يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تطبيق جديد لطائرة البلازما الضغط الجوي كعامل العصبية واقية ضد الإصابات الناجمة عن الحرمان الجلوكوز خلايا ش SY5Y

8.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56323

⸱

أكتوبر 9, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathophysiology, Beijing Neurosurgical Institute/Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, 2School of Physics, Beijing Institute of Technology, 3Beijing Key Laboratory of Central Nervous System Injury, Beijing Neurosurgical Institute, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Translational Medicine for Cerebrovascular Disease, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, 5China National Clinical Research Center for Neurological Diseases, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

بروتوكول لتطبيق العلاج البلازما جرعة منخفضة الضغط الجوي على إصابات SH-SY5Y الناجمة عن الحرمان الجلوكوز محصن.

الملخص

جيت البلازما الضغط الجوي (أبي) جذبت انتباه العديد من الباحثين من تخصصات متعددة في السنوات الأخيرة نظراً لانبعاثاته وتشمل أنواع متعددة من الأنواع النيتروجين التفاعلي (RNS) والأكسجين التفاعلية (روس). وقد أظهرت الدراسة السابقة تأثير cytoprotective أبي ضد الإصابات الناجمة عن الإجهاد التأكسدي. الهدف من هذه الدراسة تقديم بروتوكول علاج مفصلة في المختبر فيما يتعلق بالتطبيقات محصن من الهليوم عبيس عن الضرر الناجم عن الحرمان الجلوكوز في الخلايا SH-SY5Y. وأبقى على خط الخلية البشرية المستمدة من نيوروبلاستوما SH-SY5Y في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع مصل العجل الجنين 15%. ثم تم تغيير المتوسطة الثقافة إلى RPMI 1640 دون السكر قبل العلاج أبي. بعد ح 1 احتضان في حاضنة خلية، تقرر بقاء الخلية باستخدام خلية العد طقم 8. وأظهرت النتائج أنه، مقارنة بمجموعة الحرمان الجلوكوز، الخلايا تعامل مع أبي عرضت بقاء الخلية زيادة كبيرة بطريقة تعتمد على الجرعة، مع 8 s/جيدا ولاحظ كجرعة أمثل. وفي الوقت نفسه، كان تدفق الهليوم أي تأثير على الأضرار الناجمة عن الحرمان خلية الجلوكوز. نتائجنا أشارت إلى أنه يمكن استخدام أبي كأسلوب علاج للأمراض في الجهاز العصبي المركزي تتصل بالحرمان الجلوكوز محتملة. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول كتطبيق cytoprotective للخلايا الأخرى ذوي العاهات المختلفة، لكن ينبغي تعديل خلية ثقافة وظروف العلاج أبي، وجرعة العلاج يجب أن تكون منخفضة نسبيا.

المقدمة

الدماغ الكبار حصرا تقريبا يستخدم الجلوكوز كركيزة استقلاب الطاقة تحت ظروف فيزيولوجية طبيعية. دