مقالة منهجية

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

DOI:

10.3791/56294

⸱

أكتوبر 2, 2017

 ,  ,  , 
1Diamond Light Source, Harwell Science & Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science & Innovation Campus

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد بروتوكول مبسط للقيام توصيف البيوكيميائية وهيكلية واسعة بروتين ملزمة الركازة الكربوهيدرات من العقدية الرئوية .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطوير اللقاحات ومضادات جديدة العقدية الرئوية (بنيوموكوككوس) ضرورية لوقف الارتفاع السريع في سلالات مقاومة متعددة. الكربوهيدرات الركازة ملزم البروتينات (سببس) تمثل أهدافا قابلة للاستمرار لتطوير لقاحات القائم على البروتين ومضادات جديدة بسبب تلك الترجمة خارج الخلية والدور المركزي لاستيراد الكربوهيدرات الأيض المكوّرات الرئوية، على التوالي. الموصوفة هنا هو بروتوكول متكامل ترشيد القيام بوصف شامل ل SP0092، التي يمكن أن تمتد إلى سائر الكربوهيدرات سببس من بنيوموكوككوس والبكتيريا الأخرى. هذا الإجراء يمكن أن يساعد تصميم الهيكل القائم لمثبطات لهذه الفئة من البروتينات. عرضت في الجزء الأول من هذه المخطوطة بروتوكولات لتحليل الكيمياء الحيوية بمقايسة التحول الحراري، متعدد زاوية تشتت الضوء (مالس)، وحجم الاستبعاد اللوني (ثانية)، وتحسين الاستقرار وتجانس العينة الموجهة إلى تبلور المحاكمات وذلك يعزز احتمالات النجاح. ويصف الجزء الثاني من هذا الإجراء وصف استخدام بيامليني السنكروتروني حيود شاذة الطول موجي الانضباطي، وبروتوكولات جمع البيانات لقياس البيانات التي يمكن استخدامها لحل البروتين تبلور بلورات الاستراتيجية والخطة الاستشرافية الهيكل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

س. الرئوية (بنيوموكوككوس) بكتيريا إيجابية المقيمين أعراض في الخطوط الجوية العليا من الجهاز التنفسي البشرية مع القدرة على الهجرة إلى منافذ عقيمة عادة يسبب التهاب الإذن، الالتهاب الرئوي، وتعفن الدم، تسمم الدم، و التهاب السحايا،من12. وعلاوة على ذلك، هو عدوى المكوّرات الرئوية السبب الرئيسي للالتهاب الرئوي المجتمع المكتسبة، مما يسهم في أعباء الاقتصادية والطبية في جميع أنحاء العالم3،4. سلالات مقاومة للمضادات الحيوية من س. الرئوية قد انتشرت في جميع أنحاء العالم، وعلى الرغم من أن ساعدت سبعة-بالينت وثلاثة عشر-بالينت بروتين المكوّرات الرئوية المتقارنة لقاح خفض معدل مقاومة مضادات الميكروبات، استبدال سلالات من وقد برزت استخدام اللقاحات قد أدت إلى ازدياد الطلب على البحث في تطوير علاجات جديدة لمرض المكوّرات الرئوية5،6،،من78.

بنيوموكوككوس يعتمد على السكر المستوردة من البلد المضيف ك9،الكربون مصدر10؛ والواقع أنه يكرس 30% أجهزتها استيراد لنقل 32 الكربوهيدرات مختلفة11،،من1213. وتشمل هذه المستوردين ABC-الناقلون ثمانية على الأقل13. في أي بي سي الناقلين، سببس خارج الخلية تلعب دوراً أساسيا في تحديد الخصوصية ليجند وتقديمه إلى الناقل غشاء لا يتجزأ لامتصاص في الخلية. سببس تمثل أهدافا صالحة لتصميم لقاحات جديدة ومضادات لأنهم البروتينات السطحية ودورها الحيوي في العمليات الخلوية.

توصيف البروتين المستهدف ووصف مفصل للسمات الهيكلية، مثل جيوب يجند والمرونة بين المجالات، توفر أداة مفيدة للمخدرات على أساس هيكل تصميم14،15. علم البلورات بالأشعة السينية هو الأسلوب المفضل لتوصيف الهيكلية للبروتينات في القرب من القرار الذري، ولكن عملية تبلور لا يمكن التنبؤ بها، وتستغرق وقتاً طويلاً، ولم تكن ناجحة دائماً. وتحسنت أساليب منهجية معدل النجاح وهي عوامل هامة نوعية العينة والاستقرار. ويتأثر معدل نجاح تبلور البروتين الخصائص الكيميائية ومنهجية إعداد عينة. ويمكن تقييم أثر هذه وأبلغ بتوصيف البيوكيميائية16،17.

مضاعفات أخرى لتصميم الهيكل القائم هو المشكلة بلورية المرحلة التي يجب معالجتها. كما أصبحت أكثر البروتين الهياكل المتوفرة، يمكن حل العديد من الهياكل بطريقة استبدال الجزيئية، الأمر الذي يتطلب هيكل مثلى18. كما سببس الراهن بنية مجال مرنة، استبدال الجزيئية قد يثبت أيضا تحديا19. إذا لم يتوفر نموذج هيكلي مشابه بما فيه الكفاية للبروتين المستهدف، يمكن استخدام عدد من التقنيات للحصول على مراحل تجريبية20. ومن بين هذه الأسلوب تشتت الشاذة طول موجي واحد (SAD) برز كتقنية أساسية، وقد استخدمت على نطاق واسع لحل مشكلة المرحلة21. تم استخدام أسلوب حزين قدما مع تحسينات في الأجهزة والبرامج، فضلا عن استراتيجيات جمع البيانات للسماح باكتشاف واستخدام الإشارات الشاذة الضعف التدريجي2322،، 24. وعلاوة على ذلك، التقدم في أساليب مباشرة لحل هياكل الجزيئات الكبرى، التي كانت في الماضي تتطلب البيانات حيود القرار الذري، يمكن الآن استخدامها عن طريق على سبيل المثال، الجمع بين معارف الخبراء بتنفيذها في البرنامج أرسيمولدو25. وتعطي استعراضاً مفيداً لأساليب لحل مشكلة المرحلة في علم البلورات تايلور26.

هنا نقدم بروتوكول ترشيدا لتوصيف الكربوهيدرات النقل الاستراتيجية والخطة الاستشرافية، SP0092 س. الرئوية، إدماج تقنيات الكيمياء الحيوية والهيكلية (الشكل 1). يوفر هذا البروتوكول خطوة بخطوة حالة اختبار مثالاً مفيداً لاستراتيجيات لتحسين معدل نجاح دراسات الهيكلية في سببس بشكل عام، التي توجد في جميع الممالك من الحياة. على وجه الخصوص، البروتوكول يبرز أهمية تميز الدولة oligomeric الأكثر استقرارا من البروتين في الحل بطريقة سريعة وفعالة، ويتيح تحديد الأنواع أفضل متابعة لبلورة التجارب. ورغم أن هناك ما يزيد على 500 الهياكل الاستراتيجية والخطة الاستشرافية في "مصرف بيانات البروتين"27، يمكن أن يكون تحديا الاستبدال الجزيئي نظراً لطبيعة المرونة المتأصلة بين المجالات α/β، التي ترتبط ب منطقة مفصلي19. وهكذا يصف الجزء الثاني من البروتوكول استخدام أسلوب حزين للتخلص التدريجي من الأيونات المعدنية ملزمة، وهي مشتركة في سببس، فضلا عن إدراج سيلينوميثيونيني واستخدام السيلينيوم (Se) في مراحل الحزن.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تسلسل الترميز الذي يتم حذف إشارة الببتيد هو المستنسخة في ناقلات بوبينف بعد بروتوكول قياسي في الانصهار؛ ويتم التعبير عن البروتين الأصلي انصهار صاحب علامة في خلايا الإشريكيّة القولونية BL21 رشيد 28 ، 29-أعرب selenomethionine المسمى البديل عن اتباع الأساليب القياسية وفقا للشركة المصنعة 30. المؤتلف الاستراتيجية والخطة الاستشرافية يتم تنقيتها كما سبق وصف 32 من 31 ،.

1-"توصيف البيوكيميائية"

  1. الحرارية تحول الإنزيم
    1. 48 إعداد المخزن المؤقت الحلول مع الرقم الهيدروجيني بدءاً من 4.0 إلى 9.5 وتركيز كلوريد الصوديوم من 0 إلى 0.5 متر، والاستغناء عن 40 ميليلتر في صفيحة 96-جيدا كما هو موضح في الجدول 1 33-
    2. إضافة إلى كل ميليلتر جيدا 5 من الحل الاستراتيجية والخطة الاستشرافية بتركيز 1-2 مغ/مل.
    3. إضافة إلى كل ميليلتر جيدا 5 من 20 x الفلورسنت وصمة عار للبروتينات (انظر الجدول للمواد)-
    4. ميكس الحلول التي بيبيتينج وختم اللوحة باستخدام فيلم لاصق شفاف، وتدور لمدة 2 دقيقة في 112 x ز في درجة حرارة الغرفة-
    5. تشغيل التجربة على جهاز في الوقت الحقيقي: تعيين منحدر درجة حرارة من 3 درجة مئوية/دقيقة من 4 إلى 99 درجة مئوية مع وقت الانتظار s 10، وتقرأ في الأسفار كل 0.5 درجة مئوية مع الإثارة في 483 شمال البحر الأبيض المتوسط والانبعاثات في 568 نانومتر.
      6. تحليل منحنيات fluorescence الانبعاثات لكل حالة المخزن المؤقت، وتحديد درجة حرارة ذوبان (T m) بوصفها الحد أدنى المشتقة من
    6. -
      ملاحظة: هذا الإجراء يعطي مؤشرا جيدا لأن أفضل حل المخزن المؤقت للمساعدة في تحسين الاستقرار البروتين. اختر نطاق درجة الحموضة وتركيز الملح استناداً إلى شرط المخزن المؤقت مع تي أعلى م وإضافة 2.5% (v/v) من الجلسرين و 0.5 مم من tris(2-carboxyethyl) الفوسفين (تسيب) تعريف الحل المخزن المؤقت للخطوات التالية (SEC-المخزن المؤقت).
  2. مالس والتحليلية في الثانية
    1. أداء يغسل حجم عمودين العمود الترشيح جل معبأة مسبقاً مع يطرد المياه المصفاة (استخدام عمود مل 24 وزن الجزيئي واسعة نطاق).
    2. الاتصال العمود للكشف عن تشتت الضوء وحجته العمود مع العزم الثانية-المخزن المؤقت من مقايسة التحول الحراري.
    3. حقن 100 ميليلتر من الاستراتيجية والخطة الاستشرافية المنقاة في 5 ملغ/مل متوازن ثانية العمود وتدفق عمود واحد إلى حجم المخزن المؤقت ثانية.
    4. تحقق chromatogram شطف لواحد أو عدة قمم وفحص البيانات ونثر باستخدام برمجيات التحليل، الحصول على كتلة المولى ومؤشر بوليديسبيرسيتي لجميع الأنواع-
      ملاحظة: لكل ذروة المقابلة لأنواع أوليجوميريك، أنه من المفيد للتحقق من بوليديسبيرسيتي حساب مؤشر المولى الكتلة المرجحة في الإعلام الجماهيري/المولى مرجح على عدد من الجزيئات (Mw/Mn). تشير قيمة بوليديسبيرسيتي ما يقرب من 1 إلى ذروة مونوديسبيرسيد.
      ملاحظة: حالما يتم تعريف جميع أنواع أوليجوميريزيشن، يكون من المفيد دراسة اعتمادهم على تركيز البروتين، كما قد تركيزات أعلى لصالح أكبر oligomer تشكيل.
    5. تنفيذ تشغيلات ثانية تحليلية متعددة؛ وحقن 100 ميليلتر من الاستراتيجية والخطة الاستشرافية المنقاة في زيادة تركيزات (0.1-10 ملغ/مل) في العمود الترشيح جل متوازن (استخدام عمود 5 مل وزن الجزيئي واسعة نطاق) وتدفق حجم عمود واحد من المخزن المؤقت ثانية في كل مرة.
    6. تحقق chromatogram شطف لواحد أو عدة قمم وتحليل كثافة امتصاص في 280 nm منحنيات المقابلة لتركيزات البروتين انطلاق مختلفة. إذا كانت كثافة نسبية من قمم مختلفة تظل ثابتة، ثم لا تحويل بين الوكالات بين الأنواع أوليجوميريك الحالية. التباين في كثافة نسبية بتركيزات مختلفة هو دليل على إينتيركونفيرسيون بين مختلف الأنواع أوليجوميريك التي تعتمد على تركيز البروتين.
      ملاحظة: هذه الخطوة وصف أساسي لتحديد الأنواع التي هي أكثر ملاءمة لبلورة. في الواقع، هم أكثر عرضه لبلورة إذا كانوا في حالة oligomeric مطرد بتركيز محدد الأنواع المتميزة مونوديسبيرسيد.

2. إعداد البروتين وتبلور

أغسل
  1. "ثانية محضرة"
    1. بعد حجم عمود واحد مع يطرد المياه المصفاة، حجته مع المخزن المؤقت ثانية العمود الترشيح محضرة جل معبأة مسبقاً (الوزن جزيئي واسعة 120 مل عمود)-
    2. 1-5 مل من الاستراتيجية والخطة الاستشرافية المنقاة في 5-50 مغ/مل بحقن متوازن هلام الترشيح العمود وتدفق عمود واحد حجم المخزن المؤقت ثانية.
    3. جمع في عمود التدفق من خلال في الكسور 1 مل.
    4. تجمع الكسور المقابلة إلى ذروة مونوديسبيرسي واحدة؛ وتدور العينة في 15 مل مرشحات الطرد المركزي في 1,500 ز وقياس التركيز حتى يتحقق التركيز المطلوب (عادة 50-100 مغ/مل ل SP0092)-
  2. تبلور
    1. تحديد نطاق التركيز الأمثل لبلورة التجربة باستخدام "اختبار" ما قبل تبلور كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة:
      1. Dispense 0.5-1.0 مل لكل اختبار تبلور أربعة الحلول في خزان مختلفة لجلسة 24-كذلك إسقاط لوحة التبلور.
      2. إعداد قطرات تبلور بخلط 1 ميليلتر من البروتين الحل مع 1 ميليلتر من خزان الحل وختم اللوحة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة للا أقل من 1 (يتم الحصول على نتائج أكثر موثوقية بعد الحضانة بين عشية وضحاها) ح.
      3. التحقق من جودة إسقاط لكل تركيز باستخدام مجهر تكبير 10 س.
        ملاحظة: اختبار تركيز البروتين مختلفة على الأقل ثلاثة: (ط) معظم قطرات تبقى واضحة تشير إلى أن البروتين مخفف جداً لبلورة؛ (ثانيا) وجود ترسبات الثقيلة في أغلبية القطرات يعني بتركيز عالية للغاية؛ وحدوث (ثالثا) متوازنة قطرات واضحة ومتسرعا (أفضل إذا كانت خفيفة) مؤشر جيد على أن تركيز اختبار ملائم لبلورة.
    2. يعد انخفاض 96-جيدا للجلوس لوحات التبلور؛ والاستغناء عن 100 ميليلتر من الحل تبلور تجارية مختلفة في كل خزان جيدا 34 ، 35 ، 36 ، 37-
    3. nL الاستغناء عن 100 عينة البروتين في تركيز محدد مسبقاً (الخطوة 1.1.6) في جميع الآبار قطره تبلور باستخدام نظام روبوتية تبلور.
      4. حلول
    4. nL الاستغناء عن 100 خزان مختلفة لبلورة المقابلة إسقاط الآبار لخلط مع البروتين في خطوة 2.2.3. إغلاق لوحة التبلور تجنب التبخر وتمكين الموازنة انخفاض تبلور مع الخزان.
    5. التحقق من قطرات دورياً (في البداية كل 1-2 يوما، وبعد كل أسبوع) (على الأقل) باستخدام حرف x 10 مجهر التكبير لتقييم تشكيل الكريستال ونمو.
      ملاحظة: نظام تصوير الآلي لبلورة البروتينات يمكن أن تستخدم ليسقط التصور والالتقاط.
< الفئة p = jove_title "> 3. توصيف كريستال وجمع بيانات الأشعة السينية

