يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في فيفو الفحص للكشف عن وظيفة محددة مستضد تي خلية عن استخدام نموذج التطعيم

9.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56255

⸱

نوفمبر 28, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Melanoma Medical Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Immunology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Radiation Oncology, The Second Hospital of Jilin University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

والهدف من هذا البروتوكول هو السماح للكشف عن في فيفو قتل الخلية المستهدفة في نموذج مورين مستضد على حدة.

الملخص

المنهجيات الحالية لقتل محددة مستضد محدودة للاستخدام في المختبر أو تستخدم في نماذج الأمراض المعدية. ومع ذلك، هناك لا بروتوكول خصيصا لقياس محددة مستضد القتل دون عدوى. تم تصميم هذا البروتوكول ويصف أساليب للتغلب على هذه القيود بالسماح للكشف عن حدة مستضد قتل الخلية المستهدفة واسطة CD8+ تي الخلايا في فيفو. ويتم ذلك عن طريق دمج نموذج تطعيم بهدف المسمى كفسي تقليدية مما أسفر عن مصرع المقايسة. يسمح هذا المزيج الباحث لتقييم إمكانات CTL محددة مستضد مباشرة وبسرعة كما المقايسة لا يتوقف على نمو الورم أو الإصابة. وبالإضافة إلى ذلك، قراءات يرتكز على التدفق الخلوي وهكذا ينبغي أن تكون متاحة لمعظم الباحثين. يتم تحديد القيد الرئيسي للدراسة المخطط الزمني في فيفو غير الملائمة إلى الفرضية يجري اختبارها. الاختلافات في قوة مستضد والطفرات في خلايا تي التي قد تسفر عن الدالة عن فرق بحاجة إلى أن يقيم بعناية لتحديد الوقت الأمثل للحصاد الخلية والتقييم. وقد تم تحسين تركيز مناسب من الببتيد للتطعيم hgp10025-33 والبويضات257-264، ولكن كذلك أنه يلزم التحقق من الصحة الببتيدات الأخرى التي قد تكون أكثر ملاءمة لدراسة معينة. وعموما، هذا البروتوكول يسمح بتقييم سريع لقتل الدالة في فيفو ويمكن تكييفها مع أي مستضد معين.

المقدمة

توجد بروتوكولات متعددة تقييم إمكانات CD8 (CTL) عن+ أو خلايا CD4+ تي خلية. يمكن أن يتم هذا التقييم سهولة في المختبر تحت ظروف خاضعة للرقابة1،،من23. وبالإضافة إلى ذلك، نماذج الأمراض المعدية، مثل لكمف، درست كلاسيكي CTL وظيفة عن طريق استخدام خلطات كفسي (إستر سوكسينيميديل اسيتات-(and 6) 5-كاربوكسيفلوريسسين) المسماة الخلايا المستهدفة حيث كفسيمرحبا-الخلايا المسماة نابض الببتيد وكفسيلو-المسمى المستهدفة يتم ترك الخلايا أونبولسيد. الخلايا ثم حقنها بنسبة 1:1 وتقييم للخسائر كفسيمرحبا-وصفت الأهداف نابض بالتدفق الخلوي4. واستخدمت نماذج اللقاح ورفض أيضا استراتيجيات مماثلة لتقييم في فيفو قتل بكلا CD8+ وخلايا CD4 خلايا+ T، فضلا عن ناغورني كاراباخ الخلايا5،6. هذا هو مقايسة قوية، ولكن يتطلب استخدام العوامل المعدية رئيس الجهاز المناعي قبل الحقن المستهدف.

هذا البروتوكول، من ناحية أخرى، يتطلب أي عدوى مسبقة من البلد المضيف، ويستخدم بدلاً من ذلك استراتيجية تطعيم رئيس الجهاز المناعي قبل الحقن المستهدف. يتكون هذا التطعيم من وضع المياه على أساس لقاح الببتيد الذي يتطلب توفير immunostimulatory كوكتيل دعا كوبا7، تتألف من مستقبلات مثل عدد القتلى 7 (TLR7) مؤثر (إيميقويمود كريم)، ومكافحة-CD40 ناهضة الأجسام المضادة، و interleukin-2 (إيل-2) مما يؤدي إلى التآزري مزيج من العوامل إيمونوستيمولاتوري للاستثارة فتيلة محددة الببتيد واستجابة مناعية قوية. على هذا النحو، يوفر هذا التحليل قراءات سريعة للدالة CTL كما تدار اللقاح جنبا إلى جنب مع الخلايا لتقييم الدالة إلا ثلاثة أيام قبل حقن الخلايا المستهدفة. وباﻹضافة إلى ذلك، فتيلة كوبا قوية بما يكفي أن قدرة قتل الخلية تي محددة مستضد معبي يمكن أن يرى بين ح 4 و 24 بعد الحقن.

هو تحديد القيد الرئيسي لهذا البروتوكول الجدول الزمني في فيفو للكشف عن القتل المستهدف غير الملائمة إلى antigen والفرضية يجري اختبارها. يجب إجراء تقييم دقيق، كالتغيرات في قوام مستضد، فضلا عن التعديلات الوراثية يجري اختبارها في خلايا تي يمكن أن يؤدي وظيفة CTL التفاضلية التي تتطلب الكشف عن توقيت مختلف للقتل المستهدف. وبالإضافة إلى ذلك، في حين تركيز مناسب من الببتيد للتلقيح قد تم الأمثل لسرطان الجلد البشرية مستضد glycopeptide 100 (hgp10025-33) و ovalbumin257-264 (البويضات257-264)8،9 ، استخدام نموذج مستضد آخر قد يكون أكثر ملاءمة لدراسة معينة تتطلب مزيدا من التحقق من الصحة. بسبب الاختلافات المتوقعة في المستضدات المستهدفة القدرة على حفز CTL المستجيب الدالة في تركيبة مع كوبا وصفها adjuvant، قد يكون الأمثل لايل-2 جرعة التركيز والجرعة التردد ضروري لتحقيق الهدف المنشود. وعموما، هذا البروتوكول يسمح بإجراء تقييم سريع لقتل الدالة في فيفو ويمكن تكييفها مع أي مستضد معين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة تكساس MD أندرسون في مركز السرطان.

1. إعداد الببتيد للقاح

  1. حل الببتيد المجففة بالتبريد مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بتركيز مناسب ودوامه لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: ل hgp10025–33، يكون التركيز النهائي 1 ملغ/مل والبويضات257–264، تركيز النهائي 0.5 ملغ/مل. إعادة تشكيل الببتيد قبل الحقن. لا تقم بتخزين بعد إعادة تشكيل.

2-عزل سبلينوسيتيس من الماوس المحورة وراثيا

ملاحظة: يجب إجراء عزل الخلية من الطحال بطريقة عقيمة.

