جيل تعطيل الجينات العقدية mutans سلالة دون الجيني الاستنساخ

ملخص

يصف لنا طريقة سهلة وسريعة وغير مكلفة نسبيا لتوليد الجينات تعطل العقدية mutans سلالات؛ قد يكون هذا الأسلوب تكييف لتوليد سلالات تعطل الجينات من مختلف الأنواع.

الملخص

أساليب نموذجية لتوضيح وظيفة الجينات خاصة تشمل التحليلات المقارنة المظهرية من سلالة البرية من نوع وسلالة التي تعطلت في الجينات للفائدة. بنية الحمض النووي تعطيل جينات التي تحتوي على جينات مقاومة للمضادات الحيوية مناسبة علامة مفيد لتوليد سلالات تعطلت الجين في البكتيريا. ومع ذلك، أساليب البناء التقليدية، التي تتطلب خطوات استنساخ الجينات، تنطوي على بروتوكولات معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً. هنا، يتم وصف طريقة سهلة نسبيا وسريعة، وفعالة من حيث التكلفة لتعطيل الجينات المستهدفة في mutans العقدية . ويستخدم الأسلوب انصهار 2-الخطوة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتوليد بنية التعطيل وانهانسر للتحول الوراثي. هذا الأسلوب لا يتطلب فعل الانزيمية، عدا بكر، بالإضافة إلى ذلك يوفر مرونة أكبر فيما يتعلق بتصميم بنية التعطيل. توظيف انهانسر يسهل إعداد الخلايا المختصة ويحسن كفاءة التحويل. الأسلوب الحالي قد تكون مناسبة لتوليد سلالات تعطل الجينات من مختلف الأنواع.

المقدمة

عادة ما ينطوي على تحليل وظيفة الجينات مقارنة المظهرية بين سلالة البرية من نوع وسلالة قد تعطلت فيها جين معين للفائدة. وقد استخدمت هذا الأسلوب تعطيل الجينات لتحليلات وظيفة الجينات في مجموعة واسعة من الأصناف، من البكتيريا إلى الثدييات. بناء جينات تعطل ضروري لتوليد سلالة تعطل الجينات؛ هذا بنية الحمض الخلوي الصبغي (DNA) يتكون من الجينات المقاومة للمضادات الحيوية علامة تنصهر إلى المنبع والمصب المرافقة مناطق الجينات المستهدفة، وأدمجت في الجينوم عن طريق جزئ مثلى. قد يكون سلالة تعطل الجينات المعزولة باستخدام وسائل الإعلام الانتقائي التي تحتوي على المضادات الحيوية. الطريقة التقليدية المستخدمة في تشييد سلالة الجينات تعطل يتطلب خطوات معقدة، مثل تضخيم الجينات المستهدفة بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ربط الجين في بلازميد مناسبة، الهضم مع تقييد الإنزيمات، وريليجيشن لإدراج الجين علامة مقاومة المضادات الحيوية. هذه العملية مضيعة للوقت، أخذ عدة أيام إلى عدة أسابيع، اعتماداً على نجاح كل خطوة. وبالإضافة إلى ذلك، تصميم بنيات تعطيل اعتماداً على مواقع إنزيم التقييد للجينات المستهدفة. لحل هذه المشكلات، أبلغ عن الحمض النووي القائم على بكر الربط أساليب^1،2 لتصميم طفرات الجينات تعطل ديسكويديوم ديكتيوستيليوم³ وسينيتشوسيستيس sp. PCC6803⁴ . في هذه الدراسة، تم تطوير أسلوب لتوليد سلالة العقدية تعطل الجينات بطريقة سريعة، وسهلة، وغير مكلفة نسبيا، استخدام أسلوب المستندة إلى بكر معدلة (عين 2-الخطوة الانصهار PCR) لتشييد تعطل بناء وانهانسر للتحول الوراثي.