  1. كريستال تصاعد
    1. إعداد الحل كريوبروتيكتانت بإضافة 25% (v/v) من الجلسرين (تركيز النهائي) إلى حالة تبلور (وبالتالي الاستعاضة عن 25 في المائة مياه في الأولى خليط) 38-
      2. ملء
    2. رغوة ديوار مع النتروجين السائل ومكان الجزء الضميمة عينة من يوني-عفريت إلى ديوار. السماح لتبرد إلى درجة حرارة النتروجين السائل.
    3. قطع وإزالة الختم الشريط من لوحة تبلور على مدى الانخفاض حيث تتشكل البلورات.
    4. ضع قطره 1 ميليلتر من محلول كريوبروتيكتانت على كوفيرسليدي المتمركزة بالقرب من الهبوط المستهدف.
    5. نقل كريستال مختارة من إسقاط الأصلي إلى حل كريوبروتيكتانت انخفاض استخدام نايلون cryo-حلقة في قاعدة العمود الفقري قياسية التي شنت على 39 ، عصا مغناطيسية 40-
    6. بسرعة نقل الكريستال من إسقاط كريوبروتيكتانت للنتروجين السائل، وضع الحلقة في موضع فارغ الأول صاحب العينة يوني-عفريت-
    7. كرر (من الخطوة قص الشريط الختم) إلى جميع بلورات المطلوب يتم حصادها وتخزينها في صاحب العينة يوني-عفريت-
    8. مكان يوني-عفريت إسناد يوني-عفريت استخدام عصا الصولجان وتأخذ عفريت إلى بيامليني (تحت ظروف النتروجين السائل).
      تنبيه: الغاية انخفاض درجة حرارة!
      9. استخدام
    9. البرد-ملقط وعفريت ديوار تحميل أداة تحميل يوني-puck(s) إلى الروبوت مغير عينة بيامليني ديوار. سيتم فصل صاحب العينة يوني-عفريت من غطاء قاعدة ترك أصحاب حلقة عينة تستقيم في الروبوت عينة ديوار وهكذا يتعرض للنتروجين السائل وموجودا للروبوت مغير عينة.
  2. توصيف كريستال
    ملاحظة: يمكن ثم فحص بلورات المقطوع لجودة الحيود باستخدام أما مصدر الأشعة سينية مختبر أو في مصدر الأشعة سينية إشعاع السنكروتروني (SR). بيملينيس البلوري الجزيئات (MX) توفير مصدر للطاقة الانضباطي لاستغلال حيود الشاذ لهيكل الحل. في المقطع التالي، ويقترح سلسلة من تعليمات العمل تماشيا مع قدرات تجريبية من بيملينيس الماس MX مصدر الضوء، ولكن أيضا يمكن أن تتكيف هذه المبادئ التوجيهية بيملينيس MX في سينتشروترونس الأخرى في جميع أنحاء العالم.
    1. كخطوة أولى، فإنه من المفيد تأكيد أو تحديد عدسات الشاذة في البلورة. وهذا يمكن تحقيق مريح بقياس طيف الأشعة سينية الأسفار من البلورة. أولاً تأكد من تعيين طاقة الأشعة السينية بيمليني عالية بما يكفي لإثارة جميع العناصر المتوقعة عادة لبلورات الجزيئات (14 فولط أو أعلى)-
    2. استخدام برامج التحكم بيامليني لتحديد العينة التي سيتم تحميلها بالروبوت مغير عينة؛ وسيتم توسيط الحلقة تلقائياً في حزمة الأشعة السينية والتوسيط كريستال يمكن تأكيد يدوياً باستخدام برامج التحكم بيامليني-
    3. تسجيل طيف الأسفار بالأشعة سينية استخدام برمجيات التحكم بيمليني: المستخدم تحديد وقت تعرض، ويبدأ القياس (الأسفار/Fluorescence "الطيف الإعداد"، → تشغيل، الشكل 2 أ). تلقائياً مواقع برامج التحكم بيامليني الأشعة السينية كاشف fluorescence في مكان ويحدد الحادث الدنيا التمويه بالأشعة السينية للحصول على إشارة لقراءة على الكاشف ومضان. ثم يتم تحليل الطيف المكتسبة بطريقة إليه مع قمم الانبعاثات مزودة بشكل طبيعي العناصر البيولوجية. تتوفر هذه الإجراءات داخل بيامليني مراقبة البرمجيات واجهة المستخدم الرسومية (GUI)-GDA (www.opengda.org) في شركتنا وفي سينتشروترونس في جميع أنحاء أوروبا 41 ، 42-
    4. إذا تم تحديد العناصر المناسبة التي يمكن أن تستغل لتجربة حيود شاذة، إجراء فحص الطاقة حافة امتصاص الأشعة سينية لتحديد الطول الموجي الأمثل لجمع البيانات حيود الشاذة من الكريستال: على بيامليني التحكم في البرنامج، حدد العنصر وبدء المسح الضوئي (الأسفار/Fluorescence "مسح الإعداد"، → اسم الذرة، → تشغيل، الشكل 2B).
      ملاحظة: يستخدم ذروة حافة امتصاص لتجربة حيود شاذة واحدة، إلى أقصى حد ممكن نثر الشاذة. اعتبارات تجريبية لأداء تجربة حيود شاذة متعددة الطول موجي قد تم سابقا مفصلة 43-
    5. لتحديد معلمات خلية وحدة كريستال والتماثل، والحد حيود، قياس ثلاثة أنماط حيود الأشعة السينية على فترات 45 درجة استخدام أسلوب التذبذب (جمع البيانات والفرز → تشغيل الحالية، الشكل 2). برامج التحكم بيمليني يوفر للمستخدم مع خيار من زاوية التذبذب ووقت التعرض، والقدرة على تعيين النسبة المئوية انتقال شعاع الأشعة السينية. لفحص كريستال قياسية، ينصح بزاوية التذبذب 0.5 °، وقت تعرض 0.5 s، وانتقال شعاع أشعة إكس 5%. الصور قياس حيود تلقائياً يتم تحليلها بواسطة خط أنابيب إدنا وإرجاع مجموعة من الاستراتيجيات لجمع مجموعة كاملة من البيانات 22-
  3. الأشعة السينية جمع البيانات
    ملاحظة: يمكن للمستخدم تحديد لجمع البيانات في وضع معيار التذبذب أو وضع شعاع معكوس، التي تمكن الأصحاب فريدل بتسجيلها قريبة في الوقت وجرعة الأشعة السينية، ومع تقريبا نفس السلوك الاستيعاب يتيح قياس أكثر دقة للاختلافات الشاذة. هذا الأخير مفيد خاصة إذا كانت الاختلافات الشاذة الصغيرة من المتوقع و/أو العينات من الإشعاع الحساسة عند القيام بتجربة حيود شاذة. وكانت الاعتبارات المتعلقة بأفضل استراتيجيات جمع البيانات استخدام استعراض شامل 22 ، 23 ، ، من 44 45 ، 46 ، 47-
    1. استخدام برمجيات التحكم بيمليني، استيراد المعلمات جمع البيانات كما اقترح البرنامج الاستراتيجية التي سوف توفر:
      موضع البدء أولاً محور دوران ω
      الثاني. زاوية العرض التذبذب التناوب ω-محور لكل صورة الحيود
      الثالث. وقت التعرض لكل صورة الحيود
      الرابع. عدد من الصور لمجموعة بيانات كاملة (غير مباشر تحديد زاوية الاستدارة مجموع ω-محور لجمع بيانات بأكملها)
      ف. النسبة المئوية لتوهين شعاع الأشعة السينية لتفادي أضرار الإشعاع والتعرض المفرط
      ملاحظة: في مؤسستنا، ل تشغيل عملية جمع البيانات، خطوط الأنابيب البرمجيات للتجهيز الآلي للبيانات المجمعة راسخة: يتم تقليل البيانات (ط) الحيود (مفهرسة والمتكاملة، وتحجيم) بخط الأنابيب xia2، الذي يقوم بإنشاء ملفات mtz انعكاسا للمستخدم كمدخل ل الحل/التحسين التدريجي وهيكل 48. (ثانيا) عندما يتم الكشف عن إشارة شاذة كبيرة أثناء تحليل البيانات، أول هيكل إليه سريعة حل أنبوب (fast_ep) باستخدام شل محاولات حل الهيكلية ذرة ثقيلة بالتجريبية التدريجي، وتوفير خارطة كثافة الإلكترونات تدريجيا حيثما كان ذلك ممكناً. أنبوب النفط حل هيكل ثاني أشمل تتعهد تلقائياً المحاولات الرامية إلى حل، وبناء ستروكتوإعادة استخدام البرمجيات المستقلة أجنحة 49 ، 50 ، ، من 51 52؛ في الحالات التي يكون فيها هذا النجاح، ستقدم المستخدم مع خريطة كثافة النموذجي والالكترون أولية. وهذا يوفر الأساس للمستخدم لإكمال الصقل والتحقق من صحة النموذج مع أجنحة البرمجيات بلورية الاختيار.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد ثبت هذا البروتوكول المتكامل لتكون ناجحة مع أربعة (اثنان هما المنشورة وهياكل) من الكربوهيدرات ستة أهداف البروتين ملزمة من pneumococcus تحليلها حتى الآن32،53. في هذا القسم، نقدم توصيف SP0092 الكيمياء الحيوية والهيكلية كنتيجة ممثل لتوجيه الدراسات الهيكلية سببس بشكل عام.

بعد قد أعربت عن SP0092 الاستراتيجية والخطة الاستشرافية وتنقيته كما يعرف سابقا32، وقد تم تحليل البروتين المنقي للاستقرار المخزن المؤقت باستخدام مقايسة تحول حراري: SP0092 المعارض زيادة تيم على درجة الحموضة 6.5 وفي وجود كلوريد الصوديوم في 0-0.2 M نطاق التركيز (الشكل 3A). وفي ضوء هذا، كان يعرف الحل المخزن المؤقت للخطوات التالية: 0.2 M 0.02 م مس pH 6.5، كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 2.5% (v/v)، 0.5 مم تسيب. كتلة المولى المطلقة من دول مختلفة أوليجوميريزيشن SP0092 تم قياسه بواسطة مالس بالإضافة إلى ثانية قياس وزن الجزيئي 187.2 و 140.8 97.0 49.4 كاتشين، المطابق للأنواع تيتراميريك، تريميريك، ديميريك، وموحودي، على التوالي ( الشكل 3). وكشف تحليل للشخصية ثانية في تخفيف البروتينات المختلفة أن أوليجوميريزيشن يتم تشغيلها بواسطة تركيز زيادة البروتين، مما يوحي بأن ليغومرات أكبر أكثر استقرارا في تركيزات أعلى مما يستخدم عادة في تبلور. وفي الواقع، الأنواع oligomeric أكبر المنقي الموجهة إلى بلورة المحاكمات، بلورات البروتين المنتجة بنجاح حين مونومر الأنواع لم.

محسن البلورات التي تم الحصول عليها من الأم وسراج الدين-الميثيونين المسمى أشكال SP0092 اتسمت حيود الأشعة السينية. وكشف قياس fluorescence الأشعة السينية من هذه البلورات في كلتا الحالتين قمم الانبعاثات للزنك ملزمة للبروتين، في حين تم الكشف عن سراج الدين فقط لبلورات الميثيونين سراج الدين كما هو متوقع. في وقت لاحق، أجريت فحص امتصاص الأشعة السينية عند حواف سراج الدين والزنك، التي وفرت بيانات تجريبية مباشرة لضبط طول موجه الأشعة السينية الحادث إلى حواف امتصاص الأشعة السينية كل منها الزنك أو سراج الدين الموجودين في البلورات تكبير الإشارات الشاذة يمكن الحصول عليها من البيانات الناتجة عن ذلك (الشكل 4A–ب).

وبعد قياس ثلاثة أنماط الحيود في انتقال العدوى منخفض، تم الحصول على مجموعة كاملة من البيانات شاذة استخدام استراتيجية جمع البيانات اقترحها إدنا (الشكل 4). مشغلات الإشارات الشاذة هذا الأنبوب مراحل الآلي في بيمليني لتحديد البنية الفرعية، واستنادا إلى المراحل التجريبية الأولية المشتقة، تنتج الأولى الخرائط والنماذج التي يمكن صقلها والتحقق من صحتها (الرقم 4 ).

وباختصار، يتم توسيط المزالق المحتملة لهذه التقنية أساسا على توافر كريستال والجودة. الاستغلال الأمثل للظروف المخزن المؤقت لتحسين الاستقرار البروتين، فضلا عن تحديد الدولة oligomeric أنسب من البروتين لاستخدام، وعندما يتم تحديد أوليجومير واحد أو أكثر في الحل، يمكن أن تقلل من خطر الفشل في بلورة المرحلة. استغلال استخدام أيونات المعادن المرتبطة التي تم تحديدها في مرحلة مبكرة يمكن تسريع بنية الحل وتجنب الإنتاج غير الضروري للمسمى البروتين عندما تفشل أساليب استبدال الجزيئية selenomethionine.

figure-results-1
رقم 1. رسم تخطيطي لسير العمل لتحديد الخصائص الكيميائية الحيوية والهيكلية من الكربوهيدرات سببس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-2
رقم 2. توصيف كريستال في GDA. (أ) لقطة من علامة التبويب التحكم fluorescence الأشعة السينية لبرامج التحكم بيمليني GDA. (ب) لقطة من علامة التبويب التحكم الحافة--تفحص الطاقة الأشعة السينية في GDA. (ج) لقطة من علامة التبويب فرز كريستال جمع البيانات في GDA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-3
الشكل 3. وصف البيوكيميائية SP009239-491. (أ) 3D-سطح الرسم البياني التآمر درجة حرارة ذوبان SP009239-491 كدالة لدرجة الحموضة وتركيز كلوريد الصوديوم الحل المخزن المؤقت. (ب) ثانية ومالس نتائج SP009239-491. الاستيعاب في 280 nm يظهر باللون الأزرق. الجماهير المولى للدول أوليجوميريزاتيون مختلفة تظهر باللون الأحمر. وقد تم تعديل لوحة (ب) من32. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-4
الشكل 4. وصف الهيكلية SP009239-491. (أ) والطاقة امتصاص الأشعة السينية (ب) مسح على حافة الزنك وسراج الدين لبلورات39-491 SP0092. يبين fluorescence المقاسة من الزنك وسراج الدين الذي يحتوي على بلورات أزرق وسماوي، و المحسوبة 'و"نثر الشاذة وأجزاء من الأخضر والأحمر، على التوالي. (ج) أمثلة على أنماط حيود الأشعة السينية التي تم جمعها من بلورات39-491 SP0092. (د) كارتون تمثيل هيكل ديمر39-491 SP0092. بروتومير واحد هو اللون الأبيض وغيرها من البنفسجي (بقايا 39-366) والبنفسجي (بقايا 367-491)، وتظهر ذرات نثر الشاذة ككرات زرقاء وسماوي للزنك وسراج الدين، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

