Method Article

تصوير مرور الوقت فوتون متعددة لتصور التنمية في الوقت الحقيقي: التصور لترحيل الخلايا العصبية كريست في الأجنة الزرد

DOI:

10.3791/56214

⸱

August 9th, 2017

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ مزيج من التقنيات البصرية المتقدمة في ليزر المسح المجهري مع الطول الموجي الفوتوني متعدد الأسفار الإثارة منذ وقت طويل لالتقاط التصوير عالية الدقة، ثلاثي الأبعاد، في الوقت الحقيقي للهجرة crest العصبي في تيراغرام (sox10:EGFP) والأجنة الزرد تيراغرام (foxd3:GFP).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العين الخلقية والشذوذ الجمجمة تعكس اضطرابات في قمة العصبية، عدد سكانها عابر للخلايا الجذعية المهاجرة التي تؤدي إلى العديد من أنواع الخلايا في جميع أنحاء الجسم. فهم بيولوجيا crest العصبي كان محدودا، مما يعكس عدم وجود نماذج أصعب وراثيا التي يمكن دراستها في فيفو وفي الوقت الحقيقي. الزرد نموذج إنمائي أهمية خاصة لدراسة السكان خلية المهاجرة، مثل قمة العصبية. لدراسة الهجرة crest العصبي في العين النامية، تم تنفيذ مزيج من التقنيات البصرية المتقدمة في ليزر المسح المجهري مع الإثارة fluorescence فوتون متعدد الطول الموجي الطويل التقاط الفيديو عالية الدقة، ثلاثي الأبعاد، في الوقت الحقيقي للعين النامي في الأجنة المعدلة وراثيا الزرد، هما تيراغرام (sox10:EGFP) وتيراغرام (foxd3:GFP)، كما قد ثبت في العديد من النماذج الحيوانية لتنظيم المبكر crest العصبي التمايز والمرجح أن تمثل علامات للخلايا العصبية كريست sox10 و foxd3 . تصوير الوقت الفاصل بين فوتون متعددة استخدمت لتمييز السلوك وأنماط الهجرة اثنان السكان خلية crest العصبي تسهم في الإسراع بتطوير العين. هذا البروتوكول يوفر المعلومات لتوليد الوقت الفاصل بين أشرطة الفيديو أثناء الهجرة crest العصبي الزرد، على سبيل مثال، ويمكن تطبيقها أيضا على تصور التطور المبكر للعديد من الهياكل في الزرد وغيرها من الكائنات نموذج.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أمراض العيون الخلقية يمكن أن تسبب عمي الطفولة وغالباً ما تكون بسبب شذوذ قمة العصبية الجمجمة. هي الخلايا العصبية كريست عابرة من الخلايا الجذعية التي تنشأ من الأنبوب العصبي وتشكل أنسجة عديدة في جميع أنحاء الجسم. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 الخلايا العصبية كريست، المستمدة من بروسينسيفالون وميسينسيفالون، تؤدي إلى العظام والغضاريف ميدفيس في المناطق الأمامية، وايريس، القرنية، ميشوورك ترابيكولار، والصلبة في الجزء الأمامي من العين. 4 , 6 , 7 , 8 خلايا crest العصبي من النموذج رهومبينسيفالون بلعومية الأقواس والفك، والمسالك تدفق القلب. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 قد أبرزت الدراسات بمساهمات قمة العصبية للعين والتنمية بيريوكولار، مؤكدا على أهمية هذه الخلايا في التنمية عين الفقاريات. وفي الواقع، انقطاع الهجرة الخلية كريست العصبية والتمايز تؤدي إلى الشذوذ الجمجمة والعين كما هو ملاحظ في متلازمة أكسينفيلد-ريجر ومتلازمة بيترز بالإضافة إلى. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 تقديم فهم شامل للهجرة، وانتشار والتفريق بين هذه الخلايا العصبية كريست هكذا، في نظرة ثاقبة التعقيدات الكامنة وراء أمراض العيون الخلقية.

الزرد كائن نموذج قوية لدراسة التنمية العين، هياكل العين الزرد مماثلة لنظرائهم في الثدييات، وتقحم حفظت العديد من الجينات بين الزرد والثدييات. 18 , 19 , 20 ، وباﻹضافة إلى ذلك، الأجنة الزرد شفافة والاباضه، تسهيل تصور التنمية العين في الوقت الحقيقي.

التوسع في الأعمال المنشورة سابقا، وصفت6،،من720 نمط الهجرة من الخلايا العصبية كريست استخدام فوتون متعدد الأسفار الوقت الفاصل بين التصوير على خطوط الزرد المعدلة وراثيا المسمى مع البروتين الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) تحت سيطرة جمهورية يوغوسﻻفيا (تحديد الجنس منطقة Y) النسخي-مربع 10 (sox10) أو "مربع فورخيد" D3 المناطق التنظيمية الجينات (foxd3). 21 , 22 , 23 , 24-فوتون متعدد الأسفار الوقت الفاصل بين التصوير هو تقنية قوية أن يجمع بين التقنيات البصرية المتقدمة لليزر المسح المجهري مع طويلة الطول الموجي الفوتوني متعدد الأسفار الإثارة لالتقاط الصور ذات الدقة العالية، وثلاثي الأبعاد للعينات الموسومة fluorophores. 25 , 26 , 27 استخدام الليزر متعددة فوتون مزايا متميزة أكثر مجهرية [كنفوكل] القياسية، بما في ذلك اختراق الأنسجة المتزايدة وتبيض فلوروفوري انخفض.

باستخدام هذا الأسلوب، كان السكان مميزة اثنين من الخلايا العصبية كريست متفاوتة في توقيت الهجرة ومسارات الهجرة crest العصبي الذين يتعرضون للتمييز، وهي: foxd3-إيجابية الخلايا في ميسينتشيمي بيريوكولار والعين النامية وكريست العصبية الإيجابية sox10 خلايا mesenchyme الجمجمة. مع هذا الأسلوب، وهو عرض نهج لتصور الهجرة الهجرة crest العصبي العين والجمجمة في الزرد، مما يجعل من السهل لمراقبة الهجرة الخاضعة للتنظيم العصبي كريست في الوقت الحقيقي أثناء التطوير.

هذا البروتوكول يوفر المعلومات لتوليد الوقت الفاصل بين أشرطة الفيديو أثناء تطوير العين مبكرا في تيراغرام (sox10:EGFP) والزرد المعدلة وراثيا تيراغرام (foxd3:GFP)، على سبيل مثال. يمكن تطبيق هذا البروتوكول كذلك للمرئيات عالية الاستبانة، ثلاثي الأبعاد، في الوقت الحقيقي للإسراع بتطوير أي بنية العين والجمجمة المستمدة من الخلايا العصبية كريست في الزرد. وعلاوة على ذلك، يمكن كذلك تطبيق هذا الأسلوب لتصور تطوير الأنسجة والأعضاء في الزرد وغيرها نماذج حيوانية أخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ البروتوكول الموصوف هنا وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاملة الإنسانية لحيوانات المختبر التي وضعتها لجنة جامعة ميشيغان لاستخدام ورعايتها (UCUCA).

< p class = "jove_title" >1. جمع الأجنة للتصوير بفاصل زمني

  1. بين الساعة 3 و 9 مساء ، قم بإعداد سمك الزرد البالغ من الذكور والإناث Tg (sox10: EGFP) أو Tg (foxd3: GFP) في خزان تكاثر مقسم للتزاوج الزوجي.
    ملاحظة: تم عبور أسماك Tg (sox10: EGFP) و Tg (foxd3: GFP) ، وهي هدايا لطيفة من Thomas Schilling و Mary Halloran ، على التوالي ، إلى خلفية Casper (روي -/- ، صدف -/-) لتقليل التألق التلقائي والتداخل مع التصبغ.
    1. قم بتجميع خزان التكاثر (خزان داخلي مشقوق + خزان خارجي صلب) واملأه بمياه نظام التناضح العكسي (RO).
    2. انقل ما يصل إلى 3 إناث و 3 ذكور إلى جوانب متقابلة من الحوض مفصولة بمقسم ؛ يمكن تربية ما يصل إلى 6 أسماك بشكل زوجي في حوض تربية واحد.
    3. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة الحاجز بعد فترة وجيزة من تشغيل الأضواء في vivarium.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، تكون الأضواء في دورة ضوء لمدة 14 ساعة (في الساعة 9 صباحا) و 10 ساعات مظلمة (مطفأة في الساعة 11 مساء).
    4. اسمح بالتزاوج دون إزعاج لمدة 20 دقيقة أو حتى يتم إنتاج أعداد كافية من الأجنة ؛ ستكون الأجنة في قاع خزان التكاثر. عند ملاحظة البيض ، ارفع الخزان الداخلي المشقوق مع الأسماك وضعها بسرعة (الأسماك والخزان الداخلي) في خزان خارجي صلب نظيف مملوء بماء التناضح العكسي.
  2. قم بإعداد وسط الجنين القياسي 1X بإضافة ما يلي لكل 1 لتر من ماء التناضح العكسي: 0.287 جم (4.9 ملم) كلوريد الصوديوم ، 0.127 جم (0.17 مل) كلوريد كلوريد ، 0.048 جم (0.33 مل) كلوريد الكالسيوم2.2 ساعة2O ، 0.04 جم (0.33 ملم) MgSO4 (اللامائية). قلب المحلول حتى تذوب الأملاح تماما.
    1. أضف 100 ميكرولتر من 0.1٪ ميثيلين بلو كمبيد للفطريات. أضف 0.25 جم من بيكربونات الصوديوم لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.75. يحفظ متوسط في درجة حرارة الغرفة.
  3. اجمع البيض من الخزان الخارجي باستخدام حاجز جمع البيض ، وانقل البيض إلى أطباق بتري (~ 50 جنينا لكل طبق) تحتوي على 30 مل من وسط الجنين 1X. احتضان البيض الذي تم جمعه عند 28.5 درجة مئوية.
  4. تحضير الجنين
    1. أجنة Tg (sox10: EGFP).
      1. بالنسبة لأجنة Tg (sox10: EGFP) ، بعد 12 ساعة من الإخصاب (HPF) ، قم بإزالة البويضات الميتة وتقييم مرحلة نمو الأجنة. فحص الأجنة الإيجابية ل GFP باستخدام مجهر مجسم فلوري تشريح مع مرشح إثارة قياسي 460-490 نانومتر. باستخدام الملقط ، قم بإزالة المشيمات من 3-4 أجنة تعبر عن GFP ، وانقل هذه الأجنة إلى طبق بتري منفصل يحتوي على 30 مل من وسط الجنين الطازج 1X.
    2. أجنة Tg (foxd3: GFP).
      1. بالنسبة لأجنة Tg (foxd3: GFP) ، عند 22-24 HPF ، قم بإزالة البويضات الميتة وتقييم المرحلة النموية للأجنة. فحص الأجنة الإيجابية باستخدام مجهر مجسم فلوري تشريح مع مرشح إثارة قياسي 460-490 نانومتر. باستخدام الملقط ، قم بإزالة المشيمات من 3-4 أجنة تعبر عن GFP.
      2. قم بإعداد محلول مخزون 1000X Phenylthiourea (PTU) عن طريق إذابة 0.75 جم (3٪) من PTU في 25 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). قم بتخزين محلول المخزون عند 4 درجات مئوية. أضف 30 ميكرولتر من محلول مخزون 1000X PTU (3٪) إلى 30 مل من وسط الجنين 1X لتوليد محلول PTU بنسبة 0.003٪.
      3. ضع الأجنة الإيجابية ل GFP التي تم فحصها وإزالة الغضب في محلول PTU بنسبة 0.003٪ لمنع التصبغ. لا تبدأ في علاج الأجنة ب PTU قبل 20 HPF ، لأن العلاج المبكر (عند <20 hpf) يمكن أن يكون له آثار ضارة على القمة العصبية ونمو الخلايا الظهارية. <فئة الدعم = "xref">28
    3. قبل إجراء تجربة الفاصل الزمني ، راقب الأجنة من خلال التصوير المباشر باستخدام مجهر مجسم قياسي على فترات تتراوح من 12 إلى 24 ساعة في مقارنات متطابقة مع العمر كتحكم في انجراف درجة الحرارة.
< p class = "jove_title" >2. تركيب الجنين للتصوير بفاصل زمني

  1. تحضير وسائط الجنين بفاصل زمني
    1. قم بإعداد محلول مخزون التريكيين القياسي بنسبة 0.4٪ عن طريق إضافة 0.004 جم من التريكيين إلى 100 مل من ماء التناضح العكسي. Aliquot (~ 1 مل) محلول المخزون في أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 1.5 مل وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    2. تحضير وسط الجنين بفاصل زمني (50 مل من وسط الجنين 1X ، 0.016٪ ثلاثاء) عن طريق إضافة 2 مل من محلول ثلاثي الكنائين 0.4٪ إلى 48 مل من وسط الجنين 1X. في حالة استخدام الأجنة >22 حصان ، أضف أيضا 50 ميكرولتر من محلول مخزون PTU 3٪ (التركيز النهائي .003٪ PTU) إلى وسط الجنين.
  2. تحضير 2٪ من الاغاروز منخفض الذوبان
    1. أضف 0.4 جم من مسحوق الاغاروز منخفض الذوبان إلى 20 مل من وسط الجنين 1X. سخنيها لمدة 1-2 دقيقة أو حتى يصبح المحلول صافيا وتذوب جميع الجزيئات.
      ملاحظة: تؤدي زيادة النسبة المئوية لهلام الاغاروز إلى تقليل مسامية المصفوفة ، مما قد يعيق جسديا نمو الجنين وتطوره. لذلك ، يمكن خفض محلول الاغاروز إلى 1.5٪ لتقليل هذه التأثيرات. ومع ذلك ، عندما يتم تثبيت شعاع الإثارة ثابتا أثناء الفحص المجهري للمسح بالليزر ، يمكن أن يحدث تسخين أكبر ، ويزداد بسرعة في علاقة لوغاريتمية مع الوقت. في هذا البروتوكول ، يكون التسخين الناتج عن امتصاص الفلوروفور موضعيا بشكل كبير في المنطقة البؤرية. وبالتالي ، في منطقة الاهتمام ، يمكن أن ترتفع درجة الحرارة إلى قيمة عالية بما يكفي (≥ 30 درجة مئوية) لإذابة محاليل الاغاروز المصنوعة بنسب أقل من 1.5 ، وبالتالي تعريض الجنين مباشرة لليزر أو الظروف المواتية التي يطفو فيها الجنين خارج المستوى البؤري. لهذا السبب ، لا ينصح باستخدام محاليل الاغاروز التي تقل عن 1.5٪.
    2. Aliquot (~ 1 مل) محلول الاغاروز في أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 1.5 مل للتخزين. قم بتخزين محلول الاغاروز الزائد في شكل سائل على كتلة حرارية (60-70 درجة مئوية) لمدة 2-3 أسابيع.
  3. تركيب الجنين
    1. لإعداد غرفة الحمام المفتوحة ، ضع كمية صغيرة من الشحوم ذات التفريغ العالي على قاعدة حجرة الحمام المفتوحة. ضع غطاء زجاجي دائري على القاعدة وقم بلف الجزء العلوي من حجرة الحمام المفتوحة على القاعدة حتى يصبح مشدودا (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1 أ ، ب).
    2. ماصة (~ 500-700 ميكرولتر) من محلول الاغاروز 2٪ (60-70 درجة مئوية) في غرفة الحمام المفتوحة حتى تمتلئ القاعدة ~ 3/4 (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1 ج). لاحظ أنه بمجرد أن يكون محلول الاغاروز في غرفة الحمام المفتوحة على مقعد المختبر ، تنخفض درجة حرارة المحلول حوالي 1 درجة مئوية / ثانية.
    3. انتظر 30 ثانية للسماح للأغاروز بالتبريد قليلا (~ 30-40 درجة مئوية) ، دون بلمرة كاملة ، ثم نقل جنين واحد إلى مركز القاعدة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1D ، E).
    4. تحت المجهر المجسم الفلوري ، ضع الجنين باستخدام طرف ماصة دقيقة سعة 1-10 ميكرولتر ، مع التأكد من وضع الجنين بالقرب من قاع الاغاروز ، حيث قد يطفو الجنين بعيدا عند تغطيته بوسط الجنين إذا تم وضعه بالقرب من سطح الاغاروز.
      ملاحظة: في مقاطع الفيديو المعروضة (مقاطع الفيديو 1-3) ، يتم توجيه الأجنة بشكل جانبي ، ولكن اعتمادا على منطقة الاهتمام ، يمكن توجيه الأجنة بطنيا أو ظهريا.
    5. راقب الجنين وأعد وضعه حتى يتماسك الاغاروز. بمجرد أن يتماسك الاغاروز ، استخدم ماصة نقل لملء الغرفة المفتوحة المجمعة بالكامل بوسائط الجنين ذات الفاصل الزمني (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1F).
    6. ضع حجرة الحمام المفتوحة في منصة التبادل السريع ، والتي تتناسب مع محول المسرح (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1G). ضع الإعداد بالكامل (الجنين ، غرفة الحمام المفتوحة ، منصة التبادل السريع ومحول المرحلة) على مسرح المجهر فوق المكثف مباشرة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1H).