2-الخطوة الانصهار يتطلب PCR الحمض النووي والجينات المقاومة للمضادات الحيوية علامة كقالب PCR، وأربعة أزواج من الأنسب المصممة اليغنوكليوتيد كبسولة تفجير. في الخطوة الأولى (1^st PCR)، منطقة ترافقه المنبع 1 كيلوبايت من الجينات المستهدفة، منطقة ترافقه المصب كيلو بايت-1 الهدف تتضخم الجينات، والجين علامة مقاومة المضادات الحيوية ببكر. المناطق 5 ' عكس التمهيدي والتمهيدي إلى الأمام، للتضخيم من المنبع والمصب المرافقة المناطق، على التوالي، تشمل 15 قواعد مكملة لنهايات الجين ماركر. وبالمثل تتضمن 5 ' مناطق الإشعال على حد سواء إلى الأمام أو عكس للتضخيم الجيني علامة 15 قواعد مكملة للنهاية السفلي لمنطقة ترافقه المنبع الجينات المستهدفة والحد الأعلى لمنطقة ترافقه المصب من الجينات المستهدفة، على التوالي. ولذلك تتضمن ثلاث شظايا تضخيم متراكبتين زوج 30-قاعدة في موقع الانصهار. في الخطوة الثانية (2^nd PCR)، يتم إجراء PCR مع الإشعال PCR متداخلة باستخدام الأجزاء الثلاثة تضخيمه قبل 1^st PCR كقوالب. بالإضافة إلى ذلك ترتبط المناطق مكملة للقوالب ببعضهما البعض عبر 2^nd PCR. وأخيراً، البناء جزئ مثلى هو عرض لسلالة البرية من نوع انهانسر. من الممكن التحقق من اضطراب الجينات الناجحة PCR باستخدام كبسولة تفجير محددة. على الرغم من أن يتم تضخيمه في بناء تعطيل استخدام عالية الدقة بوليميريز الحمض النووي، التفاعلات الانزيمية إضافية، مثل ربط الحمض النووي أو الهضم الحمض النووي، وليست ضرورية لتوليد بنية. وبالإضافة إلى ذلك، قد اختار منطقة المحذوفة أو المحافظة على الجينوم مرونة وفقا للتصميم التمهيدي.

في هذا العمل، أجرى الحذف للمنطقة بأسرها ترميز الجينات جتفك ، الذي يقوم بترميز جلوكوسيلترانسفيراسي في mutans العقدية، لإظهار طريقة تعطيل الجينات سريعة وسهلة في أنواع العقدية. بالإضافة إلى ذلك، جتفب-ولدت ضغطاً تعطلت بنفس الطريقة. تسهم جلوكوسيلترانسفيراسيس المشفرة بواسطة جتفك و جتفب كاريوجينيك بيوفيلم الأسنان التنمية^5،6. قدرات تشكيل بيوفيلم البرية-النوع سلالة (S. mutans WT)، جتفك-عطلت السلالة (ΔS. mutans جتفك)، وجتفب-قيمت سلالة تعطل (S. mutans Δجتفب) لتحليل مقارن المظهرية. هذا البروتوكول يمتد تطبيق أسلوب خطوتين لتعطيل الجينات أنواع إضافية ويمكن تعديله للدراسات المتعلقة بوظيفة الجينات في مجموعة واسعة من الأصناف.

البروتوكول

1-"التصميم التمهيدي"

1. إعداد كبسولة تفجير للانصهار 2-الخطوة بكر والتحقق من اضطراب الجينات.
   ملاحظة: يبين الجدول 1 في تسلسل التمهيدي المستخدمة في هذا البروتوكول. ويبين الشكل 1 مثالاً تخطيطي أسلوب PCR الانصهار الخطوة 2 تستخدم لتوليد S. mutans Δ جتفك.
   1. كبسولة تفجير تصميم للاستعاضة عن المنطقة المستهدفة في الجينوم مع الجينات (توافق آراء ساو باولو ^r) المقاومة بالسبيكتينوميسين ⁷. يستبدل هذا البروتوكول ترميز المنطقة بأسرها من الجينات جتفك توافق آراء ساو باولو ^r-
   2. وتشمل 15 قواعد مكملة لتحقيق الغايات العليا والسفلي من توافق آراء ساو باولو ^r 5 ' مناطق عكس أعلى وأسفل إلى الأمام الإشعال، على التوالي. وبالمثل، تشمل 15 قواعد مكملة للنهاية السفلي لمناطق ترافقه المنبع جتفك ونهاية العلوي من مناطق المصب ترافقه جتفك 5 ' المناطق من توافق آراء ساو باولو ^r-إلى الأمام و توافق آراء ساو باولو ^r --عكس الإشعال، على التوالي ( الشكل 1A).
      ملاحظة: تسلسل لعكس أعلى، لأسفل إلى الأمام، توافق آراء ساو باولو ^r-إلى الأمام، و توافق آراء ساو باولو ^r-عكس كبسولة تفجير تتحدد تلقائياً تبعاً للموقع التأسيس بناء تعطل.
   3. تصميم الإشعال يصل إلى الأمام وإلى أسفل عكس تشمل > كيلو بايت-1 المنبع والمصب المرافقة مناطق الجينات جتفك، على التوالي. ضبط درجة حرارة ذوبان (T _m) لتصل إلى الأمام وإلى أسفل عكس الإشعال وفقا لدرجة حرارة ذوبان الإشعال عكس أعلى وأسفل إلى الأمام، على التوالي ( الشكل 1A).
      ملاحظة: تشير إلى الصيغة التالية لتحديد ر _م: تي _م (درجة مئوية) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * نغ)--5، حيث * تمثل N عدد النيوكليوتيدات التمهيدي مع هوية المحدد (A, T، ج أو G).
   4. تصميم كبسولة تفجير المتداخلة (N_up إلى الأمام وعكس N_up) ل 2 ^nd بكر ( الشكل 1B).
      ملاحظة: على الرغم من أن زوج الأبعد التمهيدي (تصل إلى الأمام وإلى أسفل عكس) قد تستعمل ككبسولة تفجير 2 ^nd بكر، صممت الإشعال المتداخلة (N_up إلى الأمام وعكس N_up) في هذا البروتوكول. كبسولة تفجير متداخلة مطلوبة كثيرا ل 2 ^nd بكر، كما هو مفصل في نتائج الممثل.
   5. كبسولة تفجير تصميم محددة توافق آراء ساو باولو ^r. وتستخدم كبسولة تفجير مستعمرة بكر على الشاشة لتعطيل جتفك.
   اضطراب
   6. كبسولة تفجير تصميم للتحقق من جتفك.
      ملاحظة: المنتجات بكر تضخيم استخدام كبسولة تفجير هذه على جانبي الحدود بين جتفك أو توافق آراء ساو باولو ^r والمنبع أو المصب المرافقة مناطق جتفك. مجموعات التمهيدي ' جتفك يصل إلى الأمام و جتفك عكس حتى ' و ' جتفك لأسفل إلى الأمام و جتفك لأسفل--عكس ' محددة جتفك، و ' جتفك يصل إلى الأمام و توافق آراء ساو باولو ^r 2 -عكس ' و ' توافق آراء ساو باولو ^r 2 إلى الأمام و جتفك لأسفل--عكس ' محددة توافق آراء ساو باولو ^r-

2. استخراج الحمض النووي الجينومي من S. mutans

s

1. متواصلة الأسهم ماتان س. UA159 على طبق أجار تسريب (بهي) قلب المخ. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
2. تلتقط مستعمرة واحدة باستخدام مسواك معقمة وتطعيم أنه في 5 مل مرق بهي. احتضان الثقافة ماتان S. s بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
3. ثقافة الخلية البكتيرية من أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 2,000 × زاي ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
4. الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 2,000 × زاي ريسوسبيند بيليه الخلية في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
5. استخراج الحمض النووي من تعليق استخدام الحمض النووي جينومي حبة-ضرب قاعدة استخراج عدة وفقا للإرشادات المتوفرة من قبل الشركة المصنعة.
   1. نقل التعليق لنموذج 2.0 مل أنبوب يحتوي على الزجاج الخرز (المدرجة في هذه المجموعة). إضافة 750 ميليلتر من حل تحلل (ضمن الطقم) إلى تعليق خلية.
   2. كاب محكم ووضع الأنابيب شكل متناظر في حامل أنبوب الجهاز تعطل حبة-الضرب. العملية في السرعة القصوى لمدة 5 دقائق. نقل عينات أجهزة الطرد المركزي الضرب حبة لمدة 1 دقيقة في 10,000 × زاي المادة طافية إلى تصفية زيادة ونقصان (ضمن الطقم) في أنبوب جمع 2.0 مل والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 7,000 × ز .
   3. ميليلتر 1,200 إضافة للحمض النووي ملزم العازلة (المضمنة في مجموعة أدوات) فيلتراتي. نقل 800 ميليلتر من الخليط لعمود الدوران (ضمن الطقم) إلى أنبوب جمع 2.0 مل والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10,000 × زاي
   4. تجاهل التدفق عبر، إضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت الغسل المسبق (ضمن الطقم) إلى العمود تدور ليغسل مصفوفة العمود، والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في زاي 10,000 × تجاهل التدفق من خلال، بإضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (ضمن الطقم) تدور عمود يغسل مصفوفة العمود، والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10,000 × زاي
   5. ضع عمود الدوران في أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي جديدة وإضافة 100 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت (ضمن الطقم) إلى مصفوفة العمود.
   6. الطرد المركزي لمدة 30 ق في 10,000 × ز الوت الحمض النووي. تقدير تركيز الحمض النووي والنقاء عن طريق قياس امتصاص في 260 nm و 280 نموسينج جهاز المطياف الضوئي والتأكد من أن نسبة ₂₈₀ &/A ₂₆₀ ألف أكبر من 1.8.

