Method Article

التحديد الكمي للتهجير الوحيدات وتشكيل خلية الرغاوي من الأفراد ذوي الأمراض المزمنة التحريضية

DOI:

10.3791/56293

⸱

October 17th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 2School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 3Department of Infectious Diseases, Monash University, 4University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف لنا وضع بروتوكول لقياس الهجرة الداخلية وحيدات عبر مونولاييرس بطانية البشرية وعلى نضج اللاحقة إلى خلايا الرغاوي. وهذا يوفر طريقة مرنة لتقييم خصائص atherogenic وحيدات معزولة عن الناس مع ظروف المرض المختلفة وتقييم العوامل في الدم التي قد تعزز هذا الميل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض الشريان التاجي (CAD) سبب الرئيسي للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم. تصلب الشرايين، رائدة يسبب كندي، تبدأ بالتهجير وحيدات المناعة الفطرية لمواقع تحريضية المودعة دهن يسمى الشرائط الدهنية، التي موجودة في جدران الشرايين المتوسطة للشرايين الكبيرة. الميزة الرئيسية المسببة للأمراض للآفات في هذه المرحلة المبكرة من تصلب الشرايين هو نضوج وحيدات التي تهاجر إلى الشرايين لتشكيل خلايا الرغاوي أو الضامة محملة بالدهن. أدلة كثيرة تدعم الفرضية القائلة بأن يزداد خطر تصلب الشرايين بالظروف الملتهبة المزمنة المصاحبة لأمراض مثل التهاب المفاصل، وفيروس نقص المناعة البشرية، فضلا عن الشيخوخة عامة، وأن هذا الخطر المتوقع الوحيدات التنشيط. بينما نماذج الماوس يوفر منبرا جيدا التحقيق في دور وحيدات في أثيروجينيسيس في فيفو، أنها تتطلب التعديلات الوراثية استقلاب الكولسترول الطبيعية وتغيير جذري من الماوس العادي الوجبات الغذائية، وحدت من صلاحية دراسة التأثيرات atherogenic الأمراض البشرية المرضية. وهذا دفعتنا إلى وضع نموذج بشرية في المختبر لقياس إمكانات atherogenic وحيدات المعزولة من الأفراد المصابين بمرض محدد الدول. حاليا، تعمل على الحد من النماذج البشرية في المختبر في ذلك أنهم تقييم تشكيل خلية التهجير والرغوة الوحيدات في عزلة. هنا يمكننا وصف بروتوكول الذي ترانسميجراتي وحيدات معزولة من دم المريض عبر الخلايا البطانية البشرية في مصفوفة الكولاجين من نوع 1، وميلها إلى أن تنضج إلى خلايا الرغاوي في وجود أو عدم وجود الدهن الخارجية يقاس. تم التحقق من البروتوكول لاستخدام الإنسان وحيدات تنقيته من الأفراد المصابين بعدوى فيروس نقص المناعة البشرية والمسنين فيروس نقص المناعة البشرية وقاية الأفراد. هذا النموذج هو تنوعاً ويسمح الوحيدات التهجير والرغوة تشكيل خلية تقييم استخدام أما مجهرية أو التدفق الخلوي، فضلا عن السماح لتقييم العوامل atherogenic الموجودة في المصل أو البلازما.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهجير الوحيدات هو خطوة حاسمة في تطوير لوحة تصلب الشرايين قد تؤدي إلى تجلط الدم والسكتة الدماغية واحتشاء عضلة القلب. تطوير لويحات تصلب الشرايين من الشرائط الدهنية، عموما موجودة في مواقع تدفق الدم المنخفض متذبذبة في المتوسطة للشرايين الكبيرة، حيث يساهم في تفعيل غشائي الدهن المودعة والمترجمة التهاب1. وحيدات ويجند إلى خلايا بطانية في الشرائط الدهنية عن طريق البروتينات chemotactic الوحيدات (مثل CCL2)، وترانسميجراتي في البطانية2. وبعد التهجير، قد تشكل وحيدات الضامة atherogenic، محملة بالدهن تسمى خلايا الرغاوي نتيجة لامتصاص الدهون، والدهون التوليف، أسفل-تنظيم افلوكس نسبة الكولسترول في الدم أو مزيج من العوامل المذكورة أعلاه. أيضا قد وحيدات تتراكم الدهون في الدورة الدموية وقد 'مزبد' النمط الظاهري، ربما مؤهبة الخلايا للرغوة خلية تشكيل3،4. خلايا الرغاوي هي السمة المميزة للشرائط الدهنية ولويحات تصلب الشرايين في مرحلة مبكرة وتشكيلاتها ويتأثر بالدهن ووسطاء التهابات5. وبدلاً من ذلك، وحيدات لديها القدرة على عكس ترانسميجراتي من الشريان في مجرى الدم6، وبالتالي إزالة الدهن من البطانية والنيابة للحفاظ على صحة الشريان.

تحديد ميل وحيدات إلى ترانسميجراتي عبر البطانة الشريانية وشكل رغوة الخلايا البطانية، أو لعكس ترانسميجراتي وتحمل الدهون خارج اللوحة، وهو مطلب أساسي لفهم دور التنشيط الوحيدات في زيادة خطر تصلب الشرايين. نماذج الماوس من الأوغاد مثل تصلب الشرايين هامة في توضيح المعلومات في الوقت الحقيقي في فيفو الانتصارات الدهنية/تصلب الشرايين البلاك التنمية. ومع ذلك، تتطلب هذه النماذج من تعديلات وراثية الكولسترول الطبيعية تجهيز قدرات هذه الحيوانات عادة ما تكون مقترنة بتغييرات جذرية في النظام الغذائي (مثل نموذج النظام الغذائي نوع الذين/الغربية)7،8، وبالتالي، حمل تراكم غير الفسيولوجية لتعميم المادة الدهنية المستويات الذي وضع اللوحة محرك الأقراص. قد تكون هذه النماذج محدودة تتصل بالظروف البشرية الالتهابات المزمنة مثل الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، التي لا ترتبط بزيادة تعميم مستويات low-density lipoprotein (LDL) أو الكوليسترول. وعلاوة على ذلك، جعل الاختلافات بين البشر والفئران في البيولوجيا الوحيدات اختبار المناعية أسئلة فيما يتعلق بمدى ملاءمة للفئات السكانية الفرعية وحيدات (مثل وحيدات الوسيطة (CD14++CD16+))9 صعبة. هذا مهم عند دراسة آليات القيادة الأمراض القلبية الوعائية كما التهم الوحيدات الوسيطة بشكل مستقل التنبؤ بأحداث القلب والأوعية الدموية10،11. على الرغم من وجود فحوصات لقياس التتابع أما الوحيدات التهجير أو الرغوة تشكيل الخلية في عزلة، تم التحقق من لا تحليل في المختبر للتحديد الكمي لكل جوانب atherogenesis المبكر باستخدام نفس الخلايا من الأفواج السريرية. نماذج ترانسويل الاستفادة من نظام مجلسين Boyden معدلة حيث يتم تحميلها إلى قاعة كبار الخلايا وترانسميجراتي عبر الحاجز البلاستيكية المسامية أو أحادي الطبقة خلية في مجلس النواب الذي عادة ما يحتوي على وسائط الإعلام مع تشيمواتراكتانت12 , 13-حين تستخدم على نطاق واسع لتحليل الكريات البيض التهجير، هذه النماذج لا تتضمن عموما طبقة تمثل البطانية، أسفر عن الخلايا ترانسميجراتيد هاجروا إلى الحل، ولا تسمح بقياس الخلية الرغوة تشكيل أو الهجرة العكسية من نفس الخلايا. على العكس من ذلك، نماذج لتشكيل خلية الرغاوي لا تراعي أي تغييرات ترانسميجراتوري الناجمة عن وحيدات أو آثار غشائي التنشيط التي من المعروف أن تسهم رغوة الخلية تشكيل14. وعلاوة على ذلك، حمل هذه النظم رغوة تشكيل خلية من الضامة التقيد بلوحات ثقافة الخلية بإضافة تشبع تركيزات خارجية المؤكسد low-density lipoprotein (أوكسلدل)15،16، ومحفِّز رئيسي تشكيل خلية الرغاوي. LDL المستخدمة في هذه النماذج هي غالباً ما تتأكسد بغير-فيزيولوجيا-العمليات ذات الصلة مثل CuSO4 العلاج17، ولذلك التشكيك في أهمية الفسيولوجية للدراسات باستخدام هذه النماذج.