3. إعداد المجهر للتصوير بفاصل زمني

  1. تحديد إعدادات الليزر
    1. تحديد الطول الموجي لليزر لاستخدامه. استخدم طولا موجيا يبلغ ضعف الطول الموجي للإثارة للفلوروفور محل الاهتمام (على سبيل المثال ، الطول الموجي بين 880 و 940 نانومتر ل GFP).
      ملاحظة: في الدراسة الحالية ، كان إعداد الطول الموجي ل GFP بين 880 و 940 نانومتر. كلما زاد الطول الموجي ، انخفضت طاقة خرج الليزر.
    2. تحديد الإرسال بالليزر. نسبة عالية من انتقال الليزر ستقتل الجنين ، وتستخدم أدنى مستوى من الانتقال (موصى به). بالنسبة لدراسات الفاصل الزمني لمدة 24 إلى 48 ساعة، كما هو معروض هنا، حافظ على انتقال العدوى أقل من 5٪.
    3. تحديد أنظمة الكشف عن المجهر والتأكد من وجود المرشحات الصحيحة للفلوروفور.
      ملاحظة: بالنسبة للمجاهر متعددة الفوتون ، هناك أنظمة كشف متعددة ذات حساسيات مختلفة للتألق المنبعث. بشكل عام ، يتمتع نظام الكشف الداخلي بحساسية أقل من نظام الكشف الخارجي. بالنسبة للخطوط المعدلة وراثيا ذات المستويات العالية من التعبير عن GFP ، يكون نظام الكشف الداخلي مناسبا. بالنسبة للخطوط المعدلة وراثيا ذات المستويات المنخفضة من تعبير GFP أو مع الفلوروفورات الأخرى (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأحمر) ، قد تكون هناك حاجة إلى نظام كشف خارجي للحفاظ على النسبة المئوية لنقل الليزر عند مستوى معقول. بغض النظر عن نظام الكشف المستخدم ، يجب أن تكون المرشحات الصحيحة للفلوروفور في مكانها.
  2. ضبط إعدادات البرنامج على المجهر متعدد الفوتون
    1. باستخدام هدف 5X ، حدد موقع الجنين. ارفع المسرح يدويا إلى أعلى موضع ، واستخدم التركيز الدقيق لوضع الجنين في منتصف نطاق المجهر.
    2. قم بخفض المرحلة يدويا ، وقم بتغيير هدف 5X إلى هدف الغمر في الماء 25X (الفتحة العددية NA ، 0.95). ارفع المسرح بعناية لإعادة الجنين إلى التركيز.
    3. في البرنامج ، انقر فوق وضع "xyzt" للحصول على صور متعددة على فترات زمنية (t) في مستوى xy على عمق "z". استخدم عرض التألق السطحي أو الحقل الساطع للعثور على عمق التركيز في منطقة الاهتمام ، والتي ستحدد المكدس Z.