3. [بكر] تضخيم

1. إجراء 1 ^st PCR استخدام الجينوم s WT ماتان س. والجينات الاصطناعية توافق آراء ساو باولو ^r كقوالب بكر (انظر الجدول 1). تضخيم المنطقة ترافقه المنبع الجينات جتفك، منطقة ترافقه المصب من الجينات جتفك، و توافق آراء ساو باولو ^r الجينات باستخدام ثلاث مجموعات من الإشعال الموصوفة أعلاه ( الشكل 1A)، ككل الجدول 2 و الجدول 3-
   ملاحظة: بكر الإشعال، الكواشف، ودورات التضخيم-ويرد في الجدول 1 و الجدول 2 و الجدول 3، على التوالي.
2. يجزئ كل منتج بكر على 1% [اغروس] هلام والمكوس العصابات المقابلة باستخدام قاطع هلام فرقة-
3. تنقية كل منتج تضخيم الحمض النووي من الجل استخدام عدة تدور استخراج غشاء مطاطي هلام السليكا والعمود--
   1. نقل جل الشرائح إلى ميكروسينتريفوجي نظيفة أنبوب وتخلط مع 500 ميليلتر ملزم المخزن المؤقت (المدرجة في هذه المجموعة). احتضان هذا الخليط في 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة حتى يتم تماما يذوب شرائح جل.
   2. ضع عمود الدوران (ضمن الطقم) إلى أنبوب جمع (المدرجة في المجموعة)، وتحميل العينة على عمود الدوران، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 11,000 × ز. تجاهل في التدفق من خلال، إضافة 600 ميليلتر من "المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي" (ضمن الطقم) إلى "العمود تدور" ليغسل الغشاء والسليكا، والطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 11,000 × ز.
   3. تجاهل من خلال التدفق والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في × 11,000 ز لتجفيف الغشاء والسليكا.
   4. ضع عمود الدوران في أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي جديدة، وإضافة 50 ميليلتر "شطف المخزن المؤقت" (المدرجة في المجموعة)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 2
   5. الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة مبلغ 000 11 × ز الوت تضخيم الحمض النووي. تقدير تركيز الحمض النووي والنقاء عن طريق قياس امتصاص في 260 nm و 280 نموسينج جهاز المطياف الضوئي والتأكد من أن نسبة ₂₈₀ &/A ₂₆₀ ألف أكبر من 1.8.
4. إجراء 2 ^nd بكر 2-الخطوة الانصهار PCR باستخدام شظايا اكويمولار حوالي ثلاثة كقوالب PCR، وفقا الجدول 2 < المنبوذةرونغ > و الجدول 3-
   ملاحظة: هذه الشظايا تم تضخيمها وتقسم باستخدام كبسولة تفجير متداخلة ' N_up إلى الأمام وعكس N_down ' أو كبسولة تفجير الأبعد ' يصل إلى الأمام وإلى أسفل عكس ' ( الشكل 1B). [بكر] كبسولة تفجير، والكاشفات ودورات التضخيم-ويرد في الجدول 1 و الجدول 2 و الجدول 3، على التوالي.
5. تحميل عشر الخليط تفاعل PCR (5 ميليلتر) على 0.8% [اغروس] هلام وقارن حجم الفرقة تضخيم حجم الفرقة المتوقعة لتأكيد توليد amplicon المناسبة ( الشكل 1).
6. تركيز المنتج بكر النهائية المتبقية من الإيثانول هطول الأمطار دون تنقية.
   1. 55 إضافة ميليلتر من نقية جداً المياه إلى خليط بكر المتبقية لضبط الحجم الإجمالي إلى 100 µL.Add وحدة تخزين واحدة-العاشر من م 3 خلات الصوديوم (10 ميليلتر)، الرقم الهيدروجيني 5.2، متبوعاً بحجم 2.5 من 100% إيثانول (250 ميليلتر). خلط وتجميد لمدة 30 دقيقة في-80 درجة مئوية.
   2. الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 15,000 × ز في 4 درجات مئوية، تحقق بيليه على الجزء السفلي من الأنبوب، وتجاهل المادة طافية. أغسل بيليه مع 1 مل إيثانول 70 ٪، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 15,000 × ز في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية. أيردري بيليه لما يقرب من 30 دقيقة، وحل مع 10 ميليلتر من الماء النقي جداً-

4. إعداد الخلية المختصة وتحول الخلايا

s

1. متواصلة الأسهم ماتان س. UA159 على طبق أجار بهي. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
2. تلتقط مستعمرة واحدة باستخدام مسواك معقمة وتطعيم أنه في 5 مل مرق بهي. احتضان الثقافة ماتان S. s بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
3. نقل 2 مل ثقافة s س ماتان إلى 50 مل مرق بهي واحتضانها ح 6-8 في 37 درجة مئوية كثافة بصرية في 600 نانومتر (OD ₆₀₀) 0.2-0.4 الظروف اللاهوائية.
4. الطرد المركزي الخلايا لمدة 15 دقيقة في 2,000 × ز في 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية وتغسل الخلايا مرتين مع 40 مل الماء المثلج تليها 40 مل من 10% والغليسيرول.
   ملاحظة: يؤثر على المواد المتبقية انهانسر اللاحقة-
5. نضح المادة طافية بعناية مع ماصة باستور انخفاض انضمام بيليه الخلية في والغليسيرول 10%. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من جديد 10% والغليسيرول والاستغناء عن 50 ميليلتر من التعليق إلى كل أنبوبة 1.5 مل ميكروسينتريفوجي وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى قبل استخدام.
6. ميكس 50 ميليلتر قاسمة من الخلايا المختصة المثلج مع 5 ميليلتر للتعطيل بناء الوارد وصفها أعلاه في المقطع 3. إضافة الخليط إلى الترعة انهانسر (مع مسافة 0.2 سم بين أقطاب). تستخدم طريقة المكوّرات العنقودية الذهبية (1.8 كيلو فولت، 10 µF نبض 1، 600 Ω) جهاز انهانسر إلى اليكتروبوراتي.
تعليق الخلايا في 500 ميليلتر من مرق بهي فور انهانسر
7. وإضافة 50 ميليلتر من التعليق لوحات أجار بهي المحتوية على بالسبيكتينوميسين-
   ملاحظة: وقت حضانة إضافية بعد انهانسر غير مطلوب. إلا أن الحضانة ح 1-2 بعد انهانسر تحسين كفاءة التحويل.
8. احتضان اللوحة 2-6 أيام في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
   ملاحظة: يتم إنشاء mutans س. Δ جتفب كما هو موضح أعلاه. يتم استبدال المنطقة بأسرها ترميز الجينات جتفب مع الجينات المقاومة الاريثروميسين ⁸ في mutans س. Δ جتفب. هو مثقف كل سلالة S. mutans في مرق بهي في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.

5. التحقق من اختلال الجينات والتخزين

1. بيك مستعمرات عشوائية وتطعيم منهم إلى الخليط PCR لأداء مستعمرة [بكر] وفقا الجدول 2 و الجدول 3. [بكر] كبسولة تفجير، والكاشفات ودورات التضخيم-ويرد في الجدول 1 و الجدول 2 و الجدول 3، على التوالي.
2. تحميل الخليط رد فعل بكر على 1% [اغروس] هلام للتأكد من توافق آراء ساو باولو ^r-محدد الحمض النووي الفرقة-
3. بيك مرق مستعمرة إيجابية باستخدام مسواك معقمة وخلايا فرعية في 10 مل بهي المحتوية على بالسبيكتينوميسين لمدة يومين في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
4. التحقق من توليد Δ S. mutans جتفك.
   1. تقسيم تعليق خلية على قدم المساواة. استخراج الحمض النووي من الخلايا المذكورة أعلاه (خطوات 2.3. إلى 2.5.5.). إجراء PCR مع الحمض النووي كقالب بكر، استخدام كبسولة تفجير لتحقق اضطراب جتفك (الجدول 1) وفقا الجدول 2 و الجدول 3-
      ملاحظة: كبسولة تفجير بكر والكاشفات ودورات التضخيم-ويرد في الجدول 1 و الجدول 2 و الجدول 3، على التوالي.
   2. تحميل الخليط بكر على 2% [اغروس] هلام وقارن حجم الفرقة تضخيم حجم الفرقة المتوقعة لتأكيد توليد amplicon المناسبة .
   3. الطرد المركزي بتعليق الخلية المتبقية لمدة 15 دقيقة في 2,000 × ز 4 ° C. ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من برنامج تلفزيوني.
   4. الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 2,000 × ز 4 ° "جيم ريسوسبيند" الخلية بيليه في 1.5 مل مرق بهي المحتوية على الجلسرين 25% وتخزينها في-80 ° Cor-20 درجة مئوية.

6. تحليل المظهرية

1. متواصلة كل ماتان S. s ضغطاً على طبق أجار بهي. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
2. تلتقط مستعمرة واحدة باستخدام مسواك معقمة وتطعيم ذلك إلى 2 مل مرق بهي مع أو بدون المضادات الحيوية مناسبة. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
3. تلقيح 20 ميليلتر من تعليق الثقافة بين عشية وضحاها إلى 2 مل مرق بهي تحتوي على السكروز 1% أو 5% دون المضادات الحيوية في أنبوب اختبار زجاج؛ وثقافة الخلايا مع أنبوبة الاختبار في وضع يميل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية.
4. دوامة الزجاج أنابيب الاختبار لمدة 10 ق وصب المعلقات الثقافة. تغسل أنابيب الاختبار ثلاث مرات بماء مقطر. أضف 1 مل 0.25% أخذ بريليانت الأزرق (مصرف البحرين المركزي) وصمة عار في الأغشية الحيوية على جدار الأنبوبة، وثم احتضانها للحد الأدنى 1
5. صب الحل المصبوغة وتغسل أنابيب الاختبار ثلاث مرات بماء مقطر وجاف في أنابيب الاختبار.
6. تقييم كثافة اللون والتمديد لمصرف البحرين المركزي الملون-بيوفيلم بصريا لتحديد إمكانية تشكيل بيوفيلم في تحليل المظهرية.

النتائج

ويبين الشكل 2 أن حجم كل منتج من 1^st بكر، كما لوحظ في 1% [اغروس] هلام، كان في اتفاق جيد مع الحجم المتوقع لحوالي 1 كيلو بايت. ويبين الشكل 3 التحليل الكهربي جل من منتجات 2^nd PCR. ويبين الشكل 4 مستعمرات S. mutans تتحول مع بنية التعطيل، وتحليل التفريد جل لمستعمرة [بكر] منتوجات. وكان أمبليكونس من جميع المستعمرات من الحجم المتوقع. ويبين ا...

المناقشة

في هذا البروتوكول، يجب أن تصمم الإشعال ل 1^st PCR لتضخيم حوالي 1 كيلوبايت من المنبع والمصب المرافقة مناطق المنطقة المستهدفة في الجينوم. تسلسلات طويلة ترافقه هذه ضرورية لتحسين كفاءة جزئ مثلى.

تسلسل الإشعال (عكس أعلى، لأسفل إلى الأمام، توافق آراء ساو باولو^r-إلى الأمام، و توافق آراء ساو باولو^r-عكس) في هذا البروتوكول تحددت تلقائياً استناداً إلى الموقع التأسيس بناء التعطيل. ويشمل كل التمهيدي 15 قواعد مكملة لنهاية القالب بكر 2^nd في المنطقة...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Streptococus mutans< / em>	سلالة مخزون في المختبر.		سلالة من النوع البري (سلالة UA159)
مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي	Zymo Research	D6005
جهاز تعطيل ضرب الخرزة	Taitec	GM-01
الجينات الاصطناعية	Eurofins الجينوم	الجين	المقاوم للسبيكتينومايسين والإريثروميسين
حسب الطلب المنظم الحراري	Astec	PC-708
PCR الاشعال	Eurofins Genomics		35 قاعدة بطول
بوليميراز الحمض النووي	Takara	R045A	طقم استخراج هلام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة
	Nippon Genetics	FG-91202	استخراج الحمض النووي من هلام الاغاروز
قاطع نطاق الجل	Nippon Genetics	FG-830
مقياس الطيف الضوئي	بيكمان كولتر	DU 800
المثقور الكهربائي	Bio-rad	1652100
التثقيب الكهربائي كوفيت	Bio-rad	1652086	فجوة 0.2 سم
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	نظام الثقافة اللاهوائية
مرق ضخ القلب في الدماغ	بيكتون ، ديكنسون	237500	وسائط الثقافة البكتيرية
Spectinomycin	Wako	195-11531	المضادات الحيوية
Erythromycin	Wako	057-07151	المضادات الحيوية
السكروز	Wako	196-00015	لتطوير الأغشية الحيوية
CBB R-250	Wako	031-17922	لتلوين الأغشية الحيوية