  1. Euthanize الماوس المعدلة وراثيا OT-1 استخدام أسلوب الخنق2 CO المعتمدة وإزالة الطحال.
    ملاحظة: يستخدم الماوس المعدلة وراثيا ملائمة في هذه الخطوة المحددة ببتيد الاختيار.
    1. وضع الماوس على الجانب الأيمن. رذاذ الجانب الأيسر للماوس مع 70% إيثانول (EtOH). سحب الجلد باستخدام الملقط، وقطع الجلد باستخدام مقص الجراحية؛ ستكون مرئية داخل التجويف الصفاقى الطحال. بلطف قص فتح التجويف الصفاقى الوصول إلى الطحال. إزالة الطحال باستخدام الملقط.
  2. تصنيف الطحال بوضعه في عامل تصفية 70 ميكرومتر في طبق بتري مع متوسط 2 مل (برنامج تلفزيوني مع 1% مصل بقرى الجنين (FBS)) وتحطيم الطحال مع نهاية المكبس.
    1. جمع في سبلينوسيتيس من صحن بيتري ومكان في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. أغسل صحن بيتري مع 5 مل متوسطة مرتين إلى جمع كافة الخلايا. إضافة المتوسطة يصل إلى 25 مل والطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في 475 x ز.
  3. نضح الخلايا وريسوسبيند في 1 مل/لكل المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) الطحال. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 إضافة 10 مل من متوسط وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة في غ. س 475 ريسوسبيند بيليه في 10 مل متوسط وإزالة الأنقاض بتصفية تعليق خلية من خلال عامل تصفية 70 ميكرومتر إلى تنظيف 50 مل مخروطية الشكل.
  4. حساب عدد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير. ريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي 106 -1006 خلايا/مل. للبويضات257–قتل، ريسوسبيند264 محددة في 106 خلايا/مل وعلى hgp100 مما أسفر عن مصرع، ريسوسبيند25–33 محددة في 1006 خلايا/مل.
    1. زيادة ونقصان الخلايا المتبقية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 475 x زاي نضح المادة طافية وريسوسبيند في برنامج تلفزيوني الباردة 15 مل لغسل الخلايا. كرر الخطوة يغسل مرة أخرى. زيادة ونقصان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 475 x زاي نضح المادة طافية وريسوسبيند في برنامج تلفزيوني الباردة وفقا لحجم النهائي تحديد في الخطوة 2، 4.
    2. نقل تعليق خلية مفردة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل والحفاظ على الجليد حتى الحقن إلى المستلم C57/BL6 الماوس.

3-حقن سبلينوسيتيس من الفئران المحورة وراثيا

  1. ضع الماوس C57/BL6 المستلم في ريسترينير مع الجانب الظهرية أعلى. رذاذ حقن المنطقة قاعدة الذيل مع كحول الأيزوبروبيل 70%. إدارة 100 ميليلتر من تعليق خلية مفردة (الباب 2) عن طريق الوريد الوريد ذيل باستخدام إبرة ز 27 مع الجانب مجسم مشطوف الحواف متقابلة لأعلى.

4-كوفاكس الإدارة

ملاحظة: إذا كان يتم حقن الخلايا في فترة ما بعد الظهر، كوبا ينبغي أن تدار في صباح اليوم التالي ضمن ح 18 من حقن الخلايا.

  1. ضع الماوس في مربع تخدير واضحة مع إيسوفلوراني 1-3%. بعد أن يتم تخديره تماما من الفئران، نقل الفئران إلى المخروطات يعلق على المتشعبة في قاعة التخدير. الحفاظ على ضبط النفس مع الجانب الظهرية حتى الفئران.
    ملاحظة: يؤكد قرصه إصبع قصيرة للتحقق من استجابة انسحاب هو لم تحظ أنيسثيتيزيشن. القانون الاتحادي بتقييد استخدام isoflurane بناء على أمر الطبيب بيطري المرخص لها.
  2. رذاذ حقن المنطقة قاعدة الذيل مع كحول الأيزوبروبيل 70%. حقن 100 ميليلتر من حل الببتيد (من القسم 1) تحت الجلد باستخدام إبرة ز 27 مع المحاقن اختراق 4-5 مم في منطقة قاعدة الذيل، الجانب المشطوف إبرة مواجهة.
    ملاحظة: يتم تحصين الفئران في الجناح واحد بالحقن تحت الجلد عند القاعدة الذيل10.
  3. حقن 100 ميليلتر CD40 مكافحة الأجسام المضادة (0.5 ملغ/مل الأسهم) الجانبي إلى موقع حقن اللقاحات.
  4. بعناية تطبيق imiquimod كريم 50 ملغ/الماوس على مواقع التطعيم. فرك كريم imiquimod على السطح حتى الكريم لم تعد مرئية ويتم امتصاصه تماما.
  5. حقن 100 ميليلتر من البروتين رحيل-2 100,000 وحدة دولية/مل إينترابيريتونيلي (القائمة) في منطقة البطن السفلي. مراقبة الفئران لمدة 5 دقائق بعد ما يتعافى تماما من التخدير.
    ملاحظة: التجربة توقفت عند هذه النقطة لمدة 3 أيام.