      1. في البرنامج ، انقر فوق الزر "بدء" ؛ بالنسبة لهذه التجارب ، كانت الحافة الجانبية للعين هي بداية المكدس Z. انقر فوق الزر "إنهاء" ؛ كان خط الوسط للجنين هو نهاية المكدس Z.
        ملاحظة: كان حجم الخطوة 0.3-0.6 ميكرومتر وكان هناك إجمالي ~ 200 خطوة لحجم مكدس z من 60 إلى 120 ميكرومتر).
    4. انقر فوق القائمة لضبط وقت الاستحواذ وتردد التصوير. بالنسبة للنظام الحالي ، تتطلب ~ 200 خطوة حوالي 5 دقائق لكل عملية استحواذ على z-stack. من أجل التعافي الكافي من الفلوروفور وبقاء الجنين ، اسمح بنسبة لا تقل عن 1: 3 بين اكتساب z-stack (تشغيل الليزر) ووقت الاسترداد (إيقاف تشغيل الليزر).
      ملاحظة: على سبيل المثال، يتم الحصول على z-stacks كل 20 دقيقة مع 5 دقائق من اكتساب z-stack و 15 دقيقة من الاسترداد. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يمكن الحصول على مكدسات z أكبر ، ولكنها ستزيد بشكل مناسب من الوقت بين عمليات الاستحواذ على z-stack ، مما يؤدي إلى عدد أقل من الصور خلال دورة الفاصل الزمني.
      1. مع الوقت المناسب لاستعادة الأجنة ، اضبط الوقت بين المداخن z في النافذة المحددة. قم بتعيين المدة الزمنية الإجمالية للتجربة في النافذة المناسبة.
    5. التعديلات النهائية للبرامج والليزر والجنين.
      1. قم بتشغيل إعداد الصورة الحية لإجراء تعديلات نهائية على إعدادات الليزر. اضبط نقل الليزر (انظر 3.1.2) ، وأشرطة التمرير والتعويض داخل البرنامج لتحسين صورة الفلورسنت. أيضا ، اضبط اتجاه الجنين ، حسب الحاجة ، اعتمادا على طول التجربة ، والنمو المتوقع للجنين ، وما إلى ذلك. تأكد من بقاء منطقة الاهتمام داخل الإطار طوال مدة التجربة.
      2. قم بإيقاف تشغيل مصدر ضوء اللفائفلورسنت حيث لم تعد هناك حاجة إليه أثناء الحصول على الفاصل الزمني. قم بتغطية المسرح بصندوق أمان الليزر (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1I). عند استخدام نظام الكشف الداخلي ، يكون صندوق أمان الليزر مناسبا للحماية من ضوء الخلفية. اضغط على "ابدأ".
        ملاحظة: ومع ذلك، مع أنظمة الكشف الخارجية الأكثر حساسية، لا يحجب صندوق الأمان بالليزر ما يكفي من ضوء الخلفية، ويلزم وجود أغطية إضافية لمنع تعطيل الحصول على الصور.

4. أثناء اكتساب الفاصل الزمني

  1. أعد ملء غرفة الحمام المفتوحة بوسائط جنين بفاصل زمني كل 8-12 ساعة (على الأقل مرتين في اليوم) أثناء الحصول على الفاصل الزمني من خلال الأبواب المنزلقة على صندوق أمان الليزر (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1I).
  2. قبل فتح أبواب صندوق الأمان بالليزر ، تأكد من أن المجهر لا يكتسب صورة بنشاط.
    ملاحظة: استخدام السخانات وأنظمة الوسائط المتداولة ليس ضروريا لتجارب التصوير بفاصل زمني التي تستمر من 24 إلى 48 ساعة. في الواقع ، يصعب التحكم في درجات حرارة كل من السخانات المرحلية والمدمجة ، وأثناء الحصول على الصورة يظهر الجنين معدل نمو مناسب عند درجة حرارة تتراوح من 25 إلى 28 درجة مئوية. علاوة على ذلك ، تميل أنظمة الوسائط المتداولة إلى الفائض وربما إتلاف المعدات. وبالتالي ، يتم تنظيم جميع الأجنة بشكل روتيني بعد الاستحواذ.

5. معالجة ما بعد الاستحواذ

  1. في البرنامج ، انقر فوق قائمة "ملف" واختر "حفظ".
  2. افتح الملف في برنامج معالجة الصور (انظر جدول المواد). قم بتمييز سلسلة الصور الصحيحة. في البرنامج ، اختر قائمة "معالجة". انقر فوق 3D Deconvolution و "تطبيق" لفك كل z-stack.
    ملاحظة: الملف كبير. لذلك ، قد تستغرق هذه الخطوة عدة ساعات.
  3. في البرنامج ، ضمن قائمة "معالجة" ، انقر فوق "الحد الأقصى للإسقاط". انقر فوق "تطبيق" لبدء الحد الأقصى للإسقاط لإنشاء صورة واحدة لكل مكدس z. قم بتصدير كل ملف بحد أقصى متوقع (صورة واحدة لكل مكدس z) كملف tiff.
  4. قم باستيراد ملفات tiff الفردية إلى برنامج معالجة الفيديو. حدد جميع ملفات tiff واسحبها إلى محرر الفيديو. اضبط طول كل صورة داخل الفيديو على 0.1 ثانية. تصدير الفيديو كملف mov أو mp4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصوير الوقت الفاصل بين فوتون متعدد الأسفار ولدت سلسلة من أشرطة الفيديو التي كشفت عن أنماط الهجرة الجمجمة العصبي كريست الخلايا التي تؤدي إلى الهياكل الجمجمة والجزء الأمامي من العين في تيراغرام (sox10:EGFP) وتيراغرام (foxd3:GFP) خطوط الزرد. على سبيل مثال، ترحيل sox10خلايا كريست العصبية الإيجابية بين 12 و 30 هبف من حافة الأنبوب العصبي في منطقة الجمجمة (فيديو 1، الشكل 2). تهاجر الخلايا من بروسينسيفالو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصوير الوقت الفاصل بين فوتون متعددة يمكن التتبع في فيفو السكان خلية العابرة والمهاجرة. يمكن استخدام هذه التقنية القوية لدراسة العمليات الجنينية في الوقت الحقيقي، وفي هذه الدراسة، نتائج هذا الأسلوب تعزيز المعارف الراهنة للهجرة الخلية crest العصبي والتنمية. عادة استخدام الدراسات الوقت الفاصل بين التصوير السابقة [كنفوكل] ليزر المسح المجهري. 29 , 30 , 31 , 32 ، نقدم هنا استخدام تقنية فوتون...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان هذا العمل الدعم المالي من خلال المنح المقدمة من المعهد الوطني للعين للمعاهد الوطنية للصحة (K08EY022912-01) ورؤية البحوث الأساسية (P30 EY007003).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون توماس شيلينغ للاهداء يرجى الأسماك تيراغرام (sox10:eGFP)، وماري هالوران للاهداء يرجى الأسماك تيراغرام(foxd3:GFP) .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
خزانات التكاثر مع فواصلAquaneeringZHCT100 مجموعة خزانات العبور (1.0 لتر) بولي كربونات شفاف مع غطاء وإدراج
M205 FA Combi-ScopeLeica Microsystems CMS GmbHمجهر فلوري مجسم - FusionOptics و TripleBeam
كلوريد الصوديومMillipore (EMD)7760-5KGكيس PE مزدوج. سجل المستخلصات الكيميائية رقم 7647-14-5 ، رقم المفوضية الأوروبية 231-598-3
كلوريد البوتاسيومميليبور (EMD)1049380500كلوريد البوتاسيوم 99.999 فوق البور. رقم سجل المستخلصات الكيميائية 7447-40-7 ، رقم المفوضية الأوروبية 231-211-8.
بولي من كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتفيشر ScientificC79-500؛ 500 جم رقم CAS 10035-04-8
كبريتات المغنيسيوم (اللامائية)ميليبور (EMD)MX0075-1زجاجة بولي ؛ 500 جم رقم CAS 7487-88-9 ، رقم EC 231-298-2
