G2-seq: عالية إنتاجية على أساس تسلسل تقنية لتحديد تكرار متأخر مناطق الجينوم

Summary

يصف لنا تقنية للجمع بين التدفق الخلوي وتسلسل الإنتاجية العالية لتحديد مناطق تكرار التأخر الجينوم.

Abstract

وقد وضعت العديد من التقنيات لمتابعة التقدم المحرز في تكرار الحمض النووي من خلال المرحلة S من دورة الخلية. وتم توجيه معظم هذه التقنيات نحو توضيح مكان وتوقيت بدء ازدواج الجينوم بدلاً من إتمامها. ومع ذلك، من المهم أن نفهم مناطق الجينوم التي آخر لإكمال النسخ المتماثل، نظراً لأن هذه المناطق تعاني من مستويات مرتفعة من الكسر الصبغية والطفرات، وأنها كانت مرتبطة بالمرض والشيخوخة. هنا يصف لنا كيف قدمنا تقنية التي استخدمت لرصد بدء النسخ المتماثل بدلاً من ذلك تحديد تلك المناطق للجينوم آخر لإكمال النسخ المتماثل. ويستند هذا النهج مزيجاً من التدفق الخلوي وتسلسل إنتاجية عالية. على الرغم من أن هذا التقرير يركز على تطبيق هذه التقنية على الخميرة، يمكن استخدام هذا النهج مع أي الخلايا التي يمكن تخزينها في سيتوميتير تدفق وفقا لمحتوى الحمض النووي.

Introduction

يتم بدء النسخ المتماثل للجينوم حقيقية النواة في عدة مواقع منفصلة، تسمى أصول النسخ المتماثل للنسخ المتماثل التي تنطلق شوك في كلا الاتجاهين (استعرض في فركوس et al.، 2015¹). أصول تختلف في التوقيت والكفاءة لإطلاق النار على حد سواء، وقد وضعت العديد من التقنيات مراقبة نشاط المنشأ النسخ المتماثل وتوضيح أسباب هذا الاختلاف. النشاط الفردي إلى أصول يمكن أن يستدل من مستويات واحدة-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي²، الذي يشكل حول أصول نشطة، أو باستخدام هلام 2D التفريد لمراقبة النسخ المتماثل محددة وسيطة³، اللتين يمكن اكتشافه مع المسابر المشعة. كل من هذه التقنيات تطبق بسهولة أكبر في S. cerevisiae

Protocol

1-إعداد الخلايا للتدفق الخلوي الفرز

1. تطعيم 15 مل أنابيب الاختبار التي تحتوي على 8 مل من كل من مرق ييبد أن الثقافات تصل كثافة 5 × 10⁶ إلى 1.5 × 10⁷ خلايا كل مل بعد النمو بين عشية وضحاها (انظر مناقشة الملاحظة 1).
2. تدور أسفل خلايا الخميرة (1,400 س ز، في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجة مئوية) في أنبوب الطرد مركزي ملولبة 15 مل لمدة 5 دقائق، ريسوسبيند الخلايا في الإيثانول 70% 1.5 مل، ونقل إلى 1.6 مل [ميكروفوج] أنابيب، ترك هذا الجلوس ح 1 في درجة حرارة الغرفة أو على الأقل 3 ح على الجليد ( ويمكن تخزين إلى أجل غير مسمى في 4 درجات مئوية) (انظر المناقشة نقطة (2)).
3. تدور أسفل خلايا الخميرة في [ميكروفوج] (14,000 س ز، 4 درجة مئوية) لمدة 1....

Results

وقد استخدمنا الإجراء الموضح أعلاه لتحديد المواقع تكرار التأخر في مهدها الخميرة. اختبار هذا النهج باستخدام منطقة تكرار تأخر معروفة على كروموسوم اصطناعي أثبتت هذه التقنية أن تكون دقيقة وموثوق بها. لدينا أيضا أظهرت النتائج الأهمية البيولوجية لإكمال النسخ المتماثل في الوقت المناسب من خلال إظهار أن منطقة تكرار تأخر على كروموسوم 7، التي حددناها كتكرار التأخر استناداً إلى النتائج التي توصلنا إليها G2 seq، قد فقدت تقريبا ثلاثة إضعاف أكثر مما يمكن مقارنتها مراقبة المنطقة¹¹........

Discussion

في حين أن هذا الأسلوب قوية ومستقيمة نسبيا، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لما يلي:

(1) نوصي بأن الثقافات تنمو على الأقل 12 ح قبل أن تصل إلى مرحلة سجل، نظراً لاختلافات واضحة في توزيع دورة الخلية إذا الثقافات يتم حصادها بعد بعد أن بلغت ح الكثافة المطلوب 4 فقط بعد التطعيم. لدينا الافتراض هو أن توزيع دورة الخلية التي وصلت إلى توازن مستقر نسبيا يمثل أفضل توزيع مرحلة سجل "حقيقي" من توزيع التي لا تزال في التمويه عندما تم نقل ثقافة مشبعة في الآونة الأخيرة إلى متوسطة جديدة.

(2) بدلا.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
مجموعة الحمض النووي الجينومي YeaStar	Genesee Scientific	11-323
1 & micro ؛ M SYTOX Green	ThermoFisher	57020	يعلق في 50 ملي سيترات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.2
50 ملي سترات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.2
محلول RNase (0.25 مجم / مل)	Sigma	R6513	0.25 مجم / مل RNaseA معلق في 50 ملي سيترات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.2 ، غلي محلول RNase لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام الأول فقط ، ومن ذلك الحين فصاعدا التخزين عند -20 درجة ؛
محلول البروتيناز K (20 مجم / مل)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	يعلق في 10 ملي تريس ، درجة الحموضة 7.5 ، 2 ملي CaCl2 ، 50٪ جلسرين ، يخزن عند -20 درجة ؛ C
موديل 50 سونيك ديسمبراتور	فيشر FB50A220
البيولوجي BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Zymo-spin III أعمدة	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher	Q32851
Qubit 3.0 مقياس الفلور	ThermoFisher	Q33216
Covaris نموذج LE220 Focused-Ultrasonicator	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT عينة الإعدادية	كيت Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500	أداة Illumina	SY & ndash ؛ 401 & ندش ؛ 2501
برنامج محاذاة GSNAP	برنامج مفتوح المصدر / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap