hpf)) حتى ما يقرب من 24 هبف. مرحلة الأجنة واليرقات باستخدام طول الجسم الكلي بعد 24 هبف.
  ملاحظة: سوميتيس هي الأنسجة ميسوديرمال على شكل رتبة عسكرية موجودة على الجزء الظهري من الجنين.
4. مكان الأجنة تم فرزها في حاضنة 28.5 درجة مئوية والسماح للتنمية إلى التقدم بالسن المطلوب.

2. تفكك خلية واحدة: الجنين كله وفرز السكان خلية

تفارق الجنين كله
1. Euthanize الأجنة الزرد في المرحلة المطلوبة بوضع طبق بتري على الجليد لمدة 5-15 دقيقة حتى يتم ملاحظة أي حركة .
2. نقل مجموعة أجنة 20 إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مسمى 1.5 مل. قم بإزالة أية وسائط الجنين الزائد من أنبوب ميكروسينتريفوجي.
3. تحلل إضافة 200 ميليلتر (انظر الجدول للمواد) إلى الأنبوبة التي تحتوي على الأجنة. مجانسة الأجنة في الكاشف تحلل ميكانيكيا باستخدام مدقة. إضافة 800 ميليلتر تحلل الكاشف لكي إجمالي حجم 1 مل. مخزن في-80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي.
عزل الخلية فرز تدفق ¹¹
1. نقل الأجنة من طبق بيتري في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وإزالة المتوسطة الجنين قدر الإمكان.
  ملاحظة: تبعاً لعمر الجنين، تفارق الميكانيكية كما يلزم في هذه الخطوة. مع الأجنة > 48 هبف، نوصي باستخدام مدقة الإخلال بسلامة الجنين قبل المتابعة.
2. احتضان الأجنة مع 1 مل من تفكك المخزن المؤقت 1 (انظر الجدول للمواد) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. احتضان لمدة 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تريتوراتي الحل قبل بيبيتينج بلطف إلى أعلى وأسفل باستخدام تلميح P1000 لخلط كل دقيقة 3-4 خلال الخطوة حضانة. دوامة لا.
3. وإزالة المادة طافية. تعليق إعادة الأجنة في المخزن المؤقت للانفصال من 1 مل 2 (انظر الجدول للمواد). احتضان لمدة 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تريتوريشن العادية بيبيت.
4. الهضم بتمييع 1-2 ميليلتر من تعليق في خلية تنشيط fluorescence الفرز المخزن المؤقت (نظام مراقبة الأصول الميدانية) تحت المجهر-
  ملاحظة: حدث الهضم الكامل عندما يظهر قاسمة فحص خلايا مفردة مع مجموعات خلية الحد الأدنى وقطع من الأنسجة الجنينية.
5. جمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 300 غرام x للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية. تعليق إعادة الخلايا إلى المخزن المؤقت 1 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية، وتصفية الجاذبية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون لإزالة الأنسجة عسر الهضم من العينة-
6. ويضعف مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لحوالي 1 × 10 ⁶ خلايا/مل في أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية-
  ملاحظة: لأنواع الخلايا مع عدد صغير نسبيا للجنين (أقل من 5 في المائة مجموع)، مثل β-خلايا البنكرياس، استخدام الحد ني أجنة مرحلة المطابقة 1,000.
7. توفير نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز المرفق مع نظام مراقبة الأصول الميدانية أنابيب تحتوي على 1 مل عينات تعليق خلية، فضلا عن نظام مراقبة الأصول الميدانية الأنبوبة التي تحتوي على فقط الكاشف تحلل أو المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. بوابة التدفق-أرز نظام مراقبة الأصول الميدانية لجمع الخلايا المفردة فقط التي تعبر عن المراسل الفلورسنت.
8. تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية التدفق-الفرز حتى تم جمع عدد الخلايا المطلوب.
  ملاحظة: لإجراء رناسيق، يوجد حد أدنى مطلوب إجمالي الجيش الملكي النيبالي. لقد وجدنا أن خلايا 3,000 5,000 تكفي لعزل عالية الجودة، وتركيزات عالية من الحمض النووي الريبي.
9. تخزين الخلايا التي يتم جمعها على الجليد، والشروع فورا في إعداد الجيش الملكي النيبالي-