0.1 M حمض الستريك pH 4.00.1 M حمض الستريك الأس الهيدروجيني 4.50.1 M الفوسفات pH 5.00.1 M سترات pH 5.50.1 M مكررا-تريس pH 60.1 م أدا pH 6.50.1 M والمماسح الأس الهيدروجيني 70.1 M هيبيس درجة الحموضة 7.50.1 M ايميدازول pH 8.00.1 M تريس pH 8.50.1 م أ الأس الهيدروجيني 90.1 م أ pH 9.5
كلوريد الصوديوم 0 م40 ميكروليتر40 ميكروليتر40 ميكروليتر40 ميكروليتر40 ميكروليتر40 ميكروليتر40 ميكروليتر40 ميكروليتر40 ميكروليتر
40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر كلوريد الصوديوم 0.1 M 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر كلوريد الصوديوم 0.2 M 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر كلوريد الصوديوم 0.5 M 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر

الجدول 1. تكوين المخزن المؤقت للمقايسة التحول الحراري.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة، ونحن تصف والتحقق من صحة بروتوكولا متكاملة لتوصيف البيوكيميائية والهيكلية من الكربوهيدرات سببس مع تركيز بشكل خاص على البروتينات من س. الرئوية. ومع ذلك، يمكن استخدام هذا كإجراء موحد لتحليل سببس أخرى من الكائنات المختلفة وحتى البروتينات القابلة للذوبان أخرى لا علاقة لها.

الجزء الأول من البروتوكول يركز على توفير المعلومات البيوكيميائية على الاستقرار البروتين وهيكل رباعي، التي يمكن استغلالها في إعداد عينات البروتين لبلورة. في المقطع فحوصات التحول الحراري، يصف لنا فقط على درجة الحموضة وتغيرات تركيز كلوريد الصوديوم للحفاظ على الطابع العام لهذا الإجراء. وعلى الرغم من ذلك، العديد من الشروط الأخرى في المخزن المؤقت يمكن اختبارها بطريقة مشابهة، على سبيل المثال، بما في ذلك أي مجمع الكيميائية المستخدمة كمادة مضافة استقرار: خاصة ligand(s) الفعلية التي تربط الاستراتيجية والخطة الاستشرافية محددة فعالة بشكل ملحوظ في زيادة تم ببضع درجات مئوية31. وفي بعض الحالات، يمكن تعريف منحنيات يشوه سيئة بسبب إشارة منخفضة أو خلفية فلورية عالية، الذي يحدث بسبب تراكم البروتين أو تتكشف جزئيا. لتجنب هذا الأمر، يمكن أن يؤديها معايرة بروتين: صبغ لتحسين المنحنيات يشوه غير واضحة. إذا تم الحصول على أي تحسن، ينصح بفحص المضافات المختلفة التي يمكن تحسين استقرار البروتين، وشاشات مناسبة تم وصفه سابقا54.

بشكل عام، سببس معظم أحادي في بيئتهم الطبيعية، ولكن كما هو موضح هنا مولتيميريزيشن يمكن أن تحدث في تركيزات أعلى تستخدم في تجارب التبلور، وبالتالي توصيف السلوك أوليجوميريزاتيون التي تقدمها مالس وثانية أساسية لتقييم حالة أوليجوميريزيشن مونوديسبيرسي مستقرة مواتية أكثر لبلورة. ومع ذلك، من الصعب التنبؤ بتأثير مختلف المواد الكيميائية المدرجة في حالة تبلور على السلوك أوليجوميريزيشن من البروتينات. إذا تبين دراسة ثانية ومالس تجميع واسعة من العينة البروتين، سوف ننصح التالية للحد من احتمال حدوث هذا الأمر: استخدام عينة جديدة من البروتين (عدم تجميد مذاب) وتوسيع نطاق التحليل استقرار أداء مع الحرارية تحول فحوصات، اختبار المواد المضافة المحتملة والمنظفات معتدل كمورد آخر، للحد من التراكم. في هذه الورقة، نقدم المبادئ التوجيهية الأساسية لبلورة استخدام مصفوفة متناثر الفائق التجاري تبلور الفرز للحفاظ على الطابع العام لهذا البروتوكول. ومع ذلك، الحصول على بلورات البروتين حيود الأشعة السينية ذات الدقة العالية قد تحتاج إلى ضبط تكراري لتحسين ظروف التبلور فيما يتعلق بتركيز مرسب، الرقم الهيدروجيني، وإضافة المواد الكيميائية المضافة، درجات حرارة مختلفة، و عوامل أخرى تغير ديناميات توازن بين كريستال الخزان وإسقاط16،17.

ويصف الجزء الثاني من البروتوكول توصيف بلورات البروتين بغية تحديد الاستراتيجية المثلى لجمع البيانات حيود الأشعة السينية مع تركيز بشكل خاص على الحصول على البيانات الشاذة لمراحل الحزن. حتى لو سببس الحفاظ على بنية عامة مماثلة (وهناك العديد من الهياكل 3D المودعة يحتمل أن تكون صالحة للاستعمال كبداية النماذج)، التخلص التدريجي من هذه البروتينات بطريقة الاستبدال الجزيئي ليست دائماً واضحة بسبب التباين عناصر البنية الثانوية والمرونة المتأصلة في هذه البروتينات. ومن ثم اقتراح أسلوب حزين، وتسليط الضوء على أن هذه البروتينات قد يكون جوهريا منضم بالفعل المعادن أو ملزمة في الواقع غير محددة من المعادن من ظروف التبلور المخزن المؤقت، التي يمكن أن توفر مجموعة من العناصر ديفراكتينج الشاذة الخطوة القياسية في البروتوكول العام أعمالنا.

وفي الختام، يعرف هذا البروتوكول سير عمل إرشادية قياسية للإجراءات التي تتيح لوصف مفصل لميزات سببس التي يمكن استغلالها لزيادة معدل نجاح تصميم الهيكل، فضلا عن الإسراع في الكيمياء الحيوية والهيكلية وصف سببس الهيكلية بصورة عامة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونعترف أوبف-المملكة المتحدة لتقديم المساعدة في مجال الاستنساخ، "هاريس جيما" مولات ثانية والعلماء من بيملينيس I03 و I04 في "الماس مصدر الضوء".

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سيلينو ميثيونين متوسط أبعادجزيئيةMD12-500يعتمد على وسائط M9 الاصطناعية البسيطة المكملة بالجلوكوز والفيتامينات والأحماض الأمينية باستثناء L-ميثيونين. تتوفر منتجات أخرى مكافئة تجاريا من قبل شركات أخرى.
MicroAmp Optical 96-WellPlate Applied Biosystems4306737تم تحسين لوحة التفاعل البصرية MicroAmp البصرية 96 جيدا مع الباركود لتوفير دقة وتوحيد لا مثيل لها في درجة الحرارة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل بسرعة وفعالة. هذه اللوحة ، المصنوعة من قطعة واحدة صلبة من مادة البولي بروبيلين بتنسيق 96 بئرا ، متوافقة مع Applied Biosystems & reg. 96-Well أنظمة PCR في الوقت الحقيقي والدراجات الحرارية.
SYPRO OrangeMolecular ProbesS6651SYPRO Orange Protein Gel Stain عبارة عن صبغة فلورية حساسة وجاهزة للاستخدام للبروتينات في المواد الهلامية 1D. صبغة بروتين عالمية وراسخة للمناطق الكارهة للماء.
فيلم لاصق بصري MicroAmpأنظمة حيوية مطبقة4311971يقلل فيلم اللاصق البصري MicroAmp Applied Biosystems من فرصة التلوث من البئر إلى البئر وتبخر العينة عند تطبيقه على صفيحة دقيقة. إنه مثالي للقياس البصري ، لأنه يعطي خلفية منخفضة.
7500 نظام PCR سريع في الوقت الحقيقيالأنظمة الحيوية التطبيقية4362143يتيح نظام Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR للدورة الحرارية عالية السرعة بتنسيق 96 بئرا ، مما يقلل بشكل كبير من وقت التشغيل لتطبيقات PCR الكمية في الوقت الفعلي ، مما يوفر نتائج في حوالي 30 دقيقة. تتوفر مجموعة الترقية لترقية نظام PCR في الوقت الفعلي 7500 القياسي إلى التكوين السريع عبر تثبيت الخدمة الميدانية. يمكن استخدام آلة RT-PCR أخرى. تصدير البيانات ليس بالأمر السهل بالنسبة لبرنامج تحليل البيانات القديم.
Superdex 200 زيادة 10/300 GL عمودGE Healthcare28990944Superdex 200 زيادة 10/300 GL هو عمود متعدد الاستخدامات ومعبأ مسبقا لضبط اللونيات لاستبعاد الحجم في التنقية التحضيرية على نطاق صغير (ملغ) وكذلك لتوصيف وتحليل البروتينات ذات الأوزان الجزيئية بين 10 000 و 600 000 ، مثل الأجسام المضادة. فصل مثالي مثالي للتقنيات الفيزيائية الحيوية عالية الدقة.
DAWN HELEOS IIWyattDAWN HELEOS II هو كاشف تشتت الضوء الثابت متعدد الزوايا (MALS) للتوصيف المطلق للكتلة المولية وحجم الجزيئات الكبيرة والجسيمات النانوية في المحلول. يوفر DAWN أعلى حساسية ، وأوسع نطاق من الوزن الجزيئي والحجم والتركيز ، وأكبر مجموعة من التكوينات والوحدات الاختيارية للقدرات المحسنة. لم يتم اختبار أنظمة الكشف عن MALS الأخرى من شركات أخرى باستثناء Wyatt ، لذلك لا يمكن تقديم ملاحظات إضافية.
Superdex 200 5/150 GLGE Healthcare28906561Superdex 200 عبارة عن أعمدة كروماتوغرافيا استبعاد ذات حجم معبأ مسبقا لفصل التحضير والتحليل عالي الدقة على نطاق صغير للجزيئات الحيوية. يحتوي Superdex 200 على نطاق فصل للجزيئات ذات الأوزان الجزيئية بين 10 000 و 600 000. فصل الذروة ليس مثاليا كما هو الحال بالنسبة لإصدار "الزيادة" ولكن هذا النموذج مثالي للاستخدام اليومي القياسي.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare28989335HiLoad 16/600 Superdex 200 الإعدادية هي أعمدة XK معبأة مسبقا مصممة لكروماتوغرافيا ترشيح الهلام عالية الدقة.
24 جيدا "كبيرة" الجلوس قطرة لوحة التبلورMiTeGenXQ-P-24S-Aيتم استخدام لوحة التبلور "الكبيرة" 24 جيدا بشكل أساسي لفحص بلورات البروتين عن طريق تقنيات نشر بخار قطرة الجلوس ، ولتحسين حالة التبلور. يحتوي على بئر خزان كبير جدا وحاوية عينة ، والتي تفضل المناولة اليدوية ونمو بلورات البروتين كبيرة الحجم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن بسهولة إغلاق أسطحها المسطحة بشريط شفاف أو زلات غطاء.
اختبار التبلور المسبق لمعاهدة التعاون بشأنالبراءات هامبتونHR2-140يستخدم اختبار التبلور المسبق لمعاهدة التعاون بشأن البراءات لتحديد تركيز البروتين المناسب لفحص التبلور.
تحتوي ألواح البئر المربعة 96 Well CrystalQuickGreiner bio-one6098xxعلى ثلاثة آبار تبلور لكل خزان ، مما يجعل من الممكن اختبار 288 عينة لكل لوحة. تستخدم بشكل عام فقط للفحص الأولي لأن حافتها المربعة تجعل صيد البلورات صعبا.
الأبعاد الجزيئيةUni-PuckMD7-601Universal V1-Puck (Uni-puck) عبارة عن حاوية تخزين وشحن عينة للاستخدام مع غالبية أنظمة تركيب العينات الآلية في جميع أنحاء العالم - بما في ذلك أنظمة ACTOR و SAM و CATS من بين أنظمة أخرى (Diamond و Soleil و SPring-8 و Photon Factory و CLSI وعبر الولايات المتحدة الأمريكية)
الأبعاد الجزيئيةالقياسية للرغوة DewarMD7-355.7 بوصة قطر بعمق 2.8 بوصة. سعة 800 مل.
CryoLoop مثبت على CryoLoop - 20 ميكرونHamptonHR4-955CryoLoops مع نايلون بقطر 20 ميكرون. ترتبط حلقات النايلون هذه بأنابيب MicroTubes من الفولاذ المقاوم للصدأ المجوفة والتجارة. التي تستخدم لتركيب البلورة وتجميدها وتأمينها أثناء إجراءات البلورات البردية وجمع بيانات الأشعة السينية. توجد أحجام مختلفة ويمكن تكييفها في الطول. إنها أدوات متعددة الاستخدامات.
الأبعاد الجزيئيةCryoWandMD7-411
أداة تحميل عفريت ديوارالأبعاد الجزيئيةMD7-607تستخدم هذه الأداة لفصل كرات الصولجان الأحادية لتحميلها في ديوار الروبوت. يتكون من قطعتين: جزء أنبوب تفلون وجزء قضيب معدني.
كاملة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Austrian, R. Prevention of pneumococcal infection by immunization with capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae: current status of polyvalent vaccines. J Infect Dis. 136, S38-S42 (1977).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect Dis. 4 (3), 144-154 (2004).
  3. van Mens, S. P., et al. Longitudinal analysis of pneumococcal antibodies during community-acquired pneumonia reveals a much higher involvement of Streptococcus pneumoniae than estimated by conventional methods alone. Clin Vaccine Immunol. 18 (5), 796-801 (2011).
  4. Weycker, D., Strutton, D., Edelsberg, J., Sato, R., Jackson, L. A. Clinical and economic burden of pneumococcal disease in older US adults. Vaccine. 28 (31), 4955-4960 (2010).
  5. Doern, G. V. Antimicrobial use and the emergence of antimicrobial resistance with Streptococcus pneumoniae in the United States. Clin Infect Dis. 33, Suppl 3. S187-S192 (2001).
  6. Vasoo, S., et al. Increasing antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae colonizing children attending day-care centres in Singapore. Respirology. 16 (8), 1241-1248 (2011).
  7. Black, S., et al. Efficacy, safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Northern California Kaiser Permanente Vaccine Study Center Group. Pediatr Infect Dis J. 19 (3), 187-195 (2000).
  8. Hanage, W. P., et al. Diversity and antibiotic resistance among nonvaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae carriage isolates in the post-heptavalent conjugate vaccine era. J Infect Dis. 195 (3), 347-352 (2007).
  9. Burnaugh, A. M., Frantz, L. J., King, S. J. Growth of Streptococcus pneumoniae on human glycoconjugates is dependent upon the sequential activity of bacterial exoglycosidases. J Bacteriol. 190 (1), 221-230 (2008).
  10. King, S. J. Pneumococcal modification of host sugars: a major contributor to colonization of the human airway? Mol Oral Microbiol. 25 (1), 15-24 (2010).
  11. Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
  12. Buckwalter, C. M. Pneumococcal carbohydrate transport: food for thought. Trends Microbiol. 20 (11), 517-522 (2012).
  13. Bidossi, A., et al. A functional genomics approach to establish the complement of carbohydrate transporters in Streptococcus pneumoniae. PLoS One. 7 (3), e33320(2012).
  14. Zheng, X., Gan, L., Wang, E., Wang, J. Pocket-based drug design: exploring pocket space. AAPS J. 15 (1), 228-241 (2013).
  15. Singh, S., Malik, B. K., Sharma, D. K. Molecular drug targets and structure based drug design: A holistic approach. Bioinformation. 1 (8), 314-320 (2006).
  16. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), (2011).
  17. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips. A laboratory manual. Bergfors, T. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
  18. Scapin, G. Molecular replacement then and now. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 11), 2266-2275 (2013).
  19. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  20. McCoy, A. J., Read, R. J. Experimental phasing: best practice and pitfalls. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 458-469 (2010).
  21. Dodson, E. Is it jolly SAD? Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1958-1965 (2003).
  22. Incardona, M. F., et al. EDNA: a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. J Synchrotron Radiat. 16 (Pt 6), 872-879 (2009).
  23. Popov, A. N., Bourenkov, G. P. Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 7), 1145-1153 (2003).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Can I solve my structure by SAD phasing? Planning an experiment, scaling data and evaluating the useful anomalous correlation and anomalous signal. Acta Crystallogr D Struct Biol. 72 (Pt 3), 359-374 (2016).
  25. Millan, C., Sammito, M., Uson, I. Macromolecular ab initio phasing enforcing secondary and tertiary structure. IUCrJ. 2 (Pt 1), 95-105 (2015).
  26. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 325-338 (2010).
  27. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 235-242 (2000).
  28. Bird, L. E., et al. Green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. J Vis Exp. (95), e52357(2015).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35 (6), e45(2007).
  30. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  31. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. , (2016).
  32. Culurgioni, S., Tang, M., Walsh, M. A. Structural characterization of the Streptococcus pneumoniae carbohydrate substrate-binding protein SP0092. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 73 (Pt 1), 54-61 (2017).
  33. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357 (2), 289-298 (2006).
  34. Wooh, J. W., Kidd, R. D., Martin, J. L., Kobe, B. Comparison of three commercial sparse-matrix crystallization screens. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 4), 769-772 (2003).
  35. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov Today. 21 (5), 819-825 (2016).
  36. Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221 (1), 31-34 (1991).
  37. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 10), 1426-1431 (2005).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29 (5), 584-587 (1996).
  39. Teng, T. -Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  40. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 10), 1251-1259 (2006).
  41. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. J Synchrotron Radiat. 17 (5), 700-707 (2010).
  42. Leonard, G. A., et al. Online collection and analysis of X-ray fluorescence spectra on the macromolecular crystallography beamlines of the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 333-335 (2009).
  43. Walsh, M. A., Evans, G., Sanishvili, R., Dementieva, I., Joachimiak, A. MAD data collection - current trends. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1726-1732 (1999).
  44. Dauter, Z. Data-collection strategies. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1703-1717 (1999).
  45. Finke, A. D., et al. Advanced Crystallographic Data Collection Protocols for Experimental Phasing. Methods Mol Biol. 1320, 175-191 (2016).
  46. Gonzalez, A. Optimizing data collection for structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1935-1942 (2003).
  47. Leslie, A. G. The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 1), 48-57 (2006).
  48. Winter, G., Lobley, C. M., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 7), 1260-1273 (2013).
  49. Sheldrick, G. M. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 479-485 (2010).
  50. Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nat Commun. 4, 2777(2013).
  51. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (Pt 6), 582-601 (2009).
  52. Vonrhein, C., Blanc, E., Roversi, P., Bricogne, G. Automated structure solution with autoSHARP. Methods Mol Biol. 364, 215-230 (2007).
  53. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. 25 (1), 79-93 (2017).
  54. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Thermal Shift AssaySize Exclusion ChromatographyMulti Angle Light ScatteringX ray Anomalous DiffractionCrystallization TrialsStreptococcus pneumoniaeOligomerization StatesBuffer Stability

مقالات ذات صلة