5-عزل سبلينوسيتيس المستهدفة لوضع العلامات مع كفسي

ملاحظة: يجب إجراء عزل الخلية من الطحال بطريقة عقيمة.

  1. Euthanize الفئران C57BL/6 وفقا لأسلوب الخنق2 CO المعتمدة. إزالة spleen(s) كما في الخطوة 2.1.1. تصنيف الطحال وتغسل سبلينوسيتيس كما هو الحال في الخطوات 2.2.1-2.2.3. خلايا الدم الحمراء كما هو الحال في الخطوات 2، 3-2.3.2.
  2. إزالة الخلايا لعد استخدام هيموسيتوميتير وحساب لتركيز نهائي للخلايا في 106 خلايا/مل في حل كفسي العلامات (كما هو موضح في الخطوة 7). تدور الخلايا المتبقية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 475 × المادة زاي أسبيراتي طافية.

6-الببتيد النبض للهدف سبلينوسيتيس

ملاحظة: الببتيد النبض يجب إجراء بطريقة عقيمة.

  1. ريسوسبيند الخلايا في 106 خلايا/مل في وسائط كاملة (RPMI 1640 وسائل الإعلام مع 10% FBS، 1% لالجلوتامين (L-جلن)، 1% البنسلين/ستربتوميسين (القلم/بكتيريا)). تقسيم الخلايا في أنابيب 2 (15 مل كونيكالس). قم بتسمية كل أنبوبة كنابض أو أونبولسيد.
  2. إضافة الببتيد إلى الأنبوبة المسماة نابض. للبويضات257–264 النبض، إضافة 1 ميكروغرام/مل و hgp10025–33 النبض، إضافة 2 ميكروغرام/مل.
    ملاحظة: تخضع الخلايا أونبولسيد في الحضانة نفسها كخلايا نابض فقط دون إضافة الببتيد.
    1. احتضان خلايا + الببتيد في 37 درجة مئوية ح 1.
  3. إضافة 10 مل وسائط كاملة (RPMI 1640 وسائل الإعلام مع 10% FBS، 1% L-الجلوتامين (L-جلن)، 1% البنسلين/ستربتوميسين (القلم/بكتيريا)) لكل أنبوبة لغسل كل نابض وأونبولسيد الخلايا المستهدفة. تدور الخلايا المتبقية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 475 × المادة زاي أسبيراتي طافية.

7-إعداد كفسي لوسم سبلينوسيتيس الهدف

  1. تعد العلامات كفسي الحل خلال الخلية الغسيل في خطوة 6.3؛ سوف يكون المسمى الخلايا نابض كفسيمرحبا وأونبولسيد ككفسيلو. إعداد 1 مل من محلول وسم كفسي 106 خلايا.
    ملاحظة: كفسي هي حساسة للضوء، وينبغي أن تكون محمية من الضوء في جميع الأوقات.
    1. إعداد كفسيمرحبا -تسمية الوسائط بإضافة 1 ماي/مل كفسي (حل الأسهم 5 مم) لتركيز نهائي من 5 ميكرومتر/مل في الإعلام RPMI 1640 مع 2% FBS.
    2. إعداد كفسيلو -وسم وسائل الإعلام عن طريق إضافة 1 ماي/مل كفسي (0.5 مم حل الأسهم) لتركيز نهائي من 0.5 ميكرومتر/مل ربمي الوسائط 1640 مع 2% FBS.

8-وضع العلامات للهدف سبلينوسيتيس مع كفسي

ملاحظة: الوسم كفسي يجب إجراء بطريقة عقيمة.

  1. ريسوسبيند الخلايا الهدف نابض وأونبولسيد (من الخطوة 6.3) في 106 خلايا/مل كفسي تسمية الوسائط. ريسوسبيند الخلايا نابض مع استعداد كفسيمرحبا-تسمية الوسائط والخلايا أونبولسيد مع إعداد كفسيلو-وصف وسائل الإعلام.
  2. مزيج الخلايا والعلامات كفسي وسائل الإعلام بانعكاس لطيف أو دوامات. لا تخلط فورتيكسينج. احتضان خلايا والعلامات كفسي وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 15 ريمكس الخلايا كل 5 دقائق.
  3. إضافة 10 مل من وسائل الإعلام كاملة لكل الخلايا خلية تعليق وتدور في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في غ س 475.
  4. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني الباردة 10 مل. تدور الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 475 x ز.
  5. كرر الخطوة 8، 4.
  6. عد الخلايا ومزيج الببتيد-نابض، كفسيمرحبا-المسمى مع أونبولسيد، كفسيلو-تسمية الخلايا بنسبة 1:1 للحقن في الفئران المستفيدة. الاحتفاظ قاسمة 1 × 106 مختلطة الخلايا استخدامها لتقييم خط أساس تدفق الخلوي (المادة 11).
    ملاحظة: هو الحجم النهائي لحقن 100 ميليلتر للماوس. العد النهائي خلية من خلايا 10e6. يجب أن يؤخذ في الاعتبار فقدان وحدة التخزين في المحاقن والإبر وينبغي أن تكون المقدرة بمبلغ 500 ميليلتر.

9-الحقن بالخلايا الهدف

ملاحظة: الاحتفاظ الخلايا المسماة كفسي محمية من الضوء قبل وأثناء الحقن بقدر الإمكان.

  1. ضع المتلقية الفئران C57BL/6 في ريسترينير مع الجانب الظهرية أعلى. رذاذ حقن المنطقة قاعدة الذيل مع كحول الأيزوبروبيل 70%. إدارة 100 ميليلتر من تعليق خلية واحدة فقط عن طريق الوريد الوريد الذيل مع الجانب مجسم مشطوف الحواف متقابلة لأعلى.

10-إعادة عزل الخلايا الهدف

ملاحظة: توقيت هذه الخطوة الحاسمة وتعتمد على سيتوتوكسيسيتي CTL وقوة مستضد التحفيز. تقييم لقتل البويضات257–264 هدف النبضي، يلزم الخلايا المقطوع 4-6 ح بعد الحقن. حيث تكون الخلايا المسماة كفسي الطحال الحساسة، وعملية الضوء في الظلام.

  1. Euthanize الفئران C57BL/6 المستفيدة وفقا لطريقة الخنق2 CO المعتمدة.
  2. إزالة spleen(s) كما في الخطوة 2.1.1. تصنيف الطحال وتغسل سبلينوسيتيس كما هو الحال في الخطوات 2.2.1-2.2.3. خلايا الدم الحمراء كما هو الحال في الخطوات 2، 3-2.3.2.
  3. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل fluorescence تنشيط الخلية الفرز المخزن المؤقت (الأصول) (1% جيش صرب البوسنة + برنامج تلفزيوني) للتقييم بالتدفق الخلوي.

11-النابضة المنطق لتحديد نشاط CTL بالتدفق الخلوي

  1. إجراء تقييم لنشاط CTL باستخدام بروتوكول قياسي تدفق الخلوي. الحصول على الخلايا باستخدام قناة فيتك في سيتوميتير تدفق مع ليزر 488 نانومتر للإثارة11.
    1. بوابة على العيش لمفاوية استخدام معلمات مبعثر (SSC) الجانب مقابل المبعثر إلى الأمام (FSC). سوبجيت داخل بوابة اللمفاويات الحية لمجموع السكان كفسي إيجابية.
      ملاحظة: حقن الخلايا المسماة كفسي سوف يشكلون مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا اللمفية الإجمالي الحالي في الطحال. يجب أن تظهر الخلايا إيجابية كسفي اثنين من السكان متميزة بمقياس سجل.
    2. استخدام تنسيق الرسم بياني لتحديد النسبة المئوية من أونبولسيد (اليسار الذروة، كفسيلو) ونابض (حق الذروة، كفسيمرحبا) السكان. فقدان كفسيمرحبا الخلايا يشير إلى نشاط CTL مستضد على حدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قبل حقن الخلايا المسماة كفسي المستهدفة، يتم تشغيل الخليط خلية 1:1 على سيتوميتير تدفق لتحديد الترددات الأساس وعلى السواء كفسيمرحبا كفسيلو الخلايا المستهدفة. الشكل 1 A يوضح استراتيجية النابضة للكشف عن التغيرات في السكان كفسي، بوابة أولية باستخدام معلمات منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب. ثم يتم سوبجاتيد مجموع الخلايا كفسي الإيجابية قبل تقييم التغيرات في التردد، كما هذا السكان صغيرة نسبيا بالمقارنة مع سبلينوسي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في حين أن هذا البروتوكول مباشرة، وهناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب أن يتم بعناية. فتيلة كوبا عقب حقن محددة مستضد تي-خلية يجري اختبار ضروري لمعرفة أي قتل الأهداف نابض. وفي حين أنه من الممكن أن التطعيم ضد كوبا المستندة إلى الماء يخلق حالة التهابات حادة، لمرحلة التهاب مزمن، الاستعاضة عن وضع المياه على أساس قصير الأجل مع نهج القائم على النفط مستضد بطء الإفراج قد تنتج أفضل نتائج7،12.

وبالإضافة إلى ذلك، كفسي تسمية الخلايا المستهدفة بعد مستض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

هذا العمل تدعمه أبحاث المعاهد الوطنية للصحة (A1R03AI120027 (RN) و 1R21AI20012 (RN)) ومنح البحوث المؤسسية (RN)، بدء منح (RN)، ومنح البذور MD أندرسون وزارة الجنسية والهجرة (RN).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

من مصل البقري
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
6 إلى 12 أسبوعا أنثى C57BL / 6 فئران   ؛نهر تشارلز027C57 أسود 6 فئران
OT-1 6-12 أسبوعا من إناث الفئران  جاكسون لابس003831
hgp10025– 33 CPCScientific834139KVPRNQDWL
OVA 257– 264 CPCScientificMISC-012SIINFEKL
Imiquimod كريم 5٪ Fougera51672-4145-6Aldara Cream
CD40 mAb BioXcellBE0016-2استنساخ FGK4.5
rhIL-2 بروتين هوفمان لاروش136بروتين IL-2 البشري
المؤتلف 70٪ كحول الأيزوبروبيل الإعدادي KendallS-17474
PBSLife Technologies10010-023Phosphate Buffered Saline
FBSLife Technologies26140-079الجنين
RBC تحلل المخزن المؤقت  Life TechnologiesA10492-01عازلة تحلل خلايا الدم الحمراء
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
L-Glutamine   ؛Life Technologies25030081
Pen / StrepLife Technologies15140122البنسلين / الستربتومايسين
CFSELife TechnologiesC345545- (و 6) - كاربوكسي فلوريسين ثنائي الأسيتات السكسينيميديل إستر
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجما & nbsp ؛A4503
1.5 مل MCT تخرج طبيعي   ؛فيشر05-408-129أنبوب الطرد المركزي الصغير
70٪ الإيثانولفيشرBP8201500
EtOH Trypan الحل الأزرق ، 0.4٪ & nbsp ؛  لايف تكنولوجيز15250-061
مقياس الدمفيشر267110
إبرة قياس 27BD305109
1 مل حقنةBD309659

المراجع

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
  2. Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
  3. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
  5. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627(2014).
  6. Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
  7. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
  8. Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
  9. Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
  10. Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
  11. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

القتل النوعي للمستضدووسم CFSEوتدفق الخلاياوالتحفيز بالببتيدوعزل الخلايا الطحاليةوتقييم نشاط الخلايا التائية السامة للخلاياوقتل الخلايا المستهدفة
في فيفو الفحص للكشف عن وظيفة محددة مستضد تي خلية عن استخدام نموذج التطعيم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.