يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس مستويات مرناً على مر الزمن من خلال "الاستجابة" الخميرة التاكسج S. cerevisiae

7.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56226

⸱

أغسطس 10, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology, Rowan School of Osteopathic Medicine, 2Department of Biological Sciences, Rowan University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، بروتوكول باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي لرصد مستويات مرناً على مر الزمن من خلال استجابة الخلايا S. cerevisiae التاكسج. هذا الأسلوب يمكن تكييفها لتحليل التعبير الجيني أثناء أي الاستجابة الخلوية.

الملخص

التغييرات المعقدة في التعبير الجيني التوسط عادة جزءا كبيرا من الاستجابة الخلوية. قد تتغير كل الجينات التعبير مع حركية فريدة الجينات يخضع لتوقيت معين واحد من العديد من المحفزات، مما يشير إلى الممرات أو الآثار الثانوية. من أجل التقاط الجين كامل استخدمت التعبير استجابة لنقص في الخميرة S. cerevisiae، تحليل الحمض النووي الريبي seq لرصد مستويات مرناً لجميع الجينات في أوقات معينة بعد التعرض لنقص. أنشأت نقص نمو الخلايا في الغاز2 ~ 100% N. الأهم من ذلك، خلافا لغيرها من الدراسات التاكسج، ارجوستيرول، والأحماض الدهنية غير المشبعة لا أضيفت إلى وسائل الإعلام لأن تؤثر هذه المستقلبات في التعبير الجيني. وقد اختيرت النقاط الزمنية في نطاق 0-4 ح بعد نقص نظراً لأن تلك الفترة يلتقط التغييرات الرئيسية في التعبير الجيني. في كل مرة نقطة، سجل منتصف التاكسج الزنزانات بسرعة تصفيتها، وتجميد، والحد من التعرض للتغيرات س2 وملازم في التعبير الجيني. مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من الخلايا واستخدامه لإثراء مرناً، ثم حولتها إلى كدنا. من هذا كدنا، تم إنشاء مكتبات متعددة وكانت متسلسلة عينات ثمانية أو أكثر في حارة واحدة من المنظم الجيل القادم. يرد وصف خط أنابيب بعد انتهاء تسلسل، التي تشمل نوعية قاعدة التشذيب، قراءة الخرائط وتحديد عدد القراءات كل الجينات. واستخدمت DESeq2 داخل بيئة التطوير الإحصائي لتحديد الجينات التي تتغير بشكل كبير في أي من النقاط الزمنية التاكسج. وكشف تحليل لثلاثة replicates البيولوجي إمكانية تكرار نتائج عالية، وجينات حركية مختلفة وعدد كبير من المتوقع س2-تنظيم الجينات. هذه الأساليب يمكن استخدامها لدراسة كيفية استجابة خلايا الكائنات الحية المختلفة لنقص على مر الزمن وتكييفها لدراسة التعبير الجيني أثناء الاستجابات الخلوية الأخرى.

المقدمة

العديد من الكائنات الحية يستجيب لنقص أو انخفاض س2، بتغيير الجينات التعبير 1،،من23. هذا الرد يساعد على التعامل مع عدم وجود ركيزة حاسمة للتنفس الهوائي وردود الفعل السكروز عدة، ولكن أيضا مع حالة الأكسدة متغيرة 4خلايا. تظهر عدة دراسات ميكرواري أداؤها في S. cerevisiae أن مستويات مرناً لمئات جينات تتغير استجابة لنقص 5،،من67،،من89 , 10 , 11 , 12-في الآونة الأخيرة، تم استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي لوصف التغييرات التعبير الجيني مع مرور الوقت من خلال نقص 13. هنا، يتم عرض تفاصيل التجريبية ومناقشتها.

نقص يمكن أن يتحقق بطرق مختلفة، كل منها مستوى مختلف من س2إنتاج. هنا، أنشأت تتدفق باستمرار نقص فائقة عالية النقاء ن2 في قوارير، مما يقلل من [س2] حله فورا مع حركية استنساخه 10. فمن الممكن أن هناك بعض س2 جزيئات الحالية التي تساهم في التعبير الأيض والجينات ولكن هذه البيئة يعتبر جداً قريبة من اللاهوائية. نظراً لغياب س2، لا خلايا الخميرة الهيم biosynthesize، ارجوستيرول، والأحماض الدهنية غير المشبعة 4،،من1214. وهكذا، شملت الدراسات السابقة هذه المستقلبات عندما تنمو الخميرة دون أكسجين 5،،من1015. بيد الكثير من الردود التاكسج هي توسط استنفاد هذه المستقلبات وتجديد لهم ومن ثم عكس التعبير الجيني التاكسج الردود 12،16. أجل تقليد نقص الطبيعية، لم يتم إضافة هذه المستقلبات لوسائل الإعلام. في وقت قصير أن الخلايا قد تعرضت لنقص دون وجود نواتج الأيض الأساسية هذه، كان هناك لا زيادة ملحوظة في موت الخلية (البيانات لا تظهر) ولا استجابة إجهاد طويلة 13.

الاستجابة أيضا يعتمد على السلالة وعن النمط الوراثي. أهمية خاصة الآليلات المنظمين المعروفة من الردود التاكسج 2. الخلفية سلالة S288C المطلوب هو درجة عالية حيث أن نتائج يمكن مقارنتها بغيرها من الدراسات الجينومية تنفيذها مع هذه السلالة. ومع ذلك، يتضمن S288C اليل فقدان لوظيفة جزئية من HAP1 الجينات 17، منظم النسخي حرجة للاستجابة التاكسج. تم إصلاح هذا اليل في S288C wildtype باستخدام نسخة من Σ1278b سلالة الخلفية 11.

التعبير الجيني تعتمد اعتماداً كبيرا على البيئة الخلوية. وهكذا، عند إجراء تحليل مرناً على نطاق الجينوم، المهم الحفاظ على بيئة ثابتة بينما متفاوتة معلمة أخرى مثل الوقت أو الحافز أو الوراثي. لتحقيق نتائج عالية استنساخه، النظر في هذه الممارسات الثلاث للدراسة وجميعها لها replicates البيولوجية أو التقنية. أولاً، experimenter(s) نفسه ينبغي الاضطلاع بهذه الدراسة، حيث قد تختلف الممارسات التقنية عبر المجربون. ثانيا، ينبغي استخدام نفس الدفعة من المكونات في وسائط النمو ككل دفعة بتشكيل مختلف قليلاً يمكن أن يؤثر على التعبير الجيني. ثالثا، للتقليل من آثار دورة الخلية، كل نقطة مرة ينبغي أن يتألف من خلايا غير متزامن في سجل منتصف مرحلة النمو (1-2 × 107 خلايا/مل).

عندما وصف استجابة معقدة مثل الاستجابة التعبير الجيني لنقص، دورة وقت مفيد لتحديد حركية الأحداث المختلفة. وينبغي اختيار النقاط الزمنية المحددة التي سيتم التقاط التغييرات الرئيسية للاستجابة. في هذه الدراسة، لوحظت النقاط الزمنية بين 0 وح 4، لأن التجارب الماضية كشفت عن تغييرات واسعة النطاق في التعبير الجيني خلال هذه الفترة 13.

وكان تسلسل الحمض النووي الريبي لقياس التعبير الجيني العالمي، المستخدمة 18،19. يستخدم هذا الأسلوب تسلسل الجيل القادم لتحديد الوفرة النسبية للنسخة الجينات كل. مقارنة لتحليل الحمض النووي ميكرواري، يسلك تسلسل الحمض النووي الريبي حساسية أعلى (للكشف عن النصوص أقل وفرة)، أكبر مجموعة ديناميكية (لقياس أكبر إضعاف التغييرات) وإمكانية تكرار نتائج متفوقة (أن تتبع بدقة التعبير الجيني على مر الزمن). عادة ما يكون هو الحمض النووي الريبي الخلوية الأكثر الرنا الريباسي قد وضعت أساليب كثيرة لإثراء للحمض النووي الريبي محددة الأنواع 20. هنا، واستخدمت خرز بولي-T لتنقية بولي-A التي تحتوي على نصوص مرناً، على الرغم من مختلف تجارياً-مجموعات استنفاد الرنا الريباسي متاح يمكن أيضا أن تكون فعالة في إثراء مرناً.

هنا، اتسم رد التعبير الجيني S. cerevisiae لنقص. كانت تتعرض لنقص الخلايا وثم أخذ عينات في ثماني نقاط زمنية (0، 5، 10، 30، 60، 120، 180 و 240 دقيقة). للتأكد من إمكانية تكرار نتائج وتحديد النصوص المتغيرة إحصائيا، أجريت ثلاث replicates البيولوجية. الجيش الملكي النيبالي المستخرجة بواسطة تعطيل الميكانيكية وتنقية العمود، وثم تجهيزها لتحليل الحمض النووي الريبي seq. يتم وصف خط الأنابيب بعد انتهاء التسلسل وترد البرمجة النصية التي تسمح لإجراء النسخ المتماثل المحدد من التحليلات. تريموماتيك 21TopHat2 22، هتسيق 23، البيئة الإحصائية ص 24و حزمة DESeq2 25 وعلى وجه التحديد، استخدمت لمعالجة البيانات تسلسل الحمض النووي الريبي وتحديد الجينات 607 التي تغير بشكل ملحوظ خلال نقص. تحليل العنصر الرئيسي (PCA) والتعبير الجيني replicates أشارت إلى إمكانية تكرار نتائج هذا الأسلوب. كشف المجموعات و heatmaps حركية التعبير واسعة النطاق، بينما أظهر التحليل الجيني علم الوجود (GO) أن العديد من العمليات الخلوية، مثل التنفس الهوائي، وهي أثرت في مجموعة الجينات التي تنظم الأكسجين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-حمل نقص

  1. يوم واحد أو أكثر قبل الدورة نقص الوقت: إعداد الحاضنات، والخلية تصفية نظام الفراغ وخزان الغاز، قوارير، سدادات، الأنابيب الزجاجية، والأنابيب، كما هو الحال في جدول المواد.
  2. مكان N2 دبابة وحاضنة، والفراغ وتصفية النظام على مقربة، لتمكين المعالجة السريعة للخلايا.
  3. تحضير الوسائط YPD سائل معقم (1% "استخراج الخميرة"، ببتون 2%، 2% جلوكوز) بخلط المكونات في زجاجة والتعقيم.
  4. خطة تخطيط قوارير في الحاضنة.
    ملاحظة: من خزان2 N، ستكون قارورة أول فخ مياه، قارورة الثانية ستكون النقطة المرة الأخيرة، قارورة الثالثة سوف تكون النقطة المرة الثانية والأخيرة وهلم جرا حتى قارورة الأخير الذي فخ مياه نهائية. ويبين الشكل 1 بالترتيب واتصالات بين قوارير.
  5. في اليوم السابق أثناء الوقت، تطعيم مستعمرة خميرة إلى ثقافة 5 مل سائل YPD داخل أنبوب اختبار عقيمة. على وجه التحديد، تلتقط مستعمرة كاملة من لوحة باستخدام عصا قضيب عقيمة. ضع العصا في YPD السائلة ويهز العصا حتى معظم الخلايا في التعليق.
  6. تدوير أنابيب عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها (ح ~ 16).
    ملاحظة: بعد ح 16، ستحقق الخلايا wildtype تشبع (~ 2 × 108 خلايا/مل)، وأشارت إلى قيام ثقافة غائم جداً. قد يستغرق وقتاً أطول للوصول إلى التشبع السلالات الأخرى وينبغي اختبار قياس تركيز الخلية مع جهاز المطياف الضوئي، كما هو مبين في الخطوة 1.9.4.
  7. اليوم بالطبع الوقت، بعد ح 16 من الحضانة، تضعف ثقافة مشبعة 01:50 باستخدام بيبيت 5 مل إلى 4 مل من مكان بين عشية وضحاها الثقافة إلى 196 مل من السائل YPD داخل قارورة معقمة 500 مل. تنمو مع الهز ~ 200 لفة في الدقيقة ح 4 في 30 درجة مئوية.
    ملاحظة: بعد ح 4، سيصل إلى ثقافة wildtype تركيز سجل منتصف ~ 1-2 × 107 خلايا/مل.
  8. أثناء الاحتضان ح 4، تسمية قوارير (لنقص المياه والفخاخ) و 50 مل أنابيب جمع. إذا لم يتم استخدام الحاضنة في الخطوة 1، 7 أعلاه لنقص الوقت بالطبع، تشغيل حاضنة أخرى وتعيين إلى 30 درجة مئوية.
  9. قبل تعريض الخلايا لنقص:
    1. إضافة ~ 50 مل من الماء إلى اثنين من قوارير 250 مل العقيمة التي ستكون بمثابة الفخاخ المياه.
    2. تعبئة 1/3 من الثلج دلو مع النتروجين السائل وتغرق رف رغوة البوليسترين بعقد أنابيب الطرد المركزي 50 مل.
    3. إعداد عامل تصفية نظام جمع الخلايا. إضافة قرص تصفية عقيمة على وحدة السفلي منظومة الترشيح باستخدام ملاقط معقمة، مع الحرص على إلا تلمس حواف القرص عامل التصفية. وضع تصفية أعلى وحدة على وحدة أسفل تصفية وقدمت آمنة مع المشابك مع النظام. تأكد من محاذاة وحدات السفلي والعلوي حيث لا يوجد أي تسرب وختم ضيق.
    4. قياس تركيز الخلية مع جهاز المطياف الضوئي. تمييع الخلايا حيث أن ما يمكن أن يقاس في نطاق الخطية من جهاز المطياف الضوئي – OD600 بين ~0.2-0.6، اعتماداً جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: التطوير التنظيمي من600 وحدة هو ~ 3 × 107 خلايا مليلتر، اعتماداً على مورفولوجيا الخلايا وجهاز المطياف الضوئي. ومن المتوقع بتركيز ~ 1-2 × 107 خلايا/مل، المقابلة ل التطوير التنظيمي600 من ~0.33-0.66.
    5. الحصول بسرعة على نموذج الوقت 0.
      1. قم بتوصيل نظام تصفية فراغ قوي (~ 10 [مبر]) عبر أنابيب الشفط وفخ قارورة مل 1,000. بدوره على الفراغ. من أجل الثقافة (عادة ~ 20 مل) إلى أعلى وحدة والانتظار للسائل ليتم سحبها من خلال عامل التصفية (~ 10 ق، تبعاً لقوة الفراغ).
      2. بعناية إزالة القرص عامل التصفية مع ملاقط نظيفة ووضع في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي. فورا وضع أنبوب الطرد المركزي في الرف مغمورة في سائل النيتروجين. الأهم من ذلك، لا قبل البرد الأنابيب قبل إدراج عامل التصفية كما سوف تنفجر الأنابيب.
      3. بعد > 30 ثانية، مكان الأنبوبة في ثلاجة-80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي لاحقاً. بعد كل الترشيح، وتنظيف وإعادة تجميع النظام عامل تصفية. شطف النظام عن طريق سحب المياه من خلال 10 ق دون قرص عامل تصفية. وأخيراً، يمسح الجافة النظام مع منشفة ورقية.
    6. تمييع ثقافة ح 4 في قوارير مختلفة لمختلف النقاط الزمنية، حيث أن كل قارورة يصل إلى تركيز سجل منتصف (~ 1-2 × 107 خلايا/مل) في النقطة الزمنية المشار إليها من نقص.
      ملاحظة: يبين الجدول 1 تخفيف التي استخدمت للضغط فرداني البرية من نوع S288C HAP1+ . من المستحسن اختبار كل سلالة في هذه الظروف الثقافة التاكسج وضبط تخفيف تبعاً لذلك.
    7. حالما تتم إضافة الخلايا ووسائل الإعلام إلى قوارير، استبدال رقائق الألومنيوم تغطي قارورة فتح مع سداده الذي يحتوي على اثنين من أنابيب زجاجية إدراجها.
    8. مكان في قوارير في الحاضنة في تخطيط قرر في وقت سابق.
    9. الاتصال بشكل أمن الأنبوب كما هو مبين في الشكل 1.
    10. التحقق من أن جميع السدادات يتم الضغط محكم في فتحات قارورة.
  10. في الساعة 0، فتح صمام منظم. قم بتعيين مقياس تدفق إلى 3 لتر في الدقيقة.
    ملاحظة: محتدما سيتبع في قوارير الماء على حد سواء، مما يشير إلى تدفق الغاز المناسب. إذا كان هذا ليس هو الحال، تحقق من أن جميع السدادات ضيقة وأنابيب موصولة بشكل صحيح.
  11. إغلاق الحاضنة وتعيين سرعة الهز إلى ~ 200 لفة في الدقيقة. بدء تشغيل جهاز ضبط وقت.
  12. قبل كل نقطة الوقت، إعداد نظام التصفية كما وصف أعلاه في الخطوة 1.9.3.
  13. في كل مرة نقطة (مثلاً، 5 دقائق، 10 دقيقة، إلخ)، وقد شخصين بسرعة عملية الخلايا كما يلي:
    1. الشخص الأول: إزالة قارورة المناسبة من صاحب وإخراج السدادة (مع أنابيب الزجاج المرفقة).
      ملاحظة: هذا لن كسر تدفق ن2 لأي من قوارير الثقافة المتبقية ولكن مؤقتاً كسر التدفق إلى فخ المياه الأخير.
    2. الشخص الثاني: بيبيت 1 مل ثقافة والاستغناء عن في ومبومو. إعادة توصيل الأنابيب من قارورة الثقافة التي الآن في نهاية السطر الأخير مصيدة المياه (أنبوب واحد وإرادة واحدة سداده إزالتها في العملية).. ثم قياس تركيز الخلية في ومبومو، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.9.4.
    3. أول شخص: صب ما تبقى الثقافة في نظام الترشيح فراغ، ثم قم بإجراء التصفية والتجميد كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.9.5.
  14. عند الانتهاء من جميع النقاط الزمنية، إيقاف الغاز2 ن. قم أولاً بإغلاق الجهة المنظمة والانتظار للضغط من أجل إطلاق سراح ثم إيقاف تدفق متر. وأخيراً، تفكيك النظام وتنظيف جميع المواد مع الماء ومن ثم الإيثانول 70%.

2. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. إعداد المخزن المؤقت RLT لتنقية الحمض النووي الريبي العمود، كما هو موضح في الجدول المواد.
  2. يعد إيجاد حل عملي من الدناز بإضافة 10 ميليلتر من الحل الدناز الأسهم إلى 70 ميليلتر من المخزن المؤقت هي كل عينة (انظر الجدول المواد).
  3. إزالة أنابيب 50 مل يحتوي على خلايا من الثلاجة-80 درجة مئوية وعوامل التصفية ووضع على الجليد الذوبان (~ 15 دقيقة). نفذ الخطوات التالية مع أنابيب على الجليد.
  4. قم بتسمية 2 مل أنابيب ملولبة ووضعها على الجليد، وأنبوب واحد لكل عينة. إضافة مل ~0.6 من حمض تغسل حبات لكل أنبوبة، باستخدام أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لحلج القطن وقياس الخرز.
  5. إضافة 0.6 مل من البرد RLT العازلة للأنابيب 50 مل.
  6. بيبيت صعودا وهبوطاً لإزالة خلايا من تصفية وتعليق إلى الحل. تجنب ترك عامل التصفية تظل في الحل كعامل التصفية سوف أشعة الحل. إزالة كل حل استيعابهم في عامل التصفية باستخدام تلميح بيبيت للضغط على عامل التصفية ضد جدار الأنبوبة.
  7. نقل كل من السائل من أنبوب 50 مل إلى أنابيب ملولبة المحتوية على خرز.
  8. وضع أنابيب ملولبة في الخالطون طاحونة حبة وتشغيلها لمدة دقيقة واحدة.
    فورا بوضع الأنابيب على الجليد لمدة ثلاث دقائق. مرة أخرى، وضع الأنابيب في الخالطون وتشغيل لمدة دقيقة واحدة.
  9. إزالة الأنابيب من الخالطون ومكان على الجليد لمدة 5 دقائق. وسوف تستقر الخرز إلى الجزء السفلي من الأنابيب.
  10. تنفيذ ما تبقى الخطوات في درجة حرارة الغرفة.
  11. مع بيبيت، نقل فقط ليستي (~ 350 ميليلتر)، تجنب الخرز، لأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة.
  12. ميكروسينتريفوجي لمدة 2 دقيقة في أقصى سرعة ونقل ثم المادة طافية على أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة.
  13. إضافة إلى حجم 1 من الإيثانول 70% (مصنوعة من 200 دليل على البيولوجيا الجزيئية-الصف الإيثانول). مزيج جيد من قبل بيبيتينج.
  14. نقل الحل وأي اندفاع إلى عمود الحمض النووي الريبي التي وضعت داخل أنبوب جمع 2 مل.
  15. الطرد المركزي 15 s في إيه وان تو، 000 x ز وتجاهل التدفق من خلال (السائل في الأنبوب).
  16. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت RW1 للعمود. أجهزة الطرد المركزي 15 s في إيه وان تو، 000 x ز وتجاهل التدفق من خلال.
  17. إضافة ميليلتر 80 الدناز أنا مزيج الحضانة للغشاء العمود (لا تحصل على جانبي الأنبوب) والسماح للجلوس لمدة 15 دقيقة.
  18. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت RW1 للعمود. ميكروسينتريفوجي 15 s في إيه وان تو، 000 x ز وتجاهل التدفق من خلال.
  19. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت RPE إلى العمود. ميكروسينتريفوجي 15 ثانية في إيه وان تو، 000 x ز وتجاهل التدفق من خلال.
  20. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت RPE إلى العمود. ميكروسينتريفوجي لمدة 2 دقيقة في إيه وان تو، 000 x ز.
  21. إزالة العمود ووضع في أنبوب جمع 2 مل جديدة بعناية. ميكروسينتريفوجي بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة (لتجف تماما الغشاء).
  22. تجاهل أنبوب جمع ووضع العمود في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. إضافة 30 ميليلتر من المياه خالية من رناسي للغشاء العمود.
  23. الوت الجيش الملكي النيبالي من العمود قبل ميكروسينتريفوجينج لمدة 1 دقيقة في إيه وان تو، 000 x ز. عند تحميل الأعمدة إلى ميكروسينتريفوجي، تأكد من الأغطية لأنبوب جمع تواجه في اتجاه يدور أجهزة الطرد المركزي، لمنع قطع الأغطية.
  24. إضافة ميليلتر 30 أخرى من المياه خالية من رناسي للغشاء العمود، مع إبقاء العمود في أنبوب ميكروسينتريفوجي نفسه.
  25. ميكروسينتريفوجي لمدة 1 دقيقة في إيه وان تو، 000 x ز، حيث يكون حجم النذرة النهائي 60 ميليلتر.
  26. تخزين كل أنبوبة 1.5 مل تحتوي على 60 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي في الثلاجة-80 درجة مئوية.

3-تحديد تركيز الحمض النووي الريبي والجودة

  1. قياس تركيز الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي في كل عينة من الحمض النووي الريبي، باستخدام فلوروميتير (أ)، (ب) الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي على حدة الفلورية الأصباغ وأنابيب (ج) المقايسة، كما هو موضح في الجدول المواد. اتبع الإرشادات في فلوروميتير وفي الأصباغ.
  2. وبدلاً من ذلك، قياس تركيز الحمض النووي مع جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية مبلغ 260 نيوتن متر.
    ملاحظة: أن قراءة260 ألف من 1.0 يكافئ ~ 40 ميكروغرام/مل واحد-الذين تقطعت بهم السبل الجيش الملكي النيبالي.
  3. اختبار نوعية الجيش الملكي النيبالي بتشغيل الجيش الملكي النيبالي هو محلل حمض النووي تجاري (انظر الجدول المواد) أو على فورمالدهايد قياسية/[اغروس] هلام 26.

4-الجيش الملكي النيبالي-seq التحليل

  1. من مجموع رصيد الجيش الملكي النيبالي، يشكلون 21 ميليلتر من 100 نانوغرام/ميليلتر الجيش الملكي النيبالي في المياه خالية من رناسي. استخدم 1 ميليلتر من هذا ميليلتر 21 لاختبار تركيز الحمض النووي الريبي المذكورة أعلاه. يقدم المتبقية 20 ميليلتر (2 ميكروغرام) مجموع الجيش الملكي النيبالي مركز تسلسل خارجي لإثراء مرناً، وإعداد مكتبة حبلا على حدة (مع الرموز الشريطية ثمانية أو أكثر للإرسال المتعدد)، والتسلسل (انظر الجدول المواد). وبدلاً من ذلك، محلياً إجراء تخصيب مرناً وإعداد مكتبة، وثم تقدم المكتبة للتسلسل.
  2. تجمع ثمانية أو أكثر من عينات متعدد والتسلسل في حارة واحدة من المنظم الجيل القادم.
  3. تحميل الملف فاستق الذي يحتوي على كل من يقرأ التسلسل ويقرأ الفهرس المطابق. كما أن تحميل الملف النصي الذي يحتوي على الرموز الشريطية تعدد الإرسال.
    ملاحظة: قد تكون موجودة في ملف منفصل فستق يقرأ الفهرس. وضع كل من هذه الملفات في دليل واحد.
  4. ضع شيل المقدمة هنا، "fastq_pipeline.sh"، في نفس الدليل. تحرير البرنامج النصي هذا حسب الاقتضاء للتجربة والدلائل الكمبيوتر.
    ملاحظة: هذا البرنامج النصي يحتوي على شروح مستفيضة شرح الخطوات. وباختصار، نوعية البرنامج النصي الديكورات على ما يلي، والخرائط على ما يلي للجينوم، وينشئ ملف المفصول الذي يحتوي على عدد يقرأ كل الجينات لكل عينة.
  5. إيداع الملفات فستق والبيانات الخام عدد مرات القراءة في "الجامع التعبير الجيني" في نكبي قبل نشر 27. اتبع الإرشادات التي تظهر في "تقديم تسلسل الفائق لبيانات توقعات البيئة العالمية": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. استيراد بيانات عدد مرات القراءة في البيئة الإحصائية في البحث والتطوير وإجراء التحليل الإحصائي، باستخدام البرنامج النصي ص المقدمة هنا، "time_course_script. R ". تحرير البرنامج النصي هذا حسب الاقتضاء للتجربة والدلائل الكمبيوتر.
    ملاحظة: هذا البرنامج النصي يحتوي على شروح مستفيضة شرح الخطوات. باختصار، هذا البرنامج النصي استيراد البيانات القراءة، وطبيعتها على ما يلي، يحدد الجينات التي تغير بشكل ملحوظ خلال الوقت، ويقوم بتحليل محكمة التحكيم الدائمة، والرسوم البيانية الجينات المحددة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نقص وقت الدورة وتحليل الحمض النووي الريبي seq أجريت ثلاث مرات بشكل مستقل. للنظر في إمكانية تكرار نتائج replicates الثلاثة، وقد تم تحليل البيانات التعبير الجيني لجينات كل استخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA). ويبين الشكل 2 كيفية تغيير العينات على المكونات الرئيسية الأولى والثانية، التي تمثل مجتمعة 58.9 في المائة التغير. وأشار هذا التحليل إلى أن يسلك كل دورة الوقت تغيرات مماثلة (كما يصور بشكل مماثل لكل منحنى). وباﻹضافة إلى ذلك، replicates الأخيرين كانت أكثر شب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة، وتم قياس مستويات مرناً لجميع الجينات أثناء نقص في الخميرة S. cerevisiae. وكان الهدف تحليل التغيرات التعبير الجيني العالمي نتيجة للنمو في بيئة تسيطر عليها قرب وصول. اتخذت عدة خطوات لضمان أن الطريقة الموصوفة هنا التي تسيطر عليها بعناية واستنساخه. أولاً، تعرض الخلايا لبيئة التاكسج محددة بدقة: 99.999% N2 في الوسائط الغنية (YPD). وقد أغلقت قارورة أو أنبوب الهواء 32دراسات أخرى من نقص، يستخدم كلوريد الكوبالت نقص mimetic 33أو يعمل يحفز نقص اللاهو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونشكر المعهد لويس Sigler "تسلسل الجينوم التكاملية الأساسية مرفق" في جامعة برينستون للمشورة التقنية وإعداد مكتبة الجيش الملكي النيبالي وتسلسلها. كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من جامعة روان، والمعاهد الوطنية للصحة نيجمس R15GM113187 إلى M.J.H.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حاضنة جافة مغلقةThermo ScientificMaxQ 4000عند 30 درجة مئوية قم بتعديل الباب للسماح بدخول أنبوب Tygon واحد. بدلا من ذلك ، استخدم حاضنة New Brunswick G25 ، التي تحتوي على منفذ أنبوبي. لا تستخدم شاكر الماء في الهواء الطلق ، حيث سيتجمع التكثيف في الأنابيب بين القوارير ، وربما تلوث الثقافات المتبادلة.
حامل مرشح التحليل الدقيقMilliporeXX1002530قطر 25 مم ، دعم من الفولاذ المقاوم للصدأ ، رقم 5 حوامل سدادة سيليكون مثقبة في قارورة ترشيح قياسية 125 مل
فراغ قويEdwardsE-LAB 2" منزل" قد يكون الفراغ ضعيفا جدا. بدلا من ذلك ، استخدم مضخة تفريغ محمولة تعمل بالطاقة الكهربائية مثل تلك المدرجة هنا.
1,000 مللتكون بمثابة مصيدة فراغ.
~ 2 قدم أطوال من أنابيب فراغ الجدار الثقيل ، القطر الداخلي 3/8 بوصة ، القطر الخارجي 7/8 فيTygon38TTقطعتان: الأولى تربط الفراغ بالمصيدة ، والثانية تربط المصيدة بنظام التصفية.
عالي الضغط N2< / sub>نقاء 99.999٪ ، >1,000 رطل لكل بوصة مربعة ، مع منظم ووحدة تحكم في تدفق الغاز
قارورةفتحة مغطاة بورق الألمنيوم. واحد لكل سلالة خميرة.
معقمة 250 ملفتحات مغطاة بورق الألمنيوم. واحد لكل نقطة زمنية بالإضافة إلى اثنين لمصائد المياه.
سدادات قارورة (مقاس 6 ، فتحتان بقطر 5 مم)معقمة بنسبة 70٪ إيثانول. واحد لكل قارورة.
أنابيب زجاجية ، طولها 9 سم أو 17 سم ، القطر الداخلي 2 مم ، القطر الخارجي 5 مممعقمة بنسبة 70٪ إيثانول. أنبوبان لكل قارورة. ضعها في ثقوب كل سدادة. انظر الشكل 1 لوضع الأنابيب 9 مقابل 17 سم.
~ 25 سم أطوال الأنابيب البلاستيكية ، القطر الداخلي 5 ممTygonE-3603قطعة واحدة لكل قارورة. معقم ب 70٪ إيثانول.
أقراص فلتر معقمةMilliporeHAWP02500قطر 25 مم ، 0.45 وميكرو ؛ م حجم المسام ، واحد لكل نقطة زمنية
معقم dH 2< / sub>O (~ 100 مل) 1
مل كوفيتلقياس OD600 (أي تركيز الخلية)
50 مل أنابيبواحدة لكل نقطة زمنية
ملاقط
نيتروجينلتجميد الخلايا
حبات مغسولة بالحمضSigmaG8772تحافظ على 4 درجات ؛ C لخلايا التحليل
Qiagen RNeasy Mini KitQiagen74104لتنقية عمود الحمض النووي
Qiagen RLT المخزن المؤقتالاستعداد بإضافة 10 & micro ؛ لتر من & بيتا ؛ ميركابتو إيثانول لكل 1 مل من المخزن المؤقت RLT ، احتفظ به عند 4 درجات مئوية.
أنابيب تجميع 2 ملQiagenالمضمنة في Qiagen Mini Kit
Buffer RPEQiagenالمضمنة في Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1Qiagenالمضمنة في مخزون Qiagen Rneasy Mini
DNase I وحلول العملQiagen79254يأتي إنزيم DNase I على شكل مسحوق مجفف بالتجميد في قارورة زجاجية. باستخدام إبرة معقمة وحقنة ، حقن 550 & L من الماء الخالي من RNase (متوفر في مجموعة Qiagen) في القارورة. امزج عن طريق قلب الزجاجة برفق. لتجنب تغيير طبيعة الإنزيم ، لا تدوام. باستخدام ماصة ، قم بإزالة محلول المرق هذا من القارورة وتخزينه في الفريزر (-20 درجة ؛ ج) في الحصص ذات الاستخدام الواحد (80 وميكرو ؛ L لكل منهما). لا ينبغي إذابة محلول المخزون وإعادة تجميده.
المخزن المؤقت RDDQiagenالمتضمن في Qiagen DNase Kit
أنابيب الغطاءلتحلل الخلايا أثناء استخراج الحمض النووي
مطحنة الخرزةBiospec Mini-Beadbeater-24112011يحفظ في غرفة باردة
Bacto PeptoneBDDF0118لوسائط YPD السائلة
مستخلص الخميرة باكتوBDDF0886للسائل YPD وسائل
الإعلام الجلوكوزفيشرD16لوسائل الإعلام السائلة YPD
أنابيب فحص QubitThermo FisherQ32856لقياس تركيز الحمض النووي
Quant-iTTM dsDNA BR Assay KitThermo FisherQ32853لقياس تركيز الحمض
Quant-iTTM RNA Assay KitThermo FisherQ32855لقياس تركيز الحمض
الفلور الكيوبيتثيرمو فيشرQ33216لقياس تركيز الحمض النووي
نظام الرحلان الكهربائي التجاريالمحللالحيوي Agilent Bioanalyzer 2100لقياس جودة الحمض
النووي الجيل التالي من جهاز التسلسلIlluminaHiSeq 2500لمكتبات التسلسل
معالجة السوائل الآليWafergenApollo 324لإنشاء مكتبات التسلسل
PrepX PolyA mRNA IsolationWafergen400047لعزل mRNA من إجمالي الحمض النووي
PrepX RNA SEQ ل Illumina Library KitWafergen400039لإنشاء مكتبات تسلسل خاصة بالخيوط من إجمالي RNA
Barcode Splitterhttps://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools ، والذي يتضمن الأمرhttp://www.htslib.org/download/
Trimmomatichttp://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (مثبت قبل TopHat)http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHathttps://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeqhttp://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (مثبت قبل R Studio)https://cran.rstudio.com
R Studio (إصدار مجاني)https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
قارورة خزان غاز معقمة 500 مل قوارير طرد مركزي معقمة نظيفة ومعقمة سائل الريبي Kit اللولبي البارد 2 مل الريبي النووي النووي مقياس نظام Kit الريبي gzip

المراجع

  1. Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
  2. Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
  3. Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
  4. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  5. Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
  6. Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
  7. Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
  8. Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
  9. Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
  10. Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
  11. Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
  12. Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).
  13. Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
  14. Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
  15. Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).
  16. Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
  17. Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
  18. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
  19. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106(2010).
  20. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13(2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  23. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
  24. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from: https://www.R-project.org (2015).
  25. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  26. Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
  27. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
  28. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
  29. Hothorn, T., Everitt, B. S. A Handbook of Statistical Analyses using R. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).
  30. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  31. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  32. Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).
  33. Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
  34. Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
  35. Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).
  36. Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
  37. Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
  38. Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).
  39. Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الاستجابة لنقص الأكسجة في الخميرةقياس مستوى mRNAتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq)تجربة السلسلة الزمنيةنقص الأكسجة بغاز النيتروجيناستخلاص الحمض النووي الريبي الكلي (Total RNA)تحويل cDNAإنشاء مكتبة متعددةتسلسل الجيل القادمتحليل DESeq2
قياس مستويات مرناً على مر الزمن من خلال "الاستجابة" الخميرة التاكسج S. cerevisiae
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.