زجاجة زجاجية من الميثيلين الأزرقميليبور (EMD)284-12؛ 25 جم مسحوق ، بيولوجي
معتمد من بيكربونات الصوديوم(EMD)SX0320-1زجاجة بولي ؛ 500 غرام مسحوق ، GR ACS. سجل المستخلصات الكيميائية رقم 144-55-8 ، رقم المفوضية الأوروبية 205-633-8
N-PhenylthioureaSigmaP7629-25G>98٪. رقم سجل المستخلصات الكيميائية 103-85-5 ، رقم المفوضية الأوروبية 203-151-2
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجماD8418-500MLدرجة البيولوجيا الجزيئية. رقم سجل المستخلصات الكيميائية 67-68-5 ، رقم المفوضية الأوروبية 200-664-3
تريكايين ميثان سولفوناتشركة ويسترن كيميكال إنك.MS222Tricaine-S
Low-Melt AgaroseISC BioexpressE-3112-25GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose ، 25 جرام
الحمام المفتوحةWarner InstrumentsRC-40HP
أغطية زجاجيةالمستوى Fisher Scientific12-545-102زجاج غطاء دائري. 25 مم قطر
شحم عالي الفراغفيشر Scientific14-635-5C2.0 رطل. DOW CORNING CORPORATION
1658832
منصة التبادل السريعWarner InstrumentsQE-135 ملم
محولالمرحلة Warner InstrumentsSA-20LZ-AL16.5 × 10 سم
TC SP5 MP مجهر متعدد الفوتونLeica Microsystems CMS GmbH
Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire LaserSpectraPhysics
Laser SafetyBoxLeica Microsystems CMS GmbH
Leica Application Suite X (LAS X)  برنامجLeica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 الإصدار 13.0 x64 برنامجAdobe
iMovie الإصدار 10.1.4 برنامجApple
زجاجة بيليبور غرفة عالية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
  2. Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
  3. Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
  4. Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
  5. Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
  6. Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
  7. Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
  8. Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
  9. Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
  10. Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
  11. Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984(2010).
  12. Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
  13. Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
  14. Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
  15. Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
  16. Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
  17. Lesnik Oberstein,, S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
  18. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  19. Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
  20. Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
  21. Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
  22. Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
  23. Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
  24. Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
  25. Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  27. Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  28. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991(2011).
  29. Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525(2013).
  30. Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
  31. McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190(2014).
  32. Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multi Photon ImagingTime Lapse MicroscopyNeural Crest CellsZebrafish EmbryosSox10 EGFPFoxd3 GFPLaser Scanning MicroscopyFluorescence ImagingEmbryo MountingZ Stack Acquisition

Related Articles