هنا يصف لنا مقايسة التي يوضحها التهجير الوحيدات وتشكيل خلية الرغاوي من نفس الخلايا التي لا تتطلب إضافة أوكسلدل الخارجية، وبالتالي تحسين نمذجة دور وحيدات في تشكيل خلية الرغاوي. هذا النموذج قد وضعت أصلاً من قبل البروفيسور ويليام مولر (جامعة نورث وسترن، شيكاغو)18، وقد تم صقل في المختبر لتقييم السابقين فيفو أثيروجينيسيتي وحيدات معزولة تحت عدم تفعيل شروط من الأفراد مع الظروف الكامنة وراء الالتهابات المصاحبة للأمراض مثل الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية19 ، فضلا عن الشيخوخة20، التي ترتبط بزيادة خطر الإصابة بتصلب الشرايين. هذا النموذج أيضا منبرا للرد على الأسئلة البيولوجية الأساسية فيما يتعلق بالميل لمجموعات فرعية مختلفة الوحيدات إلى شكل رغوة خلايا20، تأثير غشائي التنشيط بواسطة السيتوكينات مثل تنف في تشكيل خلية الرغوة14 ، وخصائص الهجرة وحيدات مثل عمق وسرعة من التهجير في الهلام19. وعلاوة على ذلك، تشكيل خلية التهجير والرغوة الوحيدات يمكن قياسها كمياً باستخدام الفحص المجهري القياسية، يعيش تصوير الخلية، التدفق الخلوي وتصوير التدفق الخلوي، وبالتالي، توفر طريقة مرنة لتقييم دور وحيدات في أثيروجينيسيس.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: أجريت جميع التجارب باستخدام العينات البيولوجية البشرية بموافقة الأخلاق من "الفريد مستشفى أخلاقيات اللجنة الإنسان"، ملبورن. أجريت جميع التجارب في خزانات "السلامة الثاني فئة" ما لم يتم تحديد. " بريوارميد " يشير إلى كواشف حرارة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.

1. الجل الكولاجين الليفي إعداد من نوع I: 1 يوم

  1. تحضير بلمرة المواد الهلامية الكولاجين بشكل تسلسلي إضافة وخلط 35.7 ملم هيدروكسيد الصوديوم، 0.71 x M199، حمض الخليك 4.58 مم و 1.71 ملغ/مل النوع الأول من الكولاجين الليفي في البوليسترين 5 مل أنبوب وفقا الجدول 1-
    ملاحظة: تأكد من أن الكولاجين جيدا مختلطة بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات من أجل وقف تشكيل الكولاجين ' جيوب ' في الخليط هلام. إعداد المواد الهلامية 4-6 كل شرط الاختبار للفحص المجهري أو 15 الهلام كل شرط الاختبار لقياس التدفق.
    2. مرة جيد
  2. ميليلتر 50 مختلطة، اليكووت من خليط جل الكولاجين في كل بئر من صفيحة العقيمة زراعة الأنسجة 96-جيدا مغلوطاً. لا تستخدم خارج الصفوف والأعمدة، ولكن ملء هذه مع 200 ميليلتر من 1 x Dubecco ' s الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لحماية المواد الهلامية من جفاف. احتضان لوحات في 37 °C/5% CO 2 لح 2 للسماح الكولاجين بلمرة.
    ملاحظة: وضع اللوحات مباشرة على رفوف معدنية نظيفة في الحاضنة لضمان توزيع الحرارة حتى-
  3. عقب الحضانة، تراكب المواد الهلامية مع 150 ميليلتر من 1 × M199 تستكمل (انظر الجدول للمواد)، واحتضان لمدة 5 أيام حتى استخدام.

2. توسيع المخزن هوفيك: 1 يوم

  1. التسمية ومعطف قطرها 10 سم طبق بيتري مع 1 مل من 50 ميكروغرام/مل فيبرونيكتين المخفف في برنامج تلفزيوني x 1 واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 10
    2. الوريد
  2. ذوبان مختبرين للسرة البشرية الأولية cryopreserved الخلايا البطانية (هوفيك، 1.0 × 10 6 خلايا) في 10 مل M20.
    ملاحظة: ينبغي أن تعد هوفيك كما تم وصفه سابقا 21 والمستخدمة في عدد مرور منخفضة (< مرور 4). قد يتم استبدال هوفيك مع خلايا بطانية الشريان التاجي البشري هنا.
  3. ريسوسبيند هوفيك في 10 مل M20 وإضافة إلى الطبق المغلفة فيبرونيكتين، يسفط فيبرونيكتين الزائدة قبل إضافة الخلايا، وثقافة لالتقاء (5 أيام تقريبا) واستبدال وسائط الإعلام في يوم 3-

3. استزراع "هوفيك أحادي الطبقة" على "المواد الهلامية الكولاجين": 5 يوم

  1. في اليوم الخامس، فصل هوفيك يسفط الثقافة طافية من طبق بيتري وتجرف الوسائط التي تحتوي على المصل مع 10 مل من المصل خالية M199.
  2. إضافة 5 مل 0.05% التربسين/0.53 يدتا M199 إلى هوفيك واحتضان لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تهتز برفق حتى فصل الخلايا.
  3. بمجرد فصل، بسرعة شطف طبق بيتري مع 5 مل M20 ونقل الوسائط التي تحتوي على خلايا لأنبوب 10 مل.
  4. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، نضح المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في 200 ميليلتر من M20 وعد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
  5. ريسوسبيند الخلايا إلى 2.0 × 10 5 خلايا/مل في M20 ونضح M199 على المواد الهلامية من لوحة 96-جيدا (الخطوة 1، 3) وإضافة 100 ميليلتر من حراكه هوفيك (2.0 × 10 4 خلايا) إلى كل جل الكولاجين أعد (الخطوة 1، 2) أعلاه. الثقافة لوحات 3 أيام في 37 °C/5% CO 2-
    ملاحظة: قد أكد سلامة أحادي الطبقة هوفيك بعد 3 أيام من نترات الفضة تلطيخ 22 أو إيمونوهيستوتشيميستري ل البروتينات مفرق ضيق 23 في هذه المرحلة. المواد الهلامية الإضافية يجب أن تكون معدّة لهذا الغرض.

4. التنشيط "هوفيك أحادي الطبقة" والعزلة/تفعيل وحيدات للتهجير: 8 يوم

  1. في يوم 8، تنشيط كل أحادي الطبقة هوفيك قبل إضافة وحيدات يسفط M20 الوسائط تراكب المواد الهلامية وإضافة 100 ميليلتر من 10 نانوغرام/مل TNFα البشرية في M20 كل جيل. احتضان في 37 °C/5% CO 2 ل 4 ﻫ.
    ملاحظة: شروط عدم تفعيلها هوفيك يمكن أيضا أن تدرج إذا لزم الأمر كعناصر تحكم-
    2. حبة وحيدات
  2. خلال 4 ح هوفيك خطوة التنشيط، عزل من ببمكس المغناطيسي باستخدام تقنيات لتحديد صورة سلبية للخلايا وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s. ينبغي أن تستخدم كحد أدنى 6.5 × 10 6 ببمكس في هذه الخطوة بغية استرداد موثوق 3.0 × 10 5 وحيدات المطلوبة لشرط واحد، كما تمثل وحيدات عادة حوالي 10-15% ببمكس-
    ملاحظة: لتقييم تأثير التنشيط الوحيدات قبل تشكيل خلية التهجير والرغوة الوحيدات، يمكن تنشيط وحيدات في هذه المرحلة. يمكن أن تكون وحيدات معزولة من ببمكس المذابة إذا لزم الأمر (أي عينات المرضى المخزنة). يمكن إعداد مجموعات فرعية الوحيدات معزول بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز لإضافة إلى المواد الهلامية (الشكل 1).

5. التهجير وحيدات البشرية الأساسية: 8 يوم

  1. لقياس الهجرة الوحيدات، قم بإزالة الوسائط التي تحتوي على TNFα وغسل الهلام مرتين مع 100 ميليلتر M199 عن طريق إضافة وإزالة الوسائط. بعد الغسيل، إضافة 2.0 × 10 5 طازجة معزولة أو مذاب وغسلها cryopreserved ببمكس أو 5.0 × 10 4 طازجة معزولة وحيدات أو تنقية مجموعات فرعية الوحيدات إلى هوفيك مونولاييرس في 100 ميليلتر M20. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 للسماح بالهجرة إلى الأمام من وحيدات في الهلام. فمن الأفضل أن تسمح 6 آبار لكل حالة تجريبية درست.
    ملاحظة: لتقييم تأثير المصل الذاتي على تشكيل خلية التهجير والرغوة، احتضان خلايا مع M20 تحتوي على تركيز المصل المانحة إبطال الحرارة المرغوبة ومقارنة للظروف مع عنصر تحكم مصل دم البشري مجمعة. ويمكن إضافة الكريات البيضاء خلاف وحيدات في هذه المرحلة. إذا كان التحقيق في تأثير أنواع محددة من الدهون/الدهون (مثلاً، HDL، أوكسهدل)، تنفيذ كافة الخطوات التالية مع وسائل الإعلام الحرة المصل الذي يحتوي على 20-50 ميكروغرام/مل الدهون.
  2. بعد 1 ح من التهجير إلى الأمام، جمع الخلايا غير ترانسميجراتيد بغسل الهلام مرتين مع 100 ميليلتر من عطا في برنامج تلفزيوني 1 x بريوارميد 1 مم، ومرة مع 100 ميليلتر M199 (نفس الطرد المركزي الشروط)، تجمع سوبيرناتانتس من كل بئر من نفس حالة تجريبية (عادة 6 آبار) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل على الجليد. الطرد المركزي الخلايا غير ترانسميجراتيد في 4 درجات مئوية، 300 غرام x لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في 30 ميليلتر 1 x PBS.
  3. عد الخلايا التي يتم جمعها في المادة طافية لتحديد عدد الخلايا ترانسميجراتيد إلى الأمام-
  4. النسبة المئوية للخلايا ترانسميجراتيد إلى الأمام عازمة على النحو التالي:
    figure-protocol-1 figure-protocol-2 figure-protocol-3
  5. تغطي غسلها المواد الهلامية التي تحتوي على خلايا ترانسميجراتيد مع 100 ميليلتر M20 واحتضانها حاء 48 مزيد
  6. ح بعد 48، جمع المادة طافية والخلايا غير ترانسميجراتيد يغسل مرتين مع 100 ميليلتر بريوارميد 1 مم عطا/برنامج تلفزيوني، جمع وتجميع المادة طافية من كل شرط كما هو الحال في الخطوة 5، 2-
    ملاحظة: يمكن اختبار النمط الظاهري لعكس الخلايا ترانسميجراتيد على هذه الخلايا وأولووينج القياسية التدفق الخلوي تلطيخ البروتوكولات.
  7. الطرد المركزي الخلايا عند 4 درجة مئوية، 300 غرام x لمدة 5 دقائق وريسوسبيند الخلايا في 30 برنامج تلفزيوني 1 x ميليلتر. حساب عدد الخلايا وتحديد صلاحية عن طريق تلطيخ تريبان الأزرق-
  8. تحديد النسبة المئوية للخلايا ترانسميجراتيد العكسية باستخدام المعادلة التالية:
    figure-protocol-4
    ملاحظة: المحاسبة للعدد الإجمالي للخلايا ترانسميجراتيد إلى الأمام يعطي مؤشرا أكثر دقة من الهجرة العكسية كما هو الهجرة إلى الأمام من المحتمل ستكون 100 ٪.
  9. للتحليل بالفحص المجهري، إصلاح المواد الهلامية بإضافة 100 ميليلتر 2% فورمالدهايد (تركيز النهائي) لكل بئر، وتغطي اللوحات في الألومنيوم إحباط وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى التحليل. للتدفق الخلوي، لا تصلح الخلايا في هذه المرحلة. انظر البروتوكولات أدناه من أجل الفحص المجهري (الجزء 6) أو تحليل التدفق الخلوي (القسم 7).
    تنبيه: الفورمالدهيد السامة والمسببة للتآكل؛ استخدام معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية). وينبغي توخي الحذر عند إضافة الفورمالدهيد، إلا أن هذه الخطوة لا تحتاج إلى القيام بها في غطاء دخان بسبب التركيز المنخفض المستخدمة.

6. كوانتيتيشن "خلايا الرغاوي" والضامة بالفحص المجهري (النفط-الأحمر وصمة عار س)

  1. إزالة والفورمالديهايد وتغسل المواد الهلامية مع 100 ميليلتر من الميثانول 50% (v/v) لمدة 5 دقائق وثم 100 ميليلتر 78% (v/v) ميثانول على 15 دقيقة
    ملاحظة: قد يتم تنفيذ الخطوات المصبوغة على مقاعد البدلاء المختبر ولا في خزانة "الصف الثاني واقية".
  2. وصمة عار للدهن قطرات بإضافة ميليلتر 100 من الطازجة 0.2% (w/v) "س" الأحمر النفط (انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل) ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
  3. إزالة وصمة عار الزائدة بالغسيل المواد الهلامية 4 مرات مع 100 ميليلتر من الميثانول 78% (v/v)، يسفط وتجاهل المادة طافية بعد كل واشنطن
  4. كونتيرستاين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 100 ميليلتر من جيمسا، تضعف 01:10 في الماء المقطر.
  5. نضح وصمة عار جيمسا وغسل الهلام مرة واحدة مع الماء.
  6. لفصل المواد الهلامية من اللوحة، ريم الآبار باستخدام إبرة ز 21، مع المجسم مشطوف الحواف التي تواجه الخارج، حول حافة جل.
  7. لتحميل المواد الهلامية على شريحة مجهر، لكمه ثقوب اثنين (6.35 مم) في شريط 2.54 سم × 1.5 سم من الشريط على الوجهين. إصلاح الشريط إلى جانب مجهر قياسية وإزالة طلاء واقية من الأعلى-
    1. إضافة قطره ماء الثقوب في الشريط باستخدام ماصة نقل. استخدام الملقط، بلطف نقل المواد الهلامية الثقوب في الشريط والغلاف مع ساترة زجاج 1.5 حجم. اضغط برفق على ساترة التمسك بالشريط-
  8. بحث مع التباين التدخل التفاضلية مشرق الميدان مجهرية باستخدام 40 X الهدف المعني مجهر مقلوب. التمرير والتكبير
    1. إحضار المونولاير هوفيك إلى التركيز على 40 س ' في ' الهلام، عد الخلايا الضامة/رغوة طوال كامل عمق الهلام. كرر ثلاثة حقول عرض متميزة تقع على مسافات مماثلة من الحافة من الجل بغية التقليل إلى أدنى حد ممكن آثار حافة. وهذا يضمن عمق جل يتوافق بين عد المناطق.
      ملاحظة: نقاط الخلايا في الجل أما خلايا الرغاوي (يعرف الخلايا التي تحتوي على > 1/3 السيتوبلازم بها كالنفط الأحمر "يا" الملون قطرات الدهن) أو الضامة ضمن ح 2 من تصاعد في الشرائح ( الشكل 2). تشكيل خلية الرغاوي يتم التعبير عنها كنسبة مئوية خلايا الرغاوي بالنسبة إلى العدد الإجمالي للخلايا التي تم ترحيلها، ويعبر عنه حسب التهم الوسيط في 3 حقول لعرض دراسة للمواد الهلامية 6 كل حالة، ولذلك متوسط القياسات 18 كل شرط. يتم عرض مثال من عدد خلايا الخام من تجربة نموذجية في الجدول 2-
      ملاحظة: تصنيف خلية بلعم مقابل خلية رغوة واسطة الفحص المجهري هو ذاتي ونتيجة لذلك يمكن أن تعتمد على المحقق. في الدراسات السريرية، حيث يتم إجراء التجارب على مدى فترة ممتدة من الوقت، من المهم لعد جميع المراد تنفيذها اعماها محقق واحد. وتقدم أمثلة من خلايا الرغاوي والضامة في المواد الهلامية في الشكل 2-

7. تحليل "الخلايا ترانسميجراتيد" "التدفق الخلوي"

  1. فينوتيبيكالي تميز خلايا الرغاوي والضامة بعد الهجرة ترانسيندوثيليال، وهضم المواد الهلامية بإضافة 100 ميليلتر من 37 درجة مئوية بريوارميد 1 ملغ/مل كولاجيناز د المخفف في M199 إلى كل الخير واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 °C/5% CO 2-
    ملاحظة: وضع لوحات 96-جيدا مباشرة على رفوف معدنية نظيفة في الحاضنة لضمان توزيع الحرارة حتى-
  2. عقب الحضانة، مسرات الجل استخدام تلميح ماصة 200 ميليلتر واحتضانها 20 دقيقة إضافية في 37 °C/5% CO 2-
  3. يهضم مرة تماما، تصفية وتجمع المواد الهلامية تكرار هضمها من خلال 35 ميكرون النايلون مش توج أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية على الجليد، ويغسل مرة واحدة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية يغسل (انظر الجدول للمواد) في 4 درجات مئوية، 300 غ. س ريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية واشنطن
  4. احتضان الخلايا الناتجة مع الأجسام المضادة مترافق fluorophore محددة لعلامات المظهرية أو الوظيفية داخل الخلايا السطحية/الاهتمام باستخدام البروتوكولات القياسية التدفق الخلوي وعلامة خلية يعيش الموتى و CD45.
    ملاحظة: إعداد مراقبة أنابيب للتعويض باستخدام فلوروفوريس المناسبة والخرز التعويض المفتش العام. كما يمكن جمع الخلايا المستخرجة على الشرائح الزجاجية للفحص المجهري الفلورة سيتوسبينينج. بدلاً من ذلك، قمنا بنجاح بجمع الخلايا باستخدام هذا البروتوكول للتقييم عن طريق التصوير التدفق الخلوي-
  5. الحصول على الخلايا باستخدام سيتوميتير تدفق، والقيام بالتعويض كما هو مطلوب.
    ملاحظة: خلايا الرغاوي/الضامة قد لا تشكل السكان الفردية باستخدام خصائص الضوء المبعثر وقد تختلف اختلافاً كبيرا في الحجم والشكل، تعيين مبعثر الأمام الليبرالية (FSC) وبوابات مبعثر (SSC) الجانب بغية التقاط كافة الخلايا التي تم ترحيلها كما هو موضح في < فئة قوية = "إكسفيج" > 3A الرقم-
  6. بعد الاقتناء، القيام تحليل البيانات باستخدام برنامج التدفق الخلوي. لتحديد الخلايا التي تم ترحيلها، أولاً تحديد الخلايا سلبية بالنسبة لعلامة يعيش الميت كما هو موضح في الشكل 3 (ب). بعد ذلك، أداء لتمييز الخلايا المفردة بإنشاء بوابة ضيقة حول الخلايا على قطعة أرض مقابل ارتفاع SSC SSC-منطقة-
  7. حدد CD45 + الخلايا وبوابة السكان الرئيسية للخلايا التي تم ترحيلها في مؤامرة منتدى التعاون الأمني/SSC كهذه الخلايا الضامة/رغوة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحديد الكمي للتهجير الوحيدات

وحيدات يتم إضافتها إلى النموذج كما هو موضح في الشكل 1، والمواد الهلامية ستة مستعدون لكل شرط. وحيدات للهلام 6 كل الجهات المانحة (أي5.0 × 104 وحيدات كل المواد الهلامية هلام 6 = 3.0 × 105 وحيدات كل الجهات المانحة) هي حراكه إلى وحدة تخزين نهائي من 600 ميليلتر M199 الوسائط التي تحتوي على الدهون المصل/عزل المطلوبة. خلايا (أ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتيح البروتوكول الموصوفة هنا طريقة تنوعاً وفسيولوجيا ذات الصلة لتقييم أثيروجينيسيتي وحيدات من الأفواج السريرية البشرية، عن طريق الجمع بين التهجير الوحيدات وتشكيل خلية الرغاوي. هذا الطراز يوفر مزايا أكثر من الأساليب البديلة لتشكيل خلية رغوة كما أنه يأخذ في الاعتبار أثر التهجير الوحيدات في تشكيل خلية الرغاوي ويسمح بقياس الهجرة العكسية6 بالإضافة إلى الأصيل الميل وحيدات لتنضج إلى خلايا الرغاوي في وجود أو عدم وجود عوامل خارجية. وعلاوة على ذلك، دور التنشيط غشائي أيضا أخذ في الاعتبار كما أظهرنا ذلك أكسد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب الاعتراف بامتنان عمل البروفيسور ويليام مولر والدكتور كلير ويستهوربي لدورها الرئيسي في تنمية تكرارات السابقة من هذا الطراز. الكتاب أيضا يود أن يشكر الأساسية "أمريب التدفق الخلوي" لفرز الوحيدات مجموعات فرعية و "الفريد المستشفى المعدية مرض الوحدة" السريرية البحثية الممرضات لتجنيد أفراد فيروس نقص المناعة البشرية + لبعض الدراسات. الكتاب امتنان الاعتراف بمساهمة في هذا العمل "فيكتوريا الهياكل الأساسية لدعم البرنامج التشغيلي" تلقاه المعهد برنيت. ﻷعمالهم معتمد من قبل معهد ملبورن الملكي الجامعة نائب مدير الجامعة "زمالات ما بعد الدكتوراه". وأيد هذا العمل منحة مشروع NHMRC 1108792 التي منحت لجعفر و AH. معتمد المعارف التقليدية التي تمنح K08AI08272 المعاهد الوطنية للصحة، "منح" المعاهد الوطنية للصحة/نكتس # UL1TR000124 من المعاهد الوطنية للصحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي > كواشف تحضير الجل < / قوي >
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش221465-500G0.1 م هيدروكسيد الصوديوم مخفف في H2< / sub>0
10x M199Sigma-AldrichM0650
AcCOOHSigma-Aldrich695092-100ML20 ملي مولار حمض الخليك المخفف في H2< / sub>0
Cultrex Bovine Collagen أناR & D Systems3442-050-01النوع الأول ليفي الكولاجين
<قوي>الاسم< قوي><قوي>الشركة الكتالوج رقم تعليقات
Cell culture
M199Life Technologies11150-059وسائط M199 التي تحتوي على أملاح إيرل ، L-glutamine و 2.2 جم / لتر بيكربونات الصوديوم.
Media مكملة ب 100 & micro ؛ جم / مل L-glutamine   ؛ و 100 U / مل بنسلين / ستربتومايسين   ؛
M20مكمل M199 يحتوي على 20٪ مصل مجمع أو متبرع معطل بالحرارة.
يمكن إضافة أنواع الدهون الفردية مثل LDL إلى M199.
HUVEC) من الحبل السري المتبرع بها بموافقة مستنيرة وموافقة أخلاقية. يمكن أيضا شراء HUVEC المعزولة تجاريا.
البطانية للشريان التاجي البشرييمكن عزل الخلايا البطانية للشريان التاجي البشري الأولي من الشرايين المتبرع بها بموافقة مستنيرة وموافقة أخلاقية. يمكن أيضا شراء الخلايا المعزولة تجاريا.
EDTABDH Merck10093.5Vحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) - 0.5 م ، درجة الحموضة 8.0
EGTAسيجما ألدريتشE3889-500Gالإيثيلين جلايكول مكرر (&بيتا ؛ أمينوإيثيل الأثير) - N ، N ، N ، N '، N '، N'-حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) - 1 ملي مولار ، درجة الحموضة 8.0
0.05٪ التربسين EDTAGibco25300-0540.05٪ تريبسين / 0.53 EDTA (1X)
L-glutamineGibco25030-081L-جلوتامين (200 ملم)
البنسلين / الستربتومايسين   ؛Gibco15140-122البنسلين / الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل البنسلين و 10,000 ميكرو ؛ جم / مل ستربتومايسين)
مصل ربلة الساق حديث الولادةجيبكو16010-142مصل ربلة الساق حديث الولادة: نيوزيلندي الأصل
فيبرونيكتينسيجما ألدريتشF1056-1MGفيبرونيكتين - 50 وميكرو ؛ جم / مل كميات محضرة وتخزينها
PBS (1x)Gibco14200-075ملحي ذو فوسفات Dulbecco (10x): يخفف إلى 1x مع H 2< / sub>0
0.1٪ TNFGibcoPHC3015نخر الورم البشري المؤتلف - أعيد تكوينه في H20 وتخزينه في 10 & micro ؛ جم / مل aliquots
البروتين الدهني منخفض الكثافةMerck MilliporeLP2-2MGالبروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL)
<قوي>الاسم< قوي>قوي<قوي>الشركة<قوي>رقم الكتالوج<قوي>تعليقات
><قوي>المجهر1
أو 2٪ فورمالديهايدPolysciences40181 أو 2٪ فورمالديهايد مخفف بمعقم H2< / sub>0
50٪ و 78٪ ميثانولAjax Finechem318-2.5L GL50٪ أو 78٪ v / v ميثانول ، مخفف ب H2< / sub>0
زيت أحمر O صبغةSigma-AldrichO0625-25Gمخفف إلى 2 مجم / مل في 22٪ 1M هيدروكسيد الصوديوم و 78٪ (حجم / حجم)
مجهرالميثانولS41104AMKشرائح مجهر مزدوجة بلورية 45 درجة (25 × 76 مم) زلات
الغطاءMenzel-Gl & auml ؛ ser MENCS224015GP22 × 40 مم # 1.5 حجم غطاء زجاجي ينزلق
شريط على الوجهين3M Scotch4011شريط تثبيت خارجي فائق القوة (25.4 مم × 1.51 م)
صبغة GiemsaMerck Millipore1.09204.0500محلول أزور يوزين الميثيلين الأزرق من Giemsa (مخزون مخفف 1:10 بوصة H2< / sub>0) ثقب
واحد محمول باليد (لكمة 6.35 مم)
<قوي>الاسم<قوي>الشركة رقم الكتالوجComments
Flow Cytometry
Collagenase DRoche Diagnostics11088858001Collagenase D المخفف في وسائط M199 إلى 1 ملغ/ملليتر 
35 & الميكرو; م شبكة نايلون مغطاة البوليسترين أنابيب FACS BDBiosciences35223535 & micro ؛ م شبكة نايلون مغطاة بالبوليسترين أنابيب FACS
لايف / ميت قابل للإصلاح صفراء خلية ميتة وصمةعار تقنياتالحياة L34959حية / ميتة قابلة للإصلاح وصمة عار الخلايا الميتة الصفراء
FACS غسلالتحضير عن طريق خلط 1 × PBS < sup >-< / sup> و 2 ملي مولار EDTA و 1٪ مصل العجل المولود حديثا
< قوي > الاسم < / قوي >< قوي > الشركة < / قوي >< قوي > رقم الكتالوج < / قوي> <قوي>تعليقات
<قوي>أدوات بلاستيكية
96 لوحة بئرNunclon167008دلتا سطح مسطح القاع 96 صفيحة بئر
10 سم طبق بتريTPP93100طبق بتري معقم 10 سم طبق بتري
1.5 مل أنابيبإيبندورف Eppendorf0030 125.150أنابيب Eppendorf
ماصةSamco Scientific222-20Sماصة نقل معقمة (1 مل ، لمبة كبيرة)
يمكن عزل الخلايا البطانية الأولية للحبل السري البشري (الخلايا محلول عامل شرائح نقل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Napoli, C., et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).
  3. Xu, L., et al. Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).
  4. Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets. Scientific Reports. 6, 20038(2016).
  5. Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease. Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).
  6. Llodrá, J., et al. Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).
  7. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal Models of Atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
  8. Meir, K. S., Leitersdorf, E. Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).
  9. Hilgendorf, I., Swirski, F. K. Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease. Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).
  10. Rogacev, K. S., et al. Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).
  11. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography. J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).
  12. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).
  13. Boyden, S. The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes. J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  14. Westhorpe, C. L. V., et al. Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model. Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).
  15. Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).
  16. Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).
  17. Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. Oxidized Low-Density Lipoprotein. Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).
  18. Muller, W. A., Weigl, S. A. Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay. J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).
  19. Maisa, A., et al. Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration. AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).
  20. Angelovich, T. A., et al. Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms. Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).
  21. Westhorpe, C. L. V., et al. Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages. J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).
  22. Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).
  23. Müller, A. M., et al. Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro. Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).
  24. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).
  25. Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
  26. Gacka, M., et al. Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes. J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).
  27. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease. Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Monocyte TransmigrationFoam Cell FormationHuman Endothelial CellsCollagen MatrixFlow CytometryMicroscopy AnalysisOxidized LDLPatient Blood SamplesAtherogenic PotentialCollagen Gel Preparation

Related Articles