مقالة منهجية

استخدام الموجات فوق الصوتية عالية التردد ثلاثي الأبعاد رواية لتوصيف الحمل المبكر في الماوس

8.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56207

⸱

أكتوبر 24, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Devision of Repreoductive Endocrinology and Infertility, Department of Obstetrics and Gynecology, Baylor College of Medicine, 2Mouse Phenotyping Core, Baylor College of Medicine, 3Reproductive and Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

الفئران تستخدم على نطاق واسع لدراسة البيولوجيا الحملي. ومع ذلك، مطلوب إنهاء الحمل لمثل هذه الدراسات التي تستبعد التحقيقات الطولي ويتطلب استخدام عدد كبير من الحيوانات. ولذلك، يصف لنا تقنية غير الغازية للموجات فوق الصوتية عالية التردد للكشف المبكر والرصد لغرس ما بعد أحداث الماوس الحوامل.

الملخص

الموجات فوق الصوتية عالية التردد (هفوس) أسلوب شائع لرصد تطور في الوقت الحقيقي للجنين البشري في الرحمغير إينفاسيفيلي. يتم استخدام الماوس بشكل روتيني كنموذج في فيفو لدراسة زرع الجنين وتطور الحمل. ولسوء الحظ، تتطلب مثل هذه الدراسات مورين انقطاع الحمل لتمكين تحليل المظهرية المتابعة. ولمعالجة هذه المسألة، استخدمنا التعمير (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد من هفوس تصوير البيانات للكشف المبكر وتوصيف المواقع غرس الجنين مورين وعلى تطور التنمية الفردية في الرحم. الجمع بين التصوير هفوس ثلاثي الأبعاد من تعمير والنمذجة، كنا قادرين على دقة التحديد الكمي لعدد موقع غرس الجنين، فضلا عن رصد التطور التنموي في الفئران C57BL6J/129S الحوامل من 5.5 أيام بعد الجماع (d.p.c.) عن طريق إلى 9.5 d.p.c. باستخدام محول. القياسات التي شملت: عدد وموقع وحجم المواقع غرس فضلا عن التباعد الموقع غرس بين الوكالات؛ تم تقييم سلامة الجنين عن طريق مراقبة نشاط القلب. في فترة ما بعد زرع مباشرة (5.5 إلى 8.5 d.p.c.)، إعادة البناء ثلاثي الأبعاد الرحم جرافيد في شبكة وتراكب الصلبة تمكين تنسيق تمثيل مرئي للحمل النامية داخل كل منطقة القرن الرحم. كما تواصل الفئران المهندسة وراثيا لاستخدامها لتميز الإناث تعمل الإنجابية مشتقة من الخلل في الرحم، يقدم هذا الأسلوب نهجاً جديداً لكشف وقياس، وتميز المبكر غرس الأحداث في فيفو. هذا الاستخدام الرواية لتصوير هفوس ثلاثي الأبعاد يوضح القدرة على الكشف عن بنجاح وتصور، وتميز مواقع زرع الجنين أثناء الحمل المبكر مورين بطريقة غير الغازية. يوفر التكنولوجيا تحسن كبير على الأساليب الحالية، التي تعتمد على انقطاع الحمل لتوصيف الأنسجة والأنسجة الإجمالي. هنا نستخدم صيغة الفيديو والنص لوصف كيفية القيام بنجاح بالموجات فوق الصوتية للحمل المبكر مورين لتوليد بيانات موثوقة واستنساخه بالتعمير لشكل الرحم في الشبكة وصور ثلاثية الأبعاد الصلبة.

المقدمة

فقدان الحمل المبكر المتكررة هي واحدة من المضاعفات الأكثر شيوعاً بعد الحمل ويؤثر على ما يقرب من 1 في المائة أزواج تحاول أن تصور1،2. وتتنوع الآليات الكامنة لفقدان الحمل المبكر: من التشوهات الجنينية الجوهرية وكانوا الأمهات إلى عيوب في التقبل بطانة الرحم1،،من34. وبسبب تلك المقاييس الوراثية، استخدمت نماذج الماوس على نطاق واسع للتحقيقات لزرع الجنين المبكر والحمل. وعلاوة على ذلك، ضمنت وقت الحمل قصيرة الماوس وقدرة على القيام بدراسات واسعة النطاق الأداة المساعدة المتزايدة للماوس في معالجة المسائل السريرية الأساسية في الطب الإنجابي البشري5. وقال أن الغالبية العظمى من النماذج التجريبية مورين ما زالت تحتاج إلى سدود عديدة أن euthanized في أيام الحمل متسلسلة لقياس وتحليل غرس الموقع وعدد وحجم وأنماط تباعد أثناء الحمل6، 7،8، مما يحول دون الدراسات الطولية في الحيوان نفسه.

في العيادة، الموجات فوق الصوتية أداة موثوقة ولا تقدر بثمن لمراقبة سلامة الجنين البشري والتنمية في طريقة غير الغازية9،،من1011. في الآونة الأخيرة، بدأت بالموجات فوق الصوتية عالية التردد (هفوس) للعثور على التطبيقات محدودة في الماوس كوسيلة لرصد سلامة الجنين والنمو أثناء فترة الحمل12،،من1314. التطورات التكنولوجية الحديثة في مجال التصوير بالموجات فوق الصوتية قد يسمح بتطبيق البيانات (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد للتعمير البصرية أجهزة الحيوانية والمراقبة اللاحقة للأمراض15،16، 17. استخدام هذه التكنولوجيا المتقدمة في التصوير تحسنا ملحوظا القدرة على الكشف عن أصغر حجم التقلبات، للحد من تقلب بين الحيوانات، ورصد تطور علم الأمراض أو فعالية التدخل العلاجي17. بينما كانت الأداة الرئيسية لهذه التكنولوجيا لرصد تطور الأورام الخبيثة في النماذج المعدلة15،16، تصوير هفوس ثلاثي الأبعاد قد استخدمت مؤخرا فقط قوانتيتاتي ورصد نمو نشط لزرع الجنين ووضع الجنين في رحم الفأرة18.

وهنا، نحن توضح كيفية تنفيذ هفوس التصوير لإنتاج البيانات ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد لتوليد عمليات إعادة البناء الرحم الماوس الحامل مبكرا. علينا أن نبدي بفائدة هذا الأسلوب رواية للكشف عن هذه الأحداث غرس الجنينية المبكرة دون الحاجة لإنهاء الحمل، السماح للباحثين بجمع البيانات بطريقة غير الغازية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

هذه الدراسات قد أجريت وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية نشرتها "المعاهد الوطنية للصحة" والحيوان البروتوكولات المعتمدة "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) كلية طب بايلور تحت البروتوكول رقم AN 4203.

1-إعداد "الماوس الحامل" للموجات فوق الصوتية

  1. توقيت التزاوج
    1. مكان السد مع الذكور خصبة ثبت الماوس بداية بين عشية وضحاها بعد 1700. فصل السد، وذكر بالساعة 0700 (ح)، بغض النظر إذا كان التوصيل المهبلية الحالية، لضمان دقة يؤرخ للحمل.
      ملاحظة: في صباح اليوم بعد التزاوج ويعتبر يوم 0.5 وظيفة كويتوم (d.p.c.)-
  2. التحضير للموجات فوق الصوتية
    1. ضع الماوس الحوامل في حاوية تحريض تخدير مختومة.
    2. سيدات مع isoflurane (2%) استنشاق المخدر والأكسجين (1 لتر/دقيقة) حتى يفقد الحيوان المعاكسة رايتينج (حوالي 1-2 دقيقة تبعاً للحجم الماوس) ولا تراعي الحركات التلقائية (إلى جانب التنفس).
    3. مكان الماوس مخدراً في موقف ضعيف في مخروط الآنف مع إيسوفلوراني (2%) استنشاق المخدر والأكسجين (1 لتر/دقيقة). تطبيق مرهم العيون للحيوان ' العيون s-
    4. مع مسحه القطن، تطبيق كريم مزيل الشعر على كامل البطن، القص للمهبل، والوحشي للجناحين.
    5. تسمح لكريم بالبقاء لمدة أقصاها 3 دقيقة، ثم قم بإزالة الشعر مع الأنسجة وكريم. ضمان أن تتم إزالة كل الشعر، أي الشعر المتبقية ستنخفض جودة الصورة.

2. التحضير "مرحلة الموجات فوق الصوتية"

  1. تشغيل محول-
  2. إرفاق محول ثلاثي الأبعاد الحركية الحركية مرحلة مرحلة.
    1. التوصيل إلى 3D المحرك بتوصيل كبل محرك 3D موصل محرك 3D على اللوحة الخلفية. إرفاق النظام المحرك ثلاثي الأبعاد للنظام المتصاعد باستخدام وظيفة الإفراج السريع على الأعلى للاتصال بمركز التصوير، والإفراج السريع جبل على الجزء السفلي بإلصاق المشبك محول طاقة.
  3. إرفاق المسبار المشبك محول طاقة.

3-بدء التصوير "الماوس الحوامل"

  1. مكان الماوس ضعيف على منصة الرصد. الماوس باستمرار يتلقى isoflurane مخدر (بين 1.5 2.5 في المائة) والأوكسجين (1 لتر/دقيقة) عن طريق مخروط الآنف. الشريط بلطف كل الكفوف لرصد منصات على المنصة معدل ضربات القلب-
    1. تطبيق 1-2 مل جل انتقال الموجات فوق الصوتية على البطن.
  2. باستخدام مرحلة الحركية اليدوية، وضع مسبار الموجات فوق الصوتية في أسفل البطن.
    1. موقع المثانة، والتي يجب أن تظهر كدائرة مظلمة مملوءة بسائل فقط سيفالاد على فتح المهبل.
    2. حالما يقع المثانة، نقل التحقيق ببطء شديد سيفالاد لتصور الرحم الحامل، والتي يجب أن تظهر كشكل أسطواني مع المناطق جولة في مواقع الحمل. وهذا يمكن وصفها بأنها تبدو وكأنها اللؤلؤ في سلسلة-
    3. مرة واحدة وقد تم تحديد الرحم الحامل، تبدأ تصوير 2-د.

4. التصوير بالموجات فوق الصوتية 2-د (الشكل 1)

  1. مرة واحدة وقد تم تحديد الرحم الحامل، وتبدأ الحمل الموقع الأقرب إلى المثانة وتتحرك ببطء والتتابع سيفالاد لتحديد عدد ومواقع للحمل.
  2. إذا هي تصور الكلي، والطحال، أو الكبد، قم بتغيير موضع التحقيق أوثق والذيلية (أقرب إلى المثانة) كما ذهب المستخدم جداً الآن سيفالاد-
  3. صورة القرن الرحم كونترالاتيرال بنفس الطريقة.
  4. تجميد الصورة عندما يكون الإطار بالموجات فوق الصوتية في وسط الموقع غرس/الحمل لإنقاذ للتحليل في وقت لاحق والقياسات.
    ملاحظة: يستغرق أقل من ثانية واحدة للصورة لتكون مجمدة وحفظها لتحليلها في وقت لاحق.
  5. قياس المسافة غرس استخدام رد فعل ديسيدواليزيشن هايبريتشويك كعلامة بالنقر يدوياً على " التدبير " أداة أولاً، ومن ثم النقر فوق موقع واحد غرس. بعد ذلك، اسحب المؤشر إلى التالي موقع غرس وانقر لرسم خط أن الكمبيوتر تلقائياً تقريرا عن بعد. البرنامج سيقدم تقريرا ثم ما القياس اليدوي. هذه الخطوة هو عدم المحوسبة، ولكن تعتمد على المستخدم لوضع علامة المسافة بين المواقع ديسيدواليزيد برسم خط بين المواقع ديسيدواليزيد، الذي سيقدم البرنامج قياس له.
  6. قياس حجم غرس وحجم الكيس الحملي، وحجم الجنين القطب.

5. معدل قلب الجنين

ملاحظة: ينبغي في d.p.c. 9.5، تصور ضربات قلب الجنين وضوح.

  1. مع الحفاظ على التحقيق لا يزال جداً، قم بتشغيل موجه ذبذبة دوبلر وضع هذا القلب النابض مرئية.
    2. ضربات القلب
  2. سجل القلب نبضات.
    ملاحظة: إلى جانب القلب، وهذا الإجراء يمكن أيضا تسجيل نبضات في الحبل السري.

6-ثلاثي الأبعاد "بالموجات فوق الصوتية اقتناء"

  1. بعد وقد تم تصور الرحم الحامل في تصوير ثنائي الأبعاد، موضع التحقيق في منطقة التي في منتصف التقريبي للصورة ثلاثية الأبعاد المطلوب. على سبيل المثال، إذا كان أحد تم تصوير تفاحة ثلاثي الأبعاد، التحقيق في البداية توضع فيها لب التفاح هو توقع أن يكون الموقع (أي منتصف كائن).
  2. مع المسبار في موقع في وسط الصورة المرجوة، الحصول على عملية شراء ثلاثي الأبعاد. مرحلة السيارات ثلاثية الأبعاد سوف السفر هذه المسافة عبر الرحم في سلسلة من الخطوات أو الإطارات، قصد أسر بكاملها ما المحقق الرغبات.
  3. تأكيد أن هياكل المقصود تماما يتم التقاطها في المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد قبل إتمام الجزء الموجات فوق الصوتية في الوقت الحقيقي. حفظ هذه المعلومات ثلاثي الأبعاد لمرحلة ما بعد المعالجة في وقت لاحق. إجمالي الوقت للحصول على الموجات فوق الصوتية ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد ما يقرب من 10-20 دقيقة عندما يؤديها خبرة مستخدم.

7-إعادة تشكيل ثلاثي الأبعاد ما بعد "المعالجة" (الشكل 2)

  1. تحميل البيانات المطلوبة لمعالجة الصور ثلاثية الأبعاد.
  2. اختر " الطرق الموازية والتناوب "، الذي سيتم تحميل كافة إطارات الصور الثلاثية الأبعاد إلى ثلاثي الأبعاد واحد " مربع " أن المستخدم سوف ثم تتبع الكائن المطلوب في الإطار حسب الإطار. اختر الخطوة الحجم مل 0.08. تبدأ نهاية كتلة صورة واحدة والتمرير من خلال تعريف بالصور التي ألقي القبض عليهم داخل الفضاء.
    1. ابدأ في نهاية واحدة من الصورة وتتبع الخطوط العريضة للكائن يدوياً.
    2. انتقل إلى شريحة صورة 2-د القادم أو " الإطار " وتتبع الخطوط العريضة للكائن يدوياً.
    3. مواصلة هذه العملية حتى يتم كل الإطارات يدوياً المشروح/تتبع المستخدم.
    4. انقر فوق " الانتهاء من " للحصول على صورة ثلاثية الأبعاد وحجم مجموع الحسابات.
  3. اختر بين الشبكة وتراكب الصلبة، وسهم في الركن الأيسر العلوي.
    4. اختر
  4. إبقاء أو إزالة معلومات الصورة المحيطة بالموجات فوق الصوتية للوضوح. قد يستغرق كل الإعمار ثلاثي الأبعاد بين 10 و 20 دقيقة

8. الرعاية ما بعد الإجرائي

  1. عند الانتهاء من الموجات فوق الصوتية، إيقاف غاز التخدير وإزالة الماوس من المنصة وامسح برفق ويغسل أي جل الموجات فوق الصوتية من الحيوان.
  2. ضع الماوس مرة أخرى في القفص في موقف معرضة في منطقة مبطن. رصد حتى الحيوان مستيقظا ويتحرك عفويا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 1، يمكن كشف الموجات فوق الصوتية عالية التردد غرس موقع التنمية ابتداء من أقرب نقطة الوقت d.p.c 5.5. باستخدام هايبريتشويك أخف بطانة الرحم ديسيدواليزيد كعلامة مواقع غرس في 6.5 d.p.c يسمح عدد المواقع غرس وتباعد هذه المواقع كمياً. كالحمل أيضا تقدم إلى 7.5 d.p.c. وأكثر قتامة من الكيس الحملي هيبويتشويك القطب الجنين يمكن تحديدها بسهولة.

كما هو مبين في الشكل 2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هذا الاستخدام الرواية لتصوير هفوس ثلاثي الأبعاد يوضح القدرة على الكشف عن بنجاح وتصور، وتميز مواقع زرع الجنين أثناء الحمل المبكر مورين بطريقة غير الغازية. يوفر التكنولوجيا تحسن كبير على الأساليب الحالية، التي تعتمد على انقطاع الحمل لتوصيف الأنسجة والأنسجة الإجمالي. ومع ذلك تجدر الإشارة إلى أن أساليب نسيجية لا يزال يعتبر أكثر الأمثل عندما وصف مستوى تضخيم أكثر وأكثر الخلوية هو المطلوب، أو عندما يكون مطلوباً تحليل الجينات والبروتين. مع تزايد عدد من نماذج الماوس جديدة عرض عيوب غرس وأوائل الحمل فقدان19<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونحن نقدر كثيرا مساعدة يان يينغ تشاو رونغ ولي جي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
منصة التصوير بالموجات فوق الصوتية VisualSonics Vevo 2100 / آلةVisualSonics، inc.VS-11945
محطة تصوير فيفوVisualSonics، inc.SA-11982
Aquasonic 100 جل نقل بالموجات فوق الصوتيةباركر#SKU PLI 01-08
Isoflurane (IsoThesia) زجاجة 100 ملهنري شين# 29404
PuraLubenمرهم العيون الحيوانيDechra# 12920060

المراجع

  1. Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
  2. Sugiura-Ogasawara, M., Ozaki, Y., Suzumori, N. Management of recurrent miscarriage. J Obstet Gynaecol Res. 40 (5), 1174-1179 (2014).
  3. Kutteh, W. H. Novel strategies for the management of recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med. 33 (3), 161-168 (2015).
  4. Page, J. M., Silver, R. M. Genetic Causes of Recurrent Pregnancy Loss. Clin Obstet Gynecol. 59 (3), 498-508 (2016).
  5. Zhang, J., Croy, B. A. Using ultrasonography to define fetal-maternal relationships: moving from humans to mice. Comp Med. 59 (6), 527-533 (2009).
  6. Li, S. J., et al. Differential regulation of receptivity in two uterine horns of a recipient mouse following asynchronous embryo transfer. Sci Rep. 5, 15897(2015).
  7. Ding, Y. B., et al. 5-aza-2'-deoxycytidine leads to reduced embryo implantation and reduced expression of DNA methyltransferases and essential endometrial genes. PLoS One. 7 (9), e45364(2012).
  8. Kusakabe, K., Naka, M., Ito, Y., Eid, N., Otsuki, Y. Regulation of natural-killer cell cytotoxicity and enhancement of complement factors in the spontaneously aborted mouse placenta. Fertil Steril. 90 (4 Suppl), 1451-1459 (2008).
  9. Demianczuk, N. N., et al. The use of first trimester ultrasound. J Obstet Gynaecol Can. 25 (10), 864-875 (2003).
  10. Thompson, H. E. Evaluation of the obstetric and gynecologic patient by the use of diagnostic ultrasound. Clin Obstet Gynecol. 17 (4), 1-25 (1974).
  11. Unterscheider, J., et al. Definition and management of fetal growth restriction: a survey of contemporary attitudes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 174, 41-45 (2014).
  12. Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), e77205(2013).
  13. Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reprod Biol Endocrinol. 12, 38(2014).
  14. Nguyen, T. M., et al. Estimation of mouse fetal weight by ultrasonography: application from clinic to laboratory. Lab Anim. 46 (3), 225-230 (2012).
  15. Singh, S., et al. Quantitative volumetric imaging of normal, neoplastic and hyperplastic mouse prostate using ultrasound. BMC Urol. 15, 97(2015).
  16. Liu, L., et al. Ultrasound-mediated destruction of paclitaxel and oxygen loaded lipid microbubbles for combination therapy in ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 361 (1), 147-154 (2015).
  17. Ni, J., et al. Monitoring Prostate Tumor Growth in an Orthotopic Mouse Model Using Three-Dimensional Ultrasound Imaging Technique. Transl Oncol. 9 (1), 41-45 (2016).
  18. Peavey, M. C., et al. Three-Dimensional High-Frequency Ultrasonography for Early Detection and Characterization of Embryo Implantation Site Development in the Mouse. PLoS One. 12 (1), e0169312(2017).
  19. Song, H., et al. Cytosolic phospholipase A2alpha is crucial [correction of A2alpha deficiency is crucial] for 'on-time' embryo implantation that directs subsequent development. Development. 129 (12), 2879-2889 (2002).
  20. Nallasamy, S., Li, Q., Bagchi, M. K., Bagchi, I. C. Msx homeobox genes critically regulate embryo implantation by controlling paracrine signaling between uterine stroma and epithelium. PLoS Genet. 8 (2), e1002500(2012).
  21. Hirate, Y., et al. Mouse Sox17 haploinsufficiency leads to female subfertility due to impaired implantation. Sci Rep. 6, 24171(2016).
  22. Wang, T. S., et al. Dysregulated LIF-STAT3 pathway is responsible for impaired embryo implantation in a Streptozotocin-induced diabetic mouse model. Biol Open. 4 (7), 893-902 (2015).
  23. Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ Res. 92 (2), 133-135 (2003).
  24. Srinivasan, S., et al. Noninvasive, in utero imaging of mouse embryonic heart development with 40-MHz echocardiography. Circulation. 98 (9), 912-918 (1998).
  25. Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
  26. Pratap, K., Singh, V. P. A training course on laboratory animal science: an initiative to implement the Three Rs of animal research in India. Altern Lab Anim. 44 (1), 21-41 (2016).
  27. Landi, M. S., Shriver, A. J., Mueller, A. Consideration and checkboxes: incorporating ethics and science into the 3Rs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (2), 224-230 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة