يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات

6.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56239

⸱

نوفمبر 5, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Membrane Biology, University of California School of Medicine, Davis

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة بروتوكول للكشف عن واحد أو أكثر من البلازما أو بروتينات الغشاء داخل الخلايا باستخدام مجهرية فائقة القرار استنزاف الدولة الأرض (GSD) في خلايا الثدييات. وهنا، نحن نناقش المنافع والاعتبارات المتعلقة باستخدام هذه النهج للتصور والتقدير الكمي للبروتينات الخلوية.

الملخص

التقدم في علم الأحياء المجهري وخلية الفلورسنت ارتباطاً وثيقا، مع تعزيز القدرة على تصور الأحداث الخلوية التي غالباً ما تؤدي إلى قفزات هائلة في فهمنا لكيفية الخلايا الدالة. تطوير وتوافر مجهرية فائقة القرار وسعت إلى حد كبير حدود الدقة البصرية من ~ 250--20 نانومتر. علماء الأحياء لم تعد تقتصر على وصف التفاعلات الجزيئية من حيث كولوكاليزيشن ضمن منطقة حيود محدودة، بل من الممكن الآن لتصور التفاعلات الدينامية للجزيئات الفردية. هنا، فإننا مخطط بروتوكول للتصور والتقدير الكمي للبروتينات الخلوية باستنزاف الأرض-دولة مجهرية لتصوير الخلية الثابتة. نحن نقدم أمثلة من بروتينات الغشاء مختلفة اثنين، وعنصر ترانسلوكون هيولى، sec61β، والمترجمة بغشاء البلازما عن طريق بوابة الجهد Ca L من نوع2 + قناة (CaV1.2). وناقش مجهر محددة المعالم، أساليب التثبيت، وتبديل الصورة وضع المخزن المؤقت، والمزالق والتحديات لمعالجة الصور.

المقدمة

ترجمة ردود فعل الإشارات الخلوية تغير البيئات الداخلية والخارجية لبدء استجابة خلوية. أنها تنظم جميع جوانب الفسيولوجيا البشرية، كأساس لهرمون وناقل عصبي الإفراج عن نبضات القلب، الرؤية، التسميد، والوظائف المعرفية. يمكن تعطيل هذه الشلالات مما يشير إلى عواقب وخيمة في شكل الظروف الفيزيولوجية المرضية بما في ذلك السرطان، باركنسون، ومرض الزهايمر. على مدى عقود، المحققين البيولوجية والطبية استخدمت بنجاح البروتينات الفلورية والمجسات وأجهزة استشعار العوامل البيولوجية مقترنة بالفحص المجهري الأسفار كأدوات أساسية لفهم المنظمة المكانية والزمانية الدقيقة لهذه الخلايا الإشارات.

نقاط قوة التقنيات البصرية مثل ابيفلوريسسينسي، [كنفوكل]، أو انعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية من حساسية، والسرعة، والتوافق مع التصوير خلية حية، في حين أن القيد الرئيسي بهم لا يمكن حل القرار حيود محدودة، وهياكل معنى أو مجمعات البروتين أقل من 200-250 نيوتن متر. مع التطور النظري والعملي للقرار فائقة القطعية (مثلاً، حفز الانبعاثات استنفاد مجهرية (STED1)، منظم إضاءة مجهرية (سيم2) أو العشوائية دقة فائقة (مثلاً ، فوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل3)، أو أرض الدولة نضوب (جيرمن شيبرد4،5))، تم تمديد القرار الأفقي ومحوري في الفحص المجهري الأسفار خارج الحاجز الحيود، بأمر من عشرات نانومتر. وهكذا، أن المحققين لديهم الآن لا مثيل لها القدرة على تصور وفهم كيف يترجم ديناميات البروتين والمنظمة لوظيفة على المستوى الجزيئي بالقرب.

أرض الدولة نضوب مجهرية متبوعاً بالعودة الفردية جزيء (جسديم)، أو ببساطة الديمقراطيين الاشتراكيين كما هو معروف، تلتف الحد حيود بتخفيض العدد من انبعاث فلوروفوريس4،5في وقت واحد. ويستخدم ضوء الليزر ذات الطاقة العالية لتثير عينة المسمى فلوروفوري، قصف الإلكترونات مع الفوتونات وزيادة احتمال أنهم سوف يخضع 'تدور الوجه' وأدخل الثلاثي أو 'الظلام--الدولة' من الدولة متحمس4. وهذا يستنزف فعالية الدولة الأرض، ومن ثم الاسم 'البري استنزاف الدولة'. في حالة الثلاثي، فلوروفوريس لا تنبعث الفوتونات والعينة تظهر باهتة. ومع ذلك، هذه فلوروفوريس ستوتشاستيكالي العودة إلى أرض الدولة ويمكن أن تذهب من خلال عدة فوتون انبعاث انتقالات الحالة متحمس للأرض قبل أن تعود إلى الدولة الثلاثي. مع أقل تلويثاً فلوروفوريس في أي وقت من الأوقات، ينبعث فوتون رشقات نارية من fluorophores الفردية تصبح متميزة مكانياً وزمنياً من المجاورة فلوروفوريس. يمكن احتواء انفجار الفوتونات مع وظيفة غاوسي، centroid المحسوب الذي يتوافق مع موقف فلوروفوري مع دقة ترجمة التي تعتمد على (غ) الفتحة العددية للعدسة، والطول الموجي للضوء المستخدم الإثارة، ومن الأهمية بمكان عدد الفوتونات المنبعثة لكل فلوروفوري. واحد الحد من الديمقراطيين الاشتراكيين أنه، نظراً لمجموعة فرعية فقط من فلوروفوريس بنشاط تنبعث منه في أي وقت، يجب جمع آلاف صور خلال عدة دقائق لبناء خريطة كاملة تعريب. الوقت اكتساب طويلة جنبا إلى جنب مع اشتراط ليزر عالية الطاقة، يعني أن الديمقراطيين الاشتراكيين أكثر ملاءمة لثابت بدلاً من عينات حية.

توضح هذه المقالة، إعداد العينات الثابتة لتصوير مجهرية فائقة القرار بغشاء هيولى (ER)-البروتينات المقيم (للحصول على قائمة من المواد الاستهلاكية الضرورية والمواد الكاشفة انظر الجدول للمواد). أمثلة لكيفية هذا البروتوكول يمكن بسهولة تكييفها لقياس حجم ودرجة تجميع لتر من نوع الجهد-قنوات عن طريق بوابة Ca2 + (Cav1.2) في ساركوليما myocytes القلب، أو المستخدمة لتصور توزيع الخلوية للائحة، وأظهرت. فهم توزيع وتنظيم هذه المكونات الخلوية من الأهمية بمكان فهم الشروع، والترجمة، وفي نهاية المطاف الدالة من كاليفورنيا العديد من2 +-تعتمد الشلالات إرسال الإشارات. على سبيل المثال، Cav1.2 القنوات ذات أهمية أساسية للإثارة-تقلص اقتران, بينما ربما بوساطة مستقبلات Ca2 + الإصدار لائحة تتالي إرسال الإشارات في كل مكان آخر في خلايا الثدييات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-"غسل الزجاج كوفيرسليبس"

  1. قبل تجهيز عينة، اليوم تنظيف الزجاج #1.5 كوفيرسليبس سونيكاتينج في حل م 1 من كوه ح 1. يؤدي هذا إلى إزالة أي ملوثات الفلورسنت التي قد تكون موجودة في كوفيرسليبس.
    1. جيدا شطف كوه من كوفيرسليبس مع الماء المتأين دي-
    2. بعد تنظيفها في كوه، تخزين كوفيرسليبس في الإيثانول 70% حتى جاهزة للاستخدام-

2. طلاء "الزجاج كوفيرسليبس"

ملاحظة: ينبغي إجراء الخطوات المذكورة في هذا المقطع في غطاء ثقافة خلية لمنع التلوث.

استخدام الملقط لإزالة ساترة فردية من الحل الإيثانول 70%
  1. وسرعة اللهب لإزالة الزائدة. مكان كوفيرسليبس في لوحة 6-جيدا. إذا المشتعلة في غطاء ثقافة ليس خياراً، تنظر في التعقيم كوفيرسليبس بعد الشطف بالماء المتأين إزالة و/أو التعقيم تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في هود الثقافة لمالا يقل عن 30 دقيقة
  2. لمساعدة التصاق الخلايا، معطف كوفيرسليبس مع العقيمة 0.01 ٪ بولي-L-يسين ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
  3. نضح بولي-L-يسين وشطف كوفيرسليبس مع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS). الهواء الجاف، وتضع في الثلاجة بين عشية وضحاها.
  4. في صباح اليوم التالي، إزالة كوفيرسليبس من الثلاجة وإضافة 300 ميليلتر من لامينين، بتركيز 50 ميكروغرام/مل، لمالا يقل عن 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضمان أن لامينين يوضع بعناية مباشرة على ساترة-
    ملاحظة: هذه الخطوة laminin ليس ضروريا كوس-7 الخلايا أو الخلايا HEK293 غير مطلوب من أجل myocytes البطين المعزولة. الخلايا الأولية الأخرى مثل خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية أو الخلايا العصبية قد تنضم أفضل للكولاجين أو فيبرونيكتين المغلفة كوفيرسليبس.

3. إعداد الخلايا

    1. من الخلايا المستزرعة تنمو كوس-7 خلايا (أو خط الخلية المفضل) على طبق ثقافة 10 سم في 10 مل دولبيكو ' s تعديل النسور المتوسطة (دميم) الثقافة المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، و 1% البنسلين/ستربتوميسين (PS) الحل. تنمو الخلايا في حاضنة ثقافة خلية في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
    2. عندما تصل الخلايا إلى 90% كونفلوينسي، حصادها من طبق 10 سم يسفط وسائط الإعلام دميم وإضافة 5 مل محلول التربسين-عطا 0.05%. حالما تبدأ الخلايا التقريب وفصل، تحييد فورا التربسين مع دميم المكملة.
      1. 5 مل استخدام ماصة المصلية لإزالة الخلايا من الطبق. "الماصة؛" المتوسط ضد قاعدة للطبق عدة مرات لإزالة أي الخلايا التي تظل ملتصقة وتوزيع الخلايا في جميع أنحاء المتوسط الثقافة المتجانسة.
    3. لوحة الخلايا على أطباق الثقافة 35 ملم لتحقيق كونفلوينسي 70% تعداء. جعل حجم متوسطة في الطبق يصل إلى 2 مل مع الطازجة دميم/FBS/PS الحل.
      4. ثوابت
    4. الخلايا ترانسفيكت كوس-7 مع بلازميد المطلوب الحمض النووي (مثلاً، sec61β-مشري بلازميد)، باستخدام كاشف تعداء مناسبة ووفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s.
      ملاحظة: قد تستغرق 24-48 ح للبروتين للتعبير، اعتماداً بلازميد و/أو استخدام الكاشف تعداء.
  2. ميوسيتيس البطين الماوس الكبار
    1. عزل myocytes البطين الماوس الكبار باستخدام أسلوب من نضح لانجيندورف راسخة 6. إعادة تعليق بيليه الناتجة من ميوسيتيس في المتوسط 199 (M199) وتستكمل مع 2.5% FBS و 1% س.

4. طلاء الخلايا

    1. من الخلايا Transfected كوس-7 نضح 2 مل الحل دميم/FBS/PS من طبق 35 ملم وإضافة 1 مل Ca 2 +-مجاناً برنامج تلفزيوني. العودة الطبق إلى حاضنة للحد الأدنى 2 الخلايا الحصاد من الطبق بأول يسفط Ca 2 +-مجاناً برنامج تلفزيوني ومن ثم إضافة 1 مل من محلول التربسين-عطا 0.05%.
      1. مرة واحدة تبدأ الخلايا حتى الجولة وفصلها، وتحييد التربسين مع 1 مل دميم تستكمل فورا. "الماصة؛" بلطف صعودا وهبوطاً عدة مرات لضمان transfected الخلايا هي موزعة بالتساوي في جميع أنحاء تعليق 2 مل التربسين-عطا-دميم.
    2. لوحة transfected الخلايا كوس-7 على كوفيرسليبس بولي-L-يسين المغلفة كثافة مناسبة حيث أن خلايا مفردة يمكن تصور، وملء حجم صحن يصل إلى 2 مل مع دميم/FBS/PS (مثلاً، إضافة تعليق خلية ميليلتر 90 إلى ساترة ثم إضافة تكملة ميليلتر 1,910 دميم، ودوامه طبق لتوزيع الخلايا بالتساوي).
      ملاحظة: الخلايا لا تحتاج لحسابها ولكن ستختلف حجم الخلايا المراد إضافتها إلى كل طبق كونفلوينسي الخلايا.
    3. عودة مطلي الخلايا إلى حاضنة الثقافة الخلية بين عشية وضحاها للسماح للخلايا للتقيد واسترداد.
  2. ميوسيتيس البطين الماوس الكبار
    1. اعقلوها myocytes laminin ولوحة مباشرة على كوفيرسليبس المغلفة كثافة مناسبة حيث أنه يمكن تصور الخلايا الفردية. وهذا يعتمد على كثافة خلايا قابلة للحياة التي تم الحصول عليها من العزلة.
    2. التوازن بين تعليق خلية في قبة ساترة ومكان في حاضنة ثقافة خلية في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 ~ 45 دقيقة للسماح بانضمام-

5. تثبيت خلايا

  1. إزالة خلايا من الحاضنة ونضح بدقة المتوسطة.
    1. شطف الخلايا ملتصقة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
      2. إصلاح الخلايا مع مثبت الأمثل للتطبيقات الفردية والأجسام المضادة
    2. .
      ملاحظة: هو معيار مهم لأن نأخذ في الاعتبار عند اختيار مثبت الحفاظ على البنية الخلوية للعينة، بينما تكفل أيضا أنه لم يحدث أي تغيير كونفورماشونال في antigen للفائدة. لأغراض هذا البروتوكول التثبيت مع 3% paraformaldehyde/0.1% جلوتارالديهيدي (PFA/GA) والتثبيت مع 100 ٪ الميثانول هو ناقش.
  2. التثبيت PFA/GA transfected كوس-7 خلايا معربا عن Sec61β-مشري
    1. مزيج 1.9 مل 16% 20 GA 50% ميليلتر ومنهاج عمل بيجين وإضافة برنامج تلفزيوني لجعل وحدة تخزين نهائي من 10 مل.
    2. إضافة 1 مل طازج PFA/GA الحل لكل طبق من الخلايا والإصلاح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
    3. نضح الخلايا PFA/GA وشطف 3 مرات مع PBS.
      4. أغسل
    4. الخلايا التقيد بها مع برنامج تلفزيوني، 5 مرات لمدة 5 دقائق. تنفيذ كافة الخطوات الغسيل على دوار تعيين إلى سرعة معتدلة (مثلاً، 50 دورة في الدقيقة)-
    5. المقبل، خفض مجموعات ألدهيد مجاناً مع 1 مل طازج بورهيدريد الصوديوم كتلة/حجم 0.1% في الماء المتأين دي-
    6. الخلايا شطف مرتين ثم يغسل 3 مرات لمدة كل 5 دقائق في برنامج تلفزيوني لإزالة جميع آثار بورهيدريد الصوديوم والكحول وتنتج عند فإنه يتفاعل مع الألدهيدات الحرة-
  3. التثبيت الميثانول من الماوس الكبار البطين ميوسيتيس
    1. بعناية إضافة 1 مل من المثلج 100 ٪ الميثانول إلى الخلايا. إمالة لوحة 6-جيدا و "الماصة؛" الميثانول ضد الجدار الجانبي بدلاً من مباشرة على ساترة. ثم إمالة لوحة 6-جيدا مرة أخرى إلى أفقي للسماح الميثانول يغسل بالتساوي عبر الخلايا. إصلاح لمدة 5 دقائق في-20 درجة مئوية.
    2. نضح الخلايا مثبت وشطف 3 مرات مع PBS.
    3. تغسل الخلايا التقيد بها مع برنامج تلفزيوني، 5 مرات لمدة كل 5 دقائق على المدورة.

6. حظر الملزمة الخاصة بعدم

  1. كتلة ح 1 في درجة حرارة الغرفة في حل حظر (انظر الجدول للمواد)-
    ملاحظة: يمكن استخدام مختلف الحلول كتلة جسم غير محددة ملزمة بما في ذلك 3% ألبومين المصل البقري (BSA) أو المصل غير المتمتعين بالمناعة من نفس النوع كجسم الأولية.

7. الكشف عن

  1. الاحتضان الابتدائي جسم
    1. أسبيراتي حل حظر. عدم غسل أو شطف.
      2. إعداد
    2. الحل جسم الابتدائي كما يلي (راجع الخطوة 7.1.5): تضعف جسم الأولية لتركيز من 10 ميكروغرام/مل (أو الشركة المصنعة ' s اقترح تركيز) في حل حضانة جسم (انظر الجدول "للمواد" ). التوازن هذا الحجم الصغير على ساترة ومجموعة مربع من البارافين البلاستيك الفيلم بعناية في الأعلى. وهذا تساعد على نشر وحدة صغيرة من جسم أكثر ساترة وحراس ضد التبخر.
    3. بوضع لوحة 6-جيدا في دائرة رطوبة واحتضانها طوال الليل في الثلاجة.
    4. في الصباح، وإزالة الخلايا من قاعة الرطوبة، بعناية إزالة الفيلم البارافين مربعة من سطح ساترة ونضح الحل جسم الأولية.
    5. شطف 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، ثم يغسل 5 مرات لمدة 5 دقائق مع الغسيل الحل الكتلة (انظر الجدول للمواد) على محور دوار.
      ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول التالي الأجسام المضادة، ومكافحة-RFP الماوس [مونوكلونل] جسم للصور المعروضة في الشكل 2 وارنب [بولكلونل] FP1 7 مكافحة Ca V 1.2 جسم (هدية من زين. يوهانس الجحيم، جامعة كاليفورنيا ديفيس) للصور المعروضة في الشكل 3. فيما يتعلق بدائرة الرطوبة، اصطف علبة بلاستيكية طعام غداء مع غطاء ضيقة، مع مناشف ورقية رطبة الأشغال. يمكن استخدام برنامج تلفزيوني للغسيل الخطوات، بيد أن هذا البروتوكول يحسن خصوصية وضع العلامات، ويقلل من الخلفية باستخدام حل حظر مخفف للغسيل الخطوات.
  2. حضانة جسم الثانوية
    1. نضح الحل الغسيل وإضافة 200 ميليلتر مترافق جسم الثانوي حل المخفف 1:1,000 في جسم الاحتضان الحل. ضع مربع من البارافين الفيلم على رأس ساترة (راجع الخطوة 7.1.2)-
    2. إينكوباتي ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام-
    3. جسم أسبيراتي الثانوية وشطف 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
    4. تغسل الخلايا مع حل حظر المخفف 5 مرات لمدة 5 دقائق في الروك.
    5. الغسيل 3 مرات لمدة 5 دقائق مع PBS.
      ملاحظة: هذا البروتوكول وصف استخدام الماوس المضادة 647 أليكسا مترافق جسم الثانوية وارنب المضادة 647 أليكسا مترافق جسم الثانوية الشكل 2 و الشكل 3، على التوالي. لوسم البروتين وحيد، هو 647 أليكسا fluorophore المفضل نظراً لعد فوتون عالية (يحسن الدقة التعريب) ودورة العمل منخفضة (يحسن الأزمنة) 8. تتوفر العديد من خيارات مترافق fluorophore جسم الثانوية الأخرى، مثل أتو أو صبغات قبرصي،. الرجوع إلى ديمبسي et al. 8 وتشوزينسكي et al. 9 تقييمات شاملة لمدى ملاءمة عدة fluorophores/الأصباغ لتصوير فائقة القرار.

8. بعد انتهاء التثبيت (خطوة اختيارية)

  1. تمييع 50 ميليلتر GA 50% في 10 مل برنامج تلفزيوني للحصول على حل GA 0.25%. بعد إصلاح الخلايا لمدة 10 دقائق في هذا الحل في درجة حرارة الغرفة-
  2. يغسل مع برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق على المدورة.

9. تخزين العينات

  1. تخزين العينات في الثلاجة (4 درجات مئوية) في حاوية ألومنيوم إحباط مبطنة لحماية من الضوء حتى التصوير-
  2. تخزين للتخزين على المدى الطويل من عينات (تصل إلى عدة أشهر)، في برنامج تلفزيوني يتضمن أزيد الصوديوم 3 مم لمنع نمو البكتيريا.

10. الديمقراطيين الاشتراكيين القرار فائقة "التصوير إعداد المخزن المؤقت فوتوسويتشينج"

  1. إعداد مسح الأكسجين ' جلو ' الحل كما يلي:
    1. في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، إضافة 12.5 ميليلتر كاتالاز (الأسهم 34 ملغ/مل)، 3.5 ملغ أوكسيديز الجلوكوز، و 0.5 ميليلتر م 1 تريس (pH = 8) إلى 49.5 ميليلتر PBS.
    2. دوامة بإيجاز تذوب المكونات في الحل ثم الطرد المركزي في 20,800 س ز لمدة 3 دقائق على 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: تم إيجاد حلول المسح الأكسجين مثل جلو، معارضة فوتوبليتشينج. ينبغي أن تظل جلو في الثلاجة لمدة تصل إلى أسبوع واحد. كرر الخطوة أجهزة الطرد المركزي في كل مرة يتم استخدامه-
  2. تحضير فوتوسويتشينج الذي يحفز ثيول الحل كما يلي:
    1. إعداد 100 مم β-ميركابتوثيلاميني (طيران الشرق الأوسط) الحل في برنامج تلفزيوني وتعديل درجة الحموضة pH 8 أو استخدام β-ميركابتوثانول (βME) بدلاً من ذلك. تخزين الكوتيد شركة طيران الشرق الأوسط الحل في الثلاجة (-20 درجة مئوية) لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  3. فورا قبل التصوير، إعداد المخزن المؤقت التحويل النهائي على الجليد بإضافة ثيول ومكونات الأكسجين المسح معا. عن 500 ميليلتر جلوكس-الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، إضافة 5 ميليلتر جلوكس ميليلتر 50 شركة طيران الشرق الأوسط (pH = 8) و 445 ميليلتر المالحة في المخزن المؤقت (2.5 مل م 1 تريس الأس الهيدروجيني = 8، مغ 29.22 كلوريد الصوديوم (10 ملم تركيز النهائي)، الجلوكوز 5 غ و 47.5 مل من الماء). وبدلاً من ذلك، لحل βME جلوكس إضافة 5 ميليلتر جلوكس إلى 5 ميليلتر βME وميليلتر 490 المالحة المخزن المؤقت-
    1. تبقى الحلول على الجليد واستخدامها حسب الحاجة لتحميل عينات على الشرائح الزجاجية الاكتئاب.
      ملاحظة: حمل ثيول الحلول التي تحتوي على مثل βME أو شركة طيران الشرق الأوسط فوتوسويتشينج المستندة إلى cyanine الأصباغ مثل 647 أليكسا 10 أو على أساس xanthene الأصباغ مثل أليكسا 568. ΒME يؤدي إلى نتائج أفضل مع 647 أليكسا حين اتفاق بيئي متعدد الأطراف المفضل ل 568 أليكسا أو عندما تكون البروتينات 2 تصويرها بنهج وضع العلامات مزدوجة تستخدم أليكسا 568 و 647. المخزن المؤقت سوف تتدهور خلال فترة ساعات بسبب التحمض. سوف يؤدي هذا إلى انخفاض في عدد فوتون متوسط العينة. لمنع هذا، من المستصوب جعل المخزن المؤقت فوتوسويتشينج جديدة بعد ح 2-3 أو إذا لوحظ انخفاضا في عدد فوتون متوسط أو ملحق ملحوظا من الوقت الذي يستغرقه فوتوسويتشينج المستحث. ووصف مقال نشر مؤخرا تصوير المخزن مؤقت جديد ثور-عصام الذي نحن لم تختبر بعد ولكن يقال أن المعروضات الأس الهيدروجيني مستقرة المستويات لعدة أيام، وأداؤها أفضل من جلوكس ل تطبيقات التصوير متعدد الألوان 11-

11. تركيب عينات

  1. كوفيرسليبس جبل مع الخلايا المسماة (انظر الأقسام 1-9) في الاكتئاب الشرائح، باستخدام 100 ميليلتر المخزن المؤقت للتصوير-
  2. ختم حواف ساترة مع غراء سيليكون لمنع الأكسدة السريعة للمخزن المؤقت للتصوير. انتظر عدة دقائق حتى يشفي الغراء سيليكون قد تماما وإلا ساترة الانجراف عند التصوير-
    ملاحظة: سوف لا تتصلب غراء السيليكون إذا أنه يأتي في اتصال مع βME. ومن المؤكد أن تجف حواف ساترة للحيلولة دون الاتصال المخزن المؤقت التصوير الغراء سيليكون.

12. التقاط صور

  1. انظر الجدول 1 للاطلاع على قائمة التصوير المعلمات المستخدمة في الشكل 2 و الشكل 3-
    1. للبدء، حدد الليزر مناسبة لإلقاء الضوء على العينة اعتماداً على فلوروفوري المحددة. الديمقراطيين الاشتراكيين ريال النظام المستخدم في هذا البروتوكول مجهز بأشعة الليزر عالية الطاقة (488 نانومتر، 1.4 كيلو واط/سم 2؛ 532 نانومتر، 2.1 كيلو واط/سم 2؛ 561 نانومتر، 2.1 كيلو واط/سم 2 642 نانومتر، 2.1 كيلو واط/سم 2). الشكل 2 استخدام الليزر نانومتر 642.
  2. استخدام عدسة هدف نفط-غمر مع na عالية. الديمقراطيين الاشتراكيين ريال النظام المتبع هنا مجهزة الاشتقاق رر HC 160 X/1.43 الهدف غ.
  3. اختيار المكعب التصوير مزدوج اللون المناسب. نظام ريال-الديمقراطيين الاشتراكيين في هذا البروتوكول مجهزة 488 إتش تي، 532 إتش بي تي، 568 إتش تي، تي إتش 642 مع مرشحات تمرير الفرقة الانبعاثات نانومتر 505-605 و 550-650 نانومتر 660-760 نانومتر.
  4. تحديد وضع اقتناء 2D. تعيين الكاميرا إلى وقت التعرض ووضع الإطار ونقل إلى 10 مللي ثانية (100 هرتز). تعيين كسب م إلى 300. حدد عتبة الكشف.
    ملاحظة: عتبات منخفضة إنتاج الصور مع خلفية عالية. يمكن تصفية عتبات عالية الإشارة للفائدة. تحديد العتبة استناداً إلى عناصر سلبية مثل التصوير كوفيرسليبس غير transfected الخلايا أو الخلايا المحتضنة مع الجسم المضاد الثانوي فقط.
  5. تشغيل التحكم التلقائي بالحدث والأحداث تعيين كل الصور إلى 8-
    6. أدخل
  6. حجم بكسل في علامة التبويب الديمقراطيين الاشتراكيين-اقتناء (تبدأ مع 10 نانو متر أو 20 حجم بكسل في شمال البحر الأبيض المتوسط). التأكد من أن " "وضع الرسم البياني" " المحدد في علامة التبويب أدوات الديمقراطيين الاشتراكيين ضمن خيارات حساب الصورة قبل الحصول على صورة عالية الدقة-
  7. لصورة البروتينات في غشاء البلازما وحدد وضع TIRF وتعديل زاوية السقوط لتحديد عمق الاختراق.
  8. لإرسال الإلكترونات للدولة الظلام (تسمى ضخ)، تعيين كثافة الليزر إلى 100%-
  9. حدد الكشف عن جزيء واحد بينما الضخ وتعيين إلى اكتساب تلقائياً عندما يكون الارتباط الإطار 0.20.
  10. لاقتناء، تعيين كثافة الليزر إلى 50%-
  11. تعيين عدد الإطارات التي تم اقتناء إلى 60 ألفا-
    ملاحظة: قد تجد المحقق أن عينة يتطلب أكثر أو أقل من الإطارات من هذا. تعديل عدد الإطارات استناداً إلى الملاحظات لاقتناء فلوروفوري فوتوبليتشينج وتوقف عند أي أحداث أخرى قابلة للاكتشاف.
  12. اقتناء ابدأ.
    ملاحظة: في بداية اقتناء، جميع صبغ الجزيئات في الحالة الفلورسنت وثم التبديل إلى حالة الظلام. عندما تصل العلاقة الإطار إلى 0.20، سوف تبدأ الصور للحصول عليها. عندما يتم الكشف عن أحداث أقل من 8 لكل إطار، ستتحول الليزر 405، تشجيع fluorophores للانتقال من حالة الظلام إلى أرض الدولة. عند الحصول على صور لمجموعة من n = x الخلايا من n = y الحيوانات، معلمات مثل TIRF عمق الاختراق، وعتبة الكشف، وعدد الإطارات التي تم الحصول عليها يجب أن تبقى ثابتة.

13. صورة التحليل

  1. لقياس حجم كتلة البروتين، استخدم ' تحليل الجزيئات ' ميزة إيماجيج.
    ملاحظة: قد إجراء المزيد من التحليل استخدام تحليل التعريب النسبي القائم على الفحص المجهري التعمير البصرية العشوائية (العاصفة-RLA) أو مماثلة 13.
    1. إجراء تحليل الكتلة ( الشكل 3) استخدام إيماجيج كالتالي:
    2. فتح ملف الصورة يتم تحليلها. ينبغي أن يكون هذا مخطط تعريب جزيء واحد الرسم بياني شمال البحر الأبيض المتوسط 10 يتم إنشاؤها في برامج التصوير المذكورة أعلاه (المادة 12)-
    3. ضبط السطوع والتباين لتصور الصورة: انقر فوق في القائمة صورة، حدد ضبط، ثم السطوع والتباين. انقر فوق الخيار التلقائي.
    4. تغيير نوع الصورة إلى 8-بت: حدد القائمة صورة، ثم حدد نوع، واختيار 8 بت-
    5. تعيين حجم الصورة: فتح القائمة تحليل، انقر فوق تعيين مقياس وإدخال المعلمات التالية: المسافة = 1، تعرف المسافة = 10، 1 بيكسل = 10 نانومتر.
    6. لتحديد القياسات للحصول عليها، افتح قائمة تحليل، حدد مجموعة من القياسات، وعلامة في المربع بجانب خيار المنطقة.
    7. ضبط الحد الأدنى الصورة. فتح القائمة صورة، حدد ضبط ثم قم بتحديد العتبة، حدد أكثر من/تحت. تحريك الحد الأقصى للقيمة إلى 255، وتحريك الحد الأدنى للقيمة إلى 1 ثم انقر فوق تطبيق.
    8. لتحليل الجزيئات، افتح قائمة تحليل، حدد تحليل الجزيئات. ضع علامة اختيار تحديد وحدات بكسل وعرض النتائج وتلخيصها. تعيين الحجم إلى 4-انفينيتي (نظراً لقرار ~ 20 nm)، حدد الخيار الخطوط العريضة العارية وانقر فوق موافق. سيتم إنشاء ملف موجزة التي سوف تحتوي على تفاصيل التحليل مثل حجم الكتلة متوسط وعدد الكتل في الصورة-
      ملاحظة: يجب توخي الحذر عند تقديم استنتاجات حول عدد البروتينات داخل مجموعة معينة، كعدد النقاط المترجمة لا يرتبط خطيا مع عدد البروتينات. الديمقراطيين الاشتراكيين يموضع الأصباغ التي هي مترافق للأجسام المضادة، نتج عنه خطأ ربط التي تحل محل التسمية الفلورسنت من بيفرتون من > 10 نانومتر في أي اتجاه. بالإضافة إلى ذلك، إذا استخدمت [بولكلونل] أجسام، يمكن ربط جسم واحد أو أكثر مستضد واحد والخلط بين مسألة أبعد والتجارية الثانوية هي مترافق الأجسام المضادة، في المتوسط، 3-6 جزيئات من صبغة فلوروفوري واحدة لا تساوي دائماً بروتين واحد. يمكن تقليل الخطأ الربط بالتصريف صبغة مباشرة إلى جسم الأولية (القضاء على الثانوية) أو بواسطة استخدام نظام وضع العلامات على أساس نانوبودي 14-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وكما هو موثق في المقدمة، هناك العديد من دقة فائقة مختلفة مجهرية التصوير الطرائق. ويركز هذا البروتوكول، تصوير فائقة القرار الديمقراطيين الاشتراكيين. وترد في الشكل 2 و الشكل 3الصور التمثيلية وخرائط التعريب.

ويبين الشكل 2 خلية كوس-7 transfected مع ائحة البروتين، متشيري-Sec61β، والمجهزة باستخدام الطريقة الموضحة أعلاه. الشكل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

عرضت التفجير الأخير للتكنولوجيات التي تسمح لتصوير خارج حدود حيود نوافذ جديدة إلى تعقيدات الثدييات الخلية إشارات في الزمان والمكان. وتشمل هذه التكنولوجيات العاصفة، STED والنخيل، والديمقراطيين الاشتراكيين، سيم وأشكالها (مثلاً، دستورم، فبالم). إبداع العلماء وراء هذه التقنيات قد سمح لنا للتحايل على القيود المفروضة بموجب قوانين الفيزياء التي تحكم حيود الضوء. وعلى الرغم من هذا الإنجاز الضخم، كل من هذه التقنيات يجعل نوعا من الحل الوسط لتحقيق القرار عظمى، وعلى هذا النحو، لها حدودها. هي الحالة المثالية التي يسعى علماء ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب قد لا المصالح المتنافسة الكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل بمنحه من اها إلى R.E.D. (15SDG25560035). المؤلف يود أن ينوه الدكتور فرناندو سانتانا لاستخدام مجهر ثلاثي الأبعاد له "إيكا ريال الديمقراطيين الاشتراكيين"، والدكتور يوهانس الجحيم يرجى توفير جسم FP1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
KOHThermo ScientificP250-500لتنظيف الغطاء الزجاجي
# 1.5 غطاء زجاجي 18 × 18 ممMarienfeld Superior0107032)لزراعة / معالجة / صورة الخلايا
10x PBSThermo ScientificBP3994تمييع إلى 1x بالماء منزوع الأيونات
Poly-L-LysineSigmaP4832Aids مع التصاق الخلية لتغطية
اللامينينالزجاجيSigma114956-81-9مساعدات مع التصاق الخلية لتغطية الزجاج
متوسط 199Thermo Scientific11150-059وسائط ثقافة الخلايا العضلية البطينية
DMEM 11995Gibco11995وسائط زراعة الخلايا
مصل الأبقار الجنينية (FBS)مكمل 10437028 الوسائط العلمي الحراري
البنسلين / الستربتومايسينسيجماP4333وسائل الإعلام مكمل غذائي
0.05٪ تريبسين-EDTAكورنينج25-052-CLمحلول زراعة الخلايا
ليبوفيكتامين 2000Invitrogen11668-019كاشف تعداء عابر
Ca2 + خال من PBSGibco1419-144زراعة الخلايا
100٪ ميثانولثيرمو فيشر العلميA414-4الخلية
بارافورمالديهايدإلكترون علوم الفحص المجهري15710تثبيت الخلايا
الجلوتارالديهايدسيجما ألدريتشSLBR6504Vتثبيت الخلايا
SEAblockThermo Scientific37527BSA أو بدائل أخرى لحل الحجب
موجودة Triton-X 100SigmaT8787منظف لاختراق الخلايا
الأرنب المضاد ل CaV1.2 (FP1)هديةN / Aتوجد أجسام مضادة تجارية مضادة ل CaV1.2 مثل Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)
Mouse أحادي النسيلة مضاد ل RFPRockland Inc.200-301-379الجسم المضاد الأولي
Alexa Fluor 647 دونكيت مضاد للأرانب IgG (H + L)Invitrogen (Thermo Scientific)A31573الجسم المضاد الثانوي
Alexa Fluor 568 الماعز المضاد للفأر IgG (H + L)Invitrogen (Thermo Scientific)A11031الجسم المضاد الثانوي
أزيد الصوديومSigmaS2002يمنع نمو الميكروبات لتخزين عينات الكاتلاز على المدى الطويل
مكون المخزن المؤقت SigmaC40Photoswitching
Glucose oxidaseSigmaG2133مكون المخزن المؤقت للتبديل الضوئي
TrisSigmaT6066مكون المخزن المؤقت
Photoswitching بيتا ميركابتو إيثيلامين هيدروكلوريدفيشرBP2664100مكون المخزن المؤقت للتبديل الضوئي
& -mercaptoethanolSigma63689مكون المخزن المؤقت للتبديل الضوئي
NaClFisherS271-3مكون المخزن المؤقت للتبديل
الضوئي سكر العنبفيشرD14-212مكون المخزن المؤقت للتبديل الضوئي
الاكتئاب الزجاجيNeolab1 – 6293لتركيب العينات
TwinsilPicodent13001000لإغلاق الغطاء الزجاجي
sec61 & beta ؛ - mCherry plasmidAddgene49155
Leica SR GSD مجهر ثلاثي الأبعادLeica
ImageJ
محلولالغسيل 20٪ SEAblock في محلول
حضانة0.5٪ Triton-X100 ، 20٪ SEAblock ، في محلول
حضانةالأجسام المضادة الثانوية PBS1: 1000 في برنامج تلفزيوني
تثبيت شرائح كتلة الأجسام المضادة الأولية PBS

المراجع

  1. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
  2. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  4. Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
  5. Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).
  6. Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302(2011).
  7. Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
  8. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  9. Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
  10. Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
  11. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).
  12. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  13. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  14. Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
  15. Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
  16. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  17. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
  18. Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

TIRF
الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.