3. إعداد الجيش الملكي النيبالي

استخراج الحمض النووي الريبي
1. احتضان العينة التي تم جمعها (من الخطوة 2) مع كاشف تحلل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
2. إضافة 0.2 مل كلوروفورم لكل مل 1.0 للكاشف تحلل المستخدمة وعكس الأنابيب باليد على إينكوباتي س. 15 لمدة 2-3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي هذه العينات في 12,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 ° C.
3. نقل في مرحلة المنفصلين عن ذويهم، والمائية إلى أنبوب جديد وإضافة 0.5 مل الايزوبروبانول لكل مل 1.0 للكاشف تحلل المستخدمة. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي هذه العينات في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 ° C.
4. المياه والصرف الصحي مع الإيثانول 75% والطرد المركزي هذه العينات في 7,500 س ز لمدة 5 دقائق في 4 ° C. إزالة المادة طافية بشكل كامل، والسماح للهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق الجيش الملكي النيبالي في 15-30 ميليلتر إثيل بيروكاربوناتي (ديبك)-المياه المعالجة.
نق عالية الجودة الجيش الملكي النيبالي
1. الجمع بين تعليق الجيش الملكي النيبالي بحجم 1/10 م 3 خلات الصوديوم (pH 5.5) وحجم 1 من الايزوبروبانول. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والطرد المركزي هذه العينات في 12,500 س ز لمدة 10 دقائق في 4 ° C.
2. يغسل بيليه مع المثلج إيثانول 70% في المياه المعالجة ديبك والطرد المركزي هذه العينات في س 10,000 ز لمدة 5 دقائق في 4 ° جيم تكرار الخطوة يغسل مرة واحدة.
3. إزالة المادة طافية والسماح لتجف في درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق في المياه المعالجة ديبك.
4. الاعتداء الحمض النووي الريبي المستخرج لتركيز (نانوغرام/ميليلتر) والنقاء (نسبة 260/230) باستخدام مطياف امتصاص. تأكد من أن قيمة 260/230 ~ 2.0 قبل الشروع في رناسيق. تخزين في-80 درجة مئوية حتى لناﻫ (تصل إلى 6 أشهر)-
5. إرسال عينات الحمض النووي الريبي لمورد أو الأساسية رناسيق وتغيير التعبير الجيني التحليل القائم على التقدير الكمي لتسلسل ما يلي. وترد النتائج التي تم إرجاعها من البائع عادة كقائمة جينات العارضة إضعاف-تغيير كبير في ما يلي نص بين العينات.
  ملاحظة: يمكن استخدام عمود إذا كان الأسلوب أعلاه تؤدي رداءة نوعية الجيش الملكي النيبالي. ينبغي تأكيد كمية وتركيز وعدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) لعينات الحمض النووي الريبي مع البائع أو الأساسية. المورد أو الأساسية وستقيم أيضا عادة رين-

4. المسار والتحليل مصطلح الذهاب

ملاحظة: انظر الشكل 1 لإخراج تمثيلية لتحليل التعبير الجيني بعد رناسيق يقدمها الأساسية أو بائع.

خلطات أعرب فرز الجينات
1. مقارنة شرط تجريبي واحد مقابل السيطرة
  1. فتح البيانات (النتائج) في جدول بيانات إدارة برامج (انظر "الجدول للمواد" ).
  2. حدد السهم المنسدل بجانب ' نوع ' الزر وحدد " "فرز مخصص" " داخل جدول البيانات يحتوي على الجينات الأثران المعرب عنها في التجريبية مقابل حالة عنصر التحكم.
  3. حدد المربع ضمن ' العمود ' في نافذة أن الملوثات العضوية الثابتة حتى واختر للفرز حسب ' لفك ' العمود. ضمان ' القيم ' محدداً في ' "الفرز على" ' العمود. حدد هذا الخيار لفرز من ' الأكبر إلى الأصغر ' في ' أمر ' العمود، وانقر فوق " موافق ".
    ملاحظة: هذا سيتم فرز الجينات الأثران المعرب عنها حيث أن تلك مع زيادة تعبير (لفك الإيجابية) سوف تظهر في الجزء العلوي من القائمة بينما تلك مع تناقص التعبير (لفك السلبية) سوف تظهر في الجزء السفلي من القائمة-
2. مقارنة شروط تجريبية متعددة إلى عنصر تحكم واحد على النحو التالي. وأعرب عن
  1. تحديد أول خلية في عمود فارغ على 1 تجريبية مقابل عنصر تحكم جدول البيانات لتحديد الأثران الجينات الموجودة في هذين الشرطين التجريبية. اكتب المعادلة التالية في الخلية:
    
    ملاحظة: هذه المعادلة مزيج من IF، ISERROR، ومطابقة الوظائف. (ط) الدالة MATCH، تطابق (A1, Experimental2_vs_Control! A:A، 0)، سيقوم بالبحث عن القيمة في A1 (معرف انسيمبل) في العمود A في جدول البيانات المسمى Experimental2_vs_Control (A:A) (Experimental2_vs_Control!). " 0 " يشير إلى البحث عن تطابق تام، وإذا تم العثور على تطابق تام، سترجع الدالة قيمة " 1 "، في حين إذا تم العثور على أي تطابق، سترجع الدالة خطأ " n/A ". (ثانيا) نتيجة الدالة MATCH ثم إدخال في الدالة ISERROR، ISERROR (مطابقة (A1, Experimental2_vs_Control! A:A، 0))، حيث، إذا كان الإدخال " 1 " عثر على مما يدل على تطابق، فإنه سيعود " كاذبة "، وإذا كان الإدخال " n/A " مشيراً إلى تطابق لم يتم العثور على، فإنه سيعود " الحقيقي ". (ثالثا) " الحقيقية " أو " كاذبة " والنتيجة هي ثم الإدخال إلى الدالة IF، إذا (ISERROR (مطابقة (A1, Experimental2_vs_Control! A:A، 0))، " "، " المكررة ")، حيث، إذا كان الإدخال " الحقيقية " مشيراً إلى تطابق لم يتم العثور على، وأنها ستقوم بإرجاع قيمة ما بين أول مجموعة من علامات الاقتباس (" ") وهي فارغة، وبالتالي يكون الخلية فارغة. إذا كان الإدخال " كاذبة " مشيراً إلى تطابق تم العثور عليها، وأنها ستقوم بإرجاع قيمة ما بين المجموعة الثانية من علامات الاقتباس (" المكررة ")، وسوف أقول الخلية " المكررة ".
  2. الصحافة " أدخل " أو " العودة " لتشغيل المعادلة. حدد الخلية التي تحتوي على المعادلة، وانقر فوق المربع في الزاوية اليمنى السفلي من الخلية. الاحتفاظ بالنقر فوق الماوس واسحب المنطقة المختارة وصولاً إلى أسفل العمود حتى آخر ' معرف الميزة '، لنسخ المعادلة في كل خلية في العمود.
  3. تحديد " "فرز مخصص" " مرة أخرى، إضافة مستوى ثاني من الفرز بواسطة النقر فوق " + " الرمز في الركن الأيمن السفلي. في المستوى الأول، " فرز حسب "، تحت تحديد عمود " المكررة "، تحت "الفرز في" تحديد ' قيم '، وتحت أمر تحديد ' Z إلى A '. في المستوى الثاني، " ثم حسب "، تحت تحديد عمود ' لفك '، تحت "الفرز في" تحديد ' قيم '، وتحت أمر تحديد ' الأكبر إلى الأصغر ' وحدد " موافق ".
    ملاحظة: هذا سيتم فرز قائمة الجينات إلى 4 مجموعات استناداً إلى اتجاه لتغيير التعبير. من المهم التحقق من الجينات الموجودة في كل الظروف التجريبية للتأكد من أن هذا التغيير في التعبير في نفس الاتجاه في كليهما أو في اتجاهين متعاكسين.
  4. إزالة أي أقواس من العمود رموز الجينات قبل الدعوى أو النتائج لن نجد في قواعد البيانات. قم بتحديد العمود بأكمله الذي يحتوي على رموز الجينات. حدد " تحرير " ثم " محل " في القائمة المنسدلة ' ملف ' القائمة. نوع " (*) " في " العثور على ما: " بار لاستبدال نافذة، وإجازة " استبدال مع: " بار فارغ. حدد ' "استبدال جميع" ' لإزالة كافة مثيلات الأقواس.
    ملاحظة: * يمثل سيتم استبدال أي عدد من الأحرف، بوضع هذا الحرف بين الأقواس اثنين يتم مطالبة البرنامج للعثور على أي مثيل في الخلايا المميزة وأي مثيل من الأقواس بشيء، ومن ثم إزالتها.
أثري تحديد مسارات
1. نسخ رموز الجينات المحددة لأي واحدة ترغب في تحديد مسارات المخصب إلى الحافظة. اذهب إلى كونسينسوسباثدب ¹². حدد " الجينات تعيين تحليل " على الشريط الجانبي الأيسر من صفحة الويب، تليها " تحليل التمثيل المفرط ".
2. لصق قائمة الجينات في " لصق قائمة معرفات الجينات/البروتين " مربع. رمز تحديد الجينات في " الجينات/البروتين معرف نوع " مربع وانقر فوق " تابع ". حدد المربع المجاور ل " مسارات حسب تعريف مسار قواعد البيانات " تحت المسار على أساس مجموعات القسم.
  ملاحظة: سوف تظهر عددا من الخيارات للتحليل بما في ذلك قائمة قواعد البيانات المتاحة للبحث. نوصي بإلغاء تحديد كافة قواعد البيانات ما عدا قواعد البيانات كج ورياكتومي كما هي ثابتة وأكثرها شمولاً. ويمكن أيضا تعديل التداخل الحد الأدنى مع إعدادات إدخال قائمة وقيمة p استقطاع استناداً إلى الاحتياجات. من المستحسن ترك هذه الإعدادات في تداخل الحد الأدنى الافتراضي الجين 2 وقطع قيمة p 0.01.
3. تحديد " العثور على مجموعات المخصب " للحصول على قائمة المسارات التي تحتوي على الجينات في قائمة الإدخال.
  ملاحظة: سوف يكون الإخراج في تنسيق الجدول، بما في ذلك اسم كل المسار الذي يتبعه " تعيين حجم " (التي تشير إلى عدد إجمالي الجينات في المسار)، " المرشحين الواردة " (التي تشير إلى عدد الجينات في قائمة الإدخال الموجودة في هذا المسار )، وكذلك فالقيمه والقيمة q (فرانكلين روزفلت)، وقاعدة البيانات التي تم تحديد المسار-
جيل من مسار الشبكات
1. تحديد مسارات المخصب كما هو موضح أعلاه.
2. تحديد كافة المسارات المخصب لتصور في شبكة طريق أما تحديد كل خانة بجوار أسماء المسار تصور أو بالنقر فوق " جميع " تحت " حدد " في رأس العمود أعلاه مربعات التحديد، ثم حدد " تصور مجموعات مختارة ".
  ملاحظة: من المستحسن تصور جميع المسارات إذا كان هناك أقل من 30؛ إذا كان هناك أكثر من 30 من مسارات نوصي بتحديد مسارات المخصب الأكثر 30 الأعلى (تلك التي تحتوي على أكبر عدد من الجينات من قائمة الإدخال).
3. ضبط " التداخل النسبي " و " المشتركة المرشحين " المرشحات، عن طريق تحديد مربع أما في وسط أعلى الصفحة وإدخال ديسيرالتداخل النسبي في المئة اد أو يتداخل مع عدد من المرشحين المشتركة، لتكون أكثر صرامة من أجل تحقيق قدر أكبر من الأهمية داخل شبكات المسار أكثر وضوحاً، وحدد " تطبيق ".
  ملاحظة: نوصي تداخل نسبي الحد أدنى من 0.2، مما يدل تداخل جينات 20% بين مسارات 2 للاتصال بها، والحد أدنى من المرشحين المشتركة 2. يمكن رؤية وسيلة إيضاح الرسم البياني بواسطة النقر فوق وسيلة إيضاح الرسم البياني في الجزء الأيمن العلوي من الصفحة.
تصميم المخصب الذهاب المصطلحات
1. نسخ رموز الجينات من المجموعة التي أحد يرغب في تحديد مدى الجينات المخصب إلى الحافظة. الذهاب إلى ' أداة "تحليل تخصيب" الذهاب ' في "الجينات علم الوجود اتحاد" ¹³. لصق قائمة رموز الجينات في مربع على الجانب الأيسر من الصفحة تحت " الجينات الخاصة بك معرفات هنا … "
2. تحديد أي مجموعة من شروط الذهاب لاستخدام، المدرجة تحت خانة معرفات الجينات: عملية بيولوجية أو الدالة الجزيئية، أو المكونات الخلوية. اختر (مستحسن) ' العملية البيولوجية '. حدد ' دانيو rerio ' تحت الذهاب شروط مربع وانقر فوق " إرسال ".
  ملاحظة: نوصي باستخدام قطع قيمة p الافتراضي 0.05.

5. التحقق من قرة-بكر

ملاحظة: ينبغي التحقق من الجينات الفردية المحددة مع تغييرات التعبير الجيني الكبير في رناسيق ببكر qRT المستهدفة في تكرار التجارب.

1. التوليف كدنا استخراج الجيش الملكي النيبالي من الأجنة باستخدام الطريقة الموضحة في الفرع 3-1. استخراج الحمض النووي الريبي.
2. تحويل 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لاستخدام التحويل كدنا كدنا كيت (انظر الجدول للمواد). تجميع الجيش الملكي النيبالي ودنتبس وإنزيم المنتسخة العكسية. القيام برد فعل ثيرموسيكلير وفقا للشركة المصنعة ' مواصفات s-
3. تمييع كدنا 1:3 في المياه المعالجة ديبك. مخزن في 4 درجات مئوية لتصل إلى 1-2 أشهر.
التحقق قرت-بكر
1. تحديد الجينات أن تتحقق عن طريق PCR قرت من نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي. تحديد الجينات مع التغييرات حظيرة عالية في التعبير. تحديد أي من هذه الجينات تحتوي أيضا على التهم قراءة عالية، كما يشير هذا التعبير وفيرة.
2. تحديد الأهداف 10-12 من التغيير حظيرة عالية، وارتفاع عدد مرات قراءة قائمة بالجينات. تصميم كبسولة تفجير لتضخيم الجينات المستهدفة التي تمتد على الأقل 1 إكسون-إنترون الحدود.
3. إدخال الجينات أو المنطقة المستهدفة من الجينات في قبكر التمهيدي تصميم الموقع ¹⁴. حدد " تصميم كبسولة تفجير قبكر 2 " والمطالبة موقع لإنشاء مجموعة التمهيدي.
  ملاحظة: يجب التأكد من أن تدرج كبسولة تفجير للمراقبة الداخلية، مثل β-أكتين، لتطبيع مقارنات بين العينات. كبسولة تفجير β أكتين هي 5 واو: '-تكجاجكتجتكتكككاتككا-3 ' و 5 r: '-تكاككاكجتاجكتجتكتتكتج-3 '-
4. تجمع كدنا، التمهيدي إلى الأمام، وعكس التمهيدي وبوليميراز. أداء التضخيم qRT-PCR لتحديد التعبير النسبي للجينات ¹⁵-
5. تحليل التعبير مرناً النسبي للجينات للفائدة بالقياس الكمي النسبي عزم ¹⁵-
6. مقارنة قرة-بكر لنتائج رناسيق ضمان اتساق اتجاهية التعبير التفاضلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأعرب عن الفرز من خلطات الجينات:

نحن استهدفت تحديد الجينات الأثران المعرب عنها في مرحلة اليرقات الزرد نماذج من مرض Alström ومرض متلازمة باردت-بيدل (BBS)، أما alms1 أو النصوص bbs1 بالحقن قبل التحقق من صحة موس إلى حجب الوصلة الزرد البرية من نوع الأجنة¹⁶^،¹⁷. في 5 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية)، replicates اثنين من الجيش الملكي النيبالي استخرجت من ك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويوفر النهج المبينة في هذا البروتوكول استراتيجية فعالة من حيث التكلفة وسريعة نسبيا لتحليل مستوى الترنسكربيتوم للحيوانات كله أو السكان خلية معينة تم فرزها. الزرد يوفر نموذجا مفيداً لهذا النوع من الدراسة بسبب السهولة والسرعة في توليد كميات كبيرة من ابتداء من المواد وسهولة تنفيذ الوراثية أو البيئية الظروف التجريبية، وتوافر كبير مجموعة خطوط مراسل المعدلة وراثيا مما يسمح لعزل السكان نوع الخلية المحددة والخاصة بالانسجة.

بينما لم تذكر بالتفصيل هنا، هذا الأسلوب يمكن أن تستوعب بسهولة أقسام الأنسجة التي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيده هذا العمل R01DK102001 (N.A.Z.) و P30DK072488 (N.A.Z.) T32DK098107 (T.L.H. و J.E.N.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
<قوية >كواشف تجارية< قوية>
TriZol	Thermo Scientific	كاشف	تحلل
15596026 TrypLE	Gibco	12604013	عازلة تفكك 1
FACSMax	Genlantis	T200100	عازلة تفكك 2
المياه المعالجة DEPC	Sigma	95284
FirstStrand تحويل cDNA	Thermo Scientific	K1621	مجموعة تحويل الحمض النووي (كدنا
2X SYBR Green Master Mix	Roche	4707516001	qRT-PCR Master Mix
FACS Buffer	Fisher Scientific	50-105-9042
كلوروفورم	سيجما ألدريتش	288306
أسيتات الصوديوم	سيجما ألدريتش	S2889
قوي> الاسم< / قوي >	< قوي > شركة < / قوي >	< قوي > رقم الكتالوج < / strong>	التعليقات < / strong
> Zebrafish سلالات < / strong> Tuebingen
	ZIRC	ZL57
ins2a: mCherry	ZIRC	ZL1483
الاسم < / strong>	< قوي>الشركة< / قوي>	<قوي> رقم الكتالوج< / strong>	تعليقات< strong>
Equipment< / قوي>
مصفاة خلية 40 ميكرون	Sigma	CLS431750
أنبوب	FACS BD Falcon	352063
مقياس الدم	Sigma	Z359629
تشريح المجهر	Zeiss
المجهر المقلوب	Zeiss
Nanodrop	Thermo Scientific
Illumina HiSeq	Illumina
LightCycler 480	Roche
Colling Tanks 1.0L Crossing Tank	Aquaneering	ZHCT100
FACS tube 5 مل أنبوب البولي بروبلين	BD فالكون	352063
<قوي>الاسم	<قوي>الشركة	<قوي>رقم الكتالوج	تعليقات
Software
Excel
Consensus Path DB	http://cpdb.molgen.mpg.de/
GO تحليل التخصيب	http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis

) < Microsoft

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
Detrich, H. W. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , 3rd ed, Academic Press. (2011).
Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from: http://cpdb.molgen.mpg.de/ (2017).
Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from: http://www.geneontology.org/ (2017).
IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017).
Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

نموذج إعداد وتحليل البيانات التعبير الجيني على أساس رناسيق من الزرد

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles