العديد من أمراض العين تهدد الرؤية ترتبط باختلال ميكروفيسيلس الشبكية. ولذلك، من المهم قياس الاستجابات arteriole الشبكية للتحقيق في الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة. توضح هذه المقالة بروتوكول مفصل للماوس arteriole الشبكية العزلة والتحضير لتقييم آثار المواد فعال في الأوعية على قطر الأوعية الدموية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
خطوات الإعداد لقياس مفاعليه في الماوس الشرايين الشبكية السابقين فيفو
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
عدم كفاية الأوعية الدموية والتعديلات في نضح الشبكية العادي من بين العوامل الرئيسية لأمراض تهدد البصر العين أمراض مختلفة، مثل اعتلال الشبكية السكري واعتلال الشبكية من ارتفاع ضغط الدم، وربما الزرق. ولذلك، الاستعدادات microvascular الشبكية أدوات المحوري للدراسات الفسيولوجية والدوائية لتحديد الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة، وتصميم علاجات للأمراض. وعلى الرغم من الاستخدام الواسع لنماذج الماوس في أبحاث العيون، دراسات حول مفاعليه الأوعية الدموية الشبكية شحيحة في هذه الأنواع. واحد أسباب رئيسية لهذا التفاوت هو إجراءات العزل صعبة نظراً لصغر حجم هذه الأوعية الدموية الشبكية، و ~ ≤ 30 ميكرومتر في القطر لومينال. للالتفاف على مشكلة العزلة مباشرة من هذه ميكروفيسيلس الشبكية للدراسات الفنية، قمنا بإنشاء أسلوب العزل وإعداد تمكن السابقين فيفو دراسات للماوس فاسواكتيفيتي الشبكية تحت ظروف القرب الفسيولوجية . على الرغم من أن الاستعدادات التجريبية الحالية سوف تشر تحديداً إلى الشرايين الشبكية الماوس، يمكن سهولة استخدام هذه المنهجية ميكروفيسيلس من الفئران.
المقدمة
اضطرابات في نضح الشبكية قد تورطت في الآلية المرضية لأمراض العين المختلفة، مثل اعتلال الشبكية السكري وارتفاع ضغط الدم اعتلال الشبكية والزرق1،،من23. وهكذا، دراسات تهدف إلى قياس مفاعليه الأوعية الدموية في شبكية العين هامة لفهم الفسيولوجيا المرضية لهذه الأمراض وتطوير علاج جديد للنهج.
نظراً لإمكانية التلاعب بالجينات في الجينوم مورين، أصبح الماوس نموذج حيوانية مستخدمة على نطاق واسع للدراسات المتعلقة بنظام القلب والأوعية الدموية4. ومع ذلك، بسبب صغر حجم الأوعية الدموية الشبكية (≤ 30 ميكرومتر)، قياس مفاعليه الأوعية الدموية في الشبكية الماوس يمثل تحديا. على سبيل المثال، تقنيات ستيريوميكروسكوبيك للقياس في فيفو محدودة في هذه الدقة البصرية وللسماح فقط للضبط الكشف عن التغييرات في القطر أو الدم تدفق في الدم الصغيرة أقل من القطر 30 ميكرون أو أقل عندما مجهزة أجهزة إضافية متطورة مثل مجهر [كنفوكل] استخدام الأصباغ الفلورية أو5،"فحص منظار الضوء البصريات التكيفية"6. وعلاوة على ذلك، تفسير القياسات في فيفو يهدف إلى تحديد المحلية إشارات يمكن مرتبك الآليات في الأوعية الدموية الشبكية بالتخدير، التغيرات في ضغط الدم النظامية وتأثير الأوعية الدموية خلف المقلة.
ولذلك، قمنا بتطوير طريقة لقياس استجابات الأوعية الدموية الشبكية الماوس مع عالية الدقة البصرية السابقين فيفو. تسمح هذه التقنية المقدمة في هذه الوثيقة التصور للشرايين الشبكية عن طريق إحالة الخفيفة الميكروسكوب. يوفر هذا الأسلوب، التي يمكن أن تستخدم أيضا في الفئران، الوصول إلى مزايا الجينات تستهدف التكنولوجيا في أبحاث الأوعية الدموية العين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أقر الإجراءات التجريبية لهذه الدراسة بالحيوانات رعاية اللجنة من راينلاند بالاتينات، ألمانيا. رعاية الحيوان تتفق مع المبادئ التوجيهية المؤسسية والرابطة للبحث في بيان الرؤية و "طب العيون" (آرفو) للاستخدام الحيوانات في العيون والرؤية للبحث. الحيوانات يعاملون وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/الاتحاد الأوروبي للتجارب على الحيوانات. واستخدمت للتجارب C57BL/6J الفئران الذكور (مختبر جاكسون، ميناء بار، لي، الولايات المتحدة الأمريكية) الذين تتراوح أعمارهم بين 3-4 أشهر. الحيوانات تم إيواء تحت الظروف العادية (درجة حرارة 23 ± 2 درجة مئوية، والرطوبة مجموعة 55 ± 10% و 12 ح دورات الضوء/الظلام)، وكان الوصول إلى الماوس القياسية تشاو والمياه libitum الإعلانية.
1-عزل الشبكية الماوس
- وضع أدوات التشريح في إعداد الجدول ومعرفة ما إذا كان جميع الصكوك كاملة لتمكين إعداد سريع.
- التضحية الماوس باستنشاق أول أكسيد الكربون2 .
- قطع رأس الماوس مع مقص الصلب وقطع ساجيتالي الجمجمة إلى نصفين باستخدام نفس زوج من مقص وإزالة الجلد والدماغ باستخدام مقص العين (الشكل 1).
- قطع عظم الجمجمة بمغادرة العظام المدارية فقط باستخدام مقص العين.
- نقل المدار في طبق تشريح الذي يحتوي على المخزن المؤقت هينسيليت كريبس المثلج.
- تبقى طبق تشريح على الجليد أو تغيير المخزن المؤقت كل 10 دقيقة.
- قطع عظم المدارية باستخدام مقص العين وإزالة بلطف العالم العين جنبا إلى جنب مع الأنسجة المدارية باستخدام نوع الدقة 4 ملاقط ومقص الربيع Vannas الطالب (الشكل 2).
- إزالة الغدة هارديريان والنسيج الضام والعضلات اكستراوكولار باستخدام نوع الدقة 5 ملاقط ومقص كابسولوتومي فانس، مع الحرص على عدم الأضرار الفرع الرئيسي للشريان العيون بلطف.
- اضطر المداري فروع الشريان العيون، وفي نهاية المطاف نهاية الدانية من الفرع الرئيسي للشريان العيون باستخدام خيوط النايلون 10-0 (الشكل 3).
- تحويل العالم العين إلى طبق بتري يحتوي على الإيثانول 70% s 10 باستخدام النوع 4 الدقة ملاقط. ضع العالم العين مرة أخرى إلى صحن تشريح واستبدالها المخزن المؤقت الطازجة كريبس الحل. سوف تظهر القرنية مبيضة بعد التعرض الإيثانول.
- ثقب في القرنية بإبرة قياس 30 وتشريح القرنية باستخدام مقص كابسولوتومي فانس. بلطف قطع الأنسجة آيريس، ضع نقطة حادة مقص كابسولوتومي فاناس بين المشيمية والشبكية، وقطع المشيمية والصلبة العينية. ترك بعض الأنسجة scleral حول العصب البصري (الشكل 4).
2-تركيب الشبكية في قاعة التروية
ملاحظة: قاعة نضح المستخدمة لتجارب arteriole الشبكية الصنع. وهو يتألف من خزان شفاف مع أنبوب في-وإلى الخارج (الشكل 5). واحدة من نهاية أنبوب سيليكون التصاق الجزء السفلي من الدائرة مع لاصقة هيستواكريل والآخر يلحق محبس الحنفية الثلاثية. توصيل حقنه تحتوي على المخزن المؤقت كريبس الطازجة إلى محبس الحنفية الثلاثية وملء الأنبوب مع المخزن المؤقت.
- تأخذ ميكروبيبيتي من زجاج مع حامل إبرة ويدفع به إلى نهاية الأنبوب في الجزء السفلي من الدائرة التروية. ثم كسر غيض من ميكروبيبيتي مع مقص نوع 4 للحصول على معلومات سرية من 100 ميكرومتر القطر.
- التركيز على غيض من ميكروبيبيتي وطرد عن طريق المحاقن متصل بالانبوب. العناية بأن شعري هو لا تغطي بالحطام. في حالة انسداد، إزالته، دافق الأنابيب وإدراج ميكروبيبيتي آخر.
- ملء قاعة التروية مع المخزن المؤقت كريبس الباردة ووضع الدائرة تحت مجهر ستيريو.
- وضع منصة بلاستيكية شفافة في قاعة التروية. هذا المنهاج المسافة بادئة لعرض 1.8 مم للعصب البصري والشريان العيون ويوضع على اثنين من الأسلاك الصلب قطرها 1.6 ملم. ثم، ضع حلقة الفولاذ المقاوم للصدأ من القطر الداخلي مم 2.8 و 4.0 مم القطر الخارجي على النظام الأساسي.
- نقل الشبكية مع العصب البصري والشرايين العيون المرفقة من قاعة التشريح في قاعة التروية مع العناية القصوى باستخدام ملعقة. تعد هذه الخطوة مهمة لمنع احتمال تمتد الأنسجة كما أنها قد تكون ضارة للتجربة.
- قطع الجزء ستورد النهاية الدانية الشريان العيون ووضع الحلقات بريفورميد اثنين من خياطة نايلون 10-0 على ميكروبيبيتي كانولاتي الشريان العيون مع ميكروبيبيتي. ربط الشريان إلى ميكروبيبيتي (الشكل 6)، ومكان الشبكية إلى ساحة شفافة باستخدام غرامة-نقطة-ملاقط.
- بلطف الدموع كابسولا العدسة الأمامية مفتوحة مع اثنين نقطة غرامة ملاقط وسحب العدسة، وقطع كابسولا عدسة كله باستخدام ميكروسسيسورس.
- وفي وقت لاحق، جعل أربعة شقوق شعاعية في الشبكية نصف المسافة من بلانا بارس للعصب البصري ووضع خاتم الفولاذ المقاوم للصدأ على شبكية العين لإصلاحه للأسفل. شبكية العين جاهز الآن للتجربة (الشكل 7).
3-إعداد الشرايين الشبكية للتجربة
- المكان قاعة نضح تحت مجهر خفيفة. والهدف عدسة هدف غمر مياه X 100.
- قم بتوصيل الغلايات اثنين لفي--وخارج-flow مضخة بيريسيكليك وتعميم الدائرة مع المخزن المؤقت كريبس اﻷوكسيجين مع 95% O2 والغازية مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية. استخدم معدل تدفق بين 100 و 120 مل/دقيقة.
- الاتصال أنبوب السيليكون، التي ترتبط ميكروبيبيتي، خزان سيليكون خرطوم عبر محبس الحنفية الثلاثية. ثم ملء الخزان مع كريبس المخزن المؤقت إلى ارتفاع يساوي 50 ملم زئبق لكن لا تقم بفتح محبس الحنفية الثلاثية بعد.
- ننظر من خلال أهداف مجهر والتركيز على سطح الشبكية. البحث عن خلايا الدم الحمراء أو الأوعية الدموية. فمن الممكن أن الأوعية الدموية هي انهارت انهيارا كاملا، حتى في بعض الأحيان فقط مرئية بعض خلايا الدم الحمراء.
- عندما يتم العثور على الأوعية الدموية، التركيز عليه وفتح محبس الحنفية الثلاثية. وينبغي زيادة قطر السفينة فورا وخلايا الدم الحمراء نقل أما سينتريفوجالي، إذا كان أرتيريولي، أو سينتريبيتالي في حالة فينولي. الشرايين أصغر في قطر مقارنة بالاوردة بنفس الترتيب.
- حالما يتم العثور على الأوعية الدموية مع جدار مرئية جيدا، يمكن أن تستخدم لإجراء التجارب على فترة الموازنة من 30 دقيقة (الشكل 8). خلال فترة الموازنة، وضع الشرايين لهجة الجوهرية فقط ضعف أدى إلى أقل من 10 في المائة الحد من قطر لومينال.
4-القيام بالتجربة
- اختبار صلاحية السفن مع ثرومبوكاني ميميتيك 9,11-ديديوكسي-9α، 11α-ميثانوبوكسي البروستاغلاندين و2α (U46619) عن طريق إضافته إلى حمام الحل. هذا العامل يقلص الماوس الشرايين الشبكية بنحو 50 في المائة من يستريح القطر عند تركيزات ≥ 10-6 متر.
- مجرد تأكيد السفينة قادرة على البقاء، يغسل مؤثر خارج الحمام بتعميم الضخ وتوريد جديدة كريبس العازلة في الحمام.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
U-46619 تنتج استجابات تعتمد على تركيز مضيق للأوعية في الشرايين الشبكية من الفئران البرية من نوع C57Bl/6J الخلفية. في تركيز من 10-6 متر، كان الانخفاض في القطر لومينال إيتش فايف زيرو % من القطر يستريح. ويبين الشكل 9 ألف منحنى تركيز ممثل-استجابة لأحد arteriole الشبكية. في الشرايين بريكونستريكتيد مع U46619، أثارت الإدارة التراكمي من أستيل تعتمد على تركيز الزيادات في القطر لومينال إلى إيتش تو فايف في المائة من قطر بريكونستريكتيد في 10-5 م، يد...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قياس استجابات الأوعية الدموية في الشبكية الماوس هو التحدي نظراً لصغر حجم الأوعية الدموية الشبكية. مع هذه التقنية المقدمة، هي تصور الشرايين الشبكية بالفحص المجهري الخفيفة المنقولة. هذا ممكن، أنها شفافة الشبكية معزولة. وميزة هذا الأسلوب هو عالية الدقة البصرية. القرار المكانية المحسوب مقصف 11/ميكرومتر. ومع ذلك، القرار الحقيقي لهذا النظام الضوئي الذي يستخدم الضوء الأبيض بين 200 و 300 نانومتر، مما يفسر بالحد حيود أبي. منذ أول فرع للماوس الشرايين الشبكية قطر داخلي من 20 إلى 30 ميكرومتر، التغييرات قطرها حوالي 1% قابلة للاكتشاف ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفين قد لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل منح من أوند إرنست بيرتا جريمكي Stiftung والألمانية Deutsche أوفثالمولوجيشي (الكلب).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مقص فولاذي | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 مم |
| مقص عين | Geuder | G-19390 | 1x مستقيم ، 10.5 سم |
| ملاقط دقيقة ، مستقيم بأطراف دقيقة | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x نوع 4 |
| ملاقط دقيقة ، مستقيم مع أطراف دقيقة إضافية | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x نوع 5 |
| Vannas capsulotomy مقص | Geuder | 19760 | 1x مستقيم ، 77 مم |
| مقص زنبركي للطلاب | أدوات العلوم الدقيقة | 91501-09 | 1x منحني ، |
| Barrace < / em> حامل إبرة | Geuder | G-17500 | 1x منحني ، 120 مم |
| إبرة | بيكتون ، ديكنسون وشركاه | 305128 | 1x 30 G |
| شعيرات دموية زجاجية (لإنتاج الماصات الدقيقة) | شركة دروموند العلمية | 9-000-1211 | 1x (1.2 × 0.8 مم ؛ القطر الخارجي / الداخلي) |
| خياطة النايلون | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| طبق زراعة الخلايا Nunclon | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 مم |
| Nunclon صحن زراعة الخلايا | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 مم قطر |
| ديسكوفيكس سي | براون | 16500C | 10 سم |
| هيستواكريل لاصق | B. Braun Surgical ، S.A. | 1050052 | |
| name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (الحلقة الثانية) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| مجتذب ماصة عمودي موديل 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| مجهر (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| هدف الغمر في الماء LUMPlanFL ، 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| كاميرا رقمية (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| غرفة التروية | عصامية | 1x | |
| name | Company | strongCatalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| كلوريد الكاليوم (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| فوسفات ثنائي هيدروجين الكاليوم (KH2< / sub>PO4< / sub>) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| كبريتات المغنيسيوم (MgSO4< / sub>) Carl | Roth GmbH | 261.2 | |
| كلوريد الصوديوم (NaCl) Carl | Roth GmbH | 9265.2 | |
| كربونات هيدروجين الصوديوم (NaHCO3< / sub>) Carl | Roth GmbH | 0965.3 | |
| &alpha ؛ - (D) - (+) - الجلوكوز أحادي هيدرات | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9،11-dideoxy-9 & alpha ؛ 11 & - ميثانوإيبوكسي البروستاجلاندين F2 & ألفا ؛ (U-46619) | كايمان الكيميائية | 16450 | |
| كلوريد أستيل كولين | سيجما ألدريتش | A6625-25G |
المراجع
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
