كفاءة توليد وتحرير إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام نظام كريسبر-Cas9

Anjali Nandal; Barbara Mallon; Bhanu P. Telugu

doi:10.3791/56260

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

كفاءة توليد وتحرير إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام نظام كريسبر-Cas9

9.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56260

⸱

نوفمبر 8, 2017

Anjali Nandal¹^,² , Barbara Mallon³ , Bhanu P. Telugu¹^,²^,⁴

¹Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, ²Animal Bioscience and Biotechnology Laboratory, ARS, USDA, ³NIH Stem Cell Unit, Bethesda, National Institutes of Health, ⁴RenOVAte Biosciences Inc

في هذه المقالة

ملخص

بروتوكول يصف بالتفصيل جيل خال من البصمة المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (إيبسكس) من خلايا البنكرياس البشرية في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق، تبع هذا التحرير باستخدام ريبونوكليوبروتينس كريسبر/Cas9 وتوصيف لتعديل استنساخ الخلايا المفردة.

الملخص

يمكن أن الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثه pluripotent الذاتي تجديد وتفرق في أنواع خلايا متعددة من الجسم. Pluripotent الخلايا وبالتالي هي مطمعا للبحوث في مجال الطب التجديدي، وحاليا في التجارب السريرية لأمراض العيون، والسكري، وأمراض القلب، والاضطرابات الأخرى. يمكن أن تفرق في أنواع الخلايا المتخصصة مقترنا بالتقدم الأخير في الجينوم تحرير التكنولوجيات بما في ذلك نظام كريسبر/Cas قد أتاحت فرصاً إضافية للخياطة الجينوم من اللجنة التوجيهية للتطبيقات المتنوعة بما في ذلك مرض النمذجة، والعلاج الجيني، ويتحامل مسارات التمايز، سبيل المثال لا الحصر. من بين التكنولوجيات المتاحة التحرير، برز كريسبر/Cas9 من العقدية المقيّحة كأداة للاختيار للتحرير الخاصة بالموقع لجينوم حقيقية النواة. كريسبرس يتم الوصول إليها بسهولة وغير مكلفة، وذات كفاءة عالية في هندسة عمليات التحرير المستهدفة. ويتطلب النظام نوكلياسي Cas9 ودليل تسلسل (20-مير) محددة الهدف الجينوم المتاخم 3-النوكليوتيدات "نج" بروتوسباسير-مجاورة-فكرة (بام) لاستهداف Cas9 إلى موضع الجينوم المرجوة، جنبا إلى جنب مع الراسم ملزمة Cas9 عالمي (الحمض النووي الريبي معا تسمى الحمض النووي الريبي دليل واحد أو سجرنا). نقدم هنا خطوة بخطوة بروتوكول لكفاءة توليد اللجنة التوجيهية وحدة تغذية مستقلة وخالية من البصمة ووصف منهجيات للجينوم التحرير للجنة التوجيهية باستخدام مجمعات ribonucleoprotein (رنب) Cas9. جينوم تحرير بروتوكول فعال ويمكن أن يكون متعدد بسهولة من قبل-إلى سجرناس لهدف واحد أو أكثر مع البروتين Cas9 وفي نفس الوقت تقديم في الخلايا. وأخيراً، يصف لنا اتباع نهج مبسطة لتحديد وتوصيف إيبسكس مع التعديلات المطلوبة. أخذت معا، الاستراتيجيات المحددة التي من المتوقع أن تبسيط إنشاء وتحرير للجنة التوجيهية لتطبيقات متعددة.

المقدمة

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية للدولة pluripotent ب overexpression من إعادة برمجة العوامل قد أحدث ثورة في أبحاث الخلايا الجذعية مع تطبيقات في النمذجة المرض والطب التجديدي، وتطوير العقاقير. تتوفر عدة طرق إعادة برمجة غير الفيروسية لإنجاز إعادة برمجة العوامل وتوليد إيبسكس، ولكن هذه العملية هو العمل المكثف وغير فعالة جداً¹. أساليب الفيروسية، على الرغم من كفاءة، ترتبط بمشاكل اندماج الفيروس وتوموريجينيسيتي²^،^،من³⁴. في هذه المخطوطة، نحن تقرير استخدام هيولى سينداي الفيروس لإيصال إعادة برمجة العوامل وإنشاء خطوط خالية من البصمة اللجنة التوجيهية التي تفتقر إلى التكامل من أي تسلسل النواقل الفيروسية في جينومات على⁵. سينداي الفيروسات هو فيروس الحمض النووي الريبي التي هي تضعف خارج الخلية السيتوبلازم ~ 10 مقاطع بعد الإصابة وتنتج عوامل إعادة برمجة في وفرة، مما يؤدي إلى سرعة وكفاءة إعادة برمجة⁶^،⁷. يمكن ثم انتقلت إيبسكس المنشأة إلى متوسط خالية من التغذية لتجنب استخدام الماوس الخلايا الليفية الجنينية (ميفس) كتغذية الخلايا⁸سهولة.

في هذا المنشور، بالإضافة إلى تحديد الفيروس سينداي بوساطة إعادة برمجة، يصف لنا أيضا بروتوكولا محسنة لتحرير إيبسكس، الذي لديه القدرة على إمداد الخلايا البشرية غير محدود مع التعديلات الوراثية المطلوبة للبحث. وقد استخدمنا التكنولوجيا كريسبر/Cas9 لتعديل إيبسكس، الذي يستخدم الآن لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك ضرب الإضافية والضربة القاضية، والحذف الجينوم واسعة النطاق، مكتبة المجمعة الفحص لاكتشاف الجينات، الهندسة الوراثية العديد من الكائنات الحية النموذجية، والجينات العلاج⁹^،^،من¹⁰¹¹. هذا الأسلوب ينطوي على تشكيل مجمعات العقدية المقيّحة-المتأتية Cas9 nuclease و 20-مير دليل الكشف أن تحقيق الاعتراف المستهدفة عن طريق قاعدة الاقتران مع تسلسل الجينوم الهدف المجاورة المتاخمة النوكليوتيدات بروتوسباسير 3 ' تسلسل عزر (بام). نوكلياسي Cas9 يدفع النيوكليوتيدات كسر الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة ~ 3 من الموقع بام، الذي تم إصلاحه بعد ذلك غالباً بنهاية غير المتجانسة الانضمام إلى مسار (نهيج) مما يؤدي إلى عمليات الإدراج أو الحذف في إطار القراءة المفتوحة، والوظيفية مما خروج المغلوب من الجينات¹².

لدينا بروتوكول تحسين يتضمن التفاصيل للثقافة البشرية خلايا البنكرياس، برمجة على ميتوتيكالي إبطال الماوس الخلايا الليفية الجنينية (ميفس) لتحقيق كفاءة أعلى لإعادة برمجة، التكيف اللاحقة إلى ثقافة خالية من علبة التغذية بالورق في ماتريجيل، وصف إيبسكس المنشأة، تسترشد كريسبر تصميم الحمض النووي الريبي والتحضير، وإيصالها إلى إيبسكس كمجمعات رنب وحيد الخلية الفرز لتوليد خطوط الاستنساخ من المحرر إيبسكس وسهلة الفحص وتحديد عمليات التحرير، ووصف استنساخ خلية مفردة. الحذف الجينوم تم إنشاؤها بكفاءة في هذه الدراسة بالأخذ بالبروتين Cas9 وهما كريسبر سجرنا رنب مجمعات للحث على فواصل الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة (دسبس) والجزء الحذف التدخل. يستغل هذا الأسلوب استخدام دليلين لتوليد عمليات الحذف في إطار القراءة المفتوحة، وكفاءة عالية نهيج مما أدى إلى انخفاض عدد استنساخ هذا ضرورة أن تتسم، ومن السهل فرز أولى من الحيوانات المستنسخة بشعري الآلي وحدة التفريد، محلل يفتت. قريبا ستصبح هذه الجينوم فعالة تحرير طرق لتوليد نماذج الأمراض البشرية القائمة على الخلايا الجذعية نهج موحد والروتينية في أي مختبر الخلايا الجذعية. وأخيراً، تحرير الجينوم الدقيقة سيجعل من الممكن تذهب إلى أبعد من الخلايا الجذعية مرض النمذجة ومحتملة يمكن أن تساعد في تحفيز العلاجات المستندة إلى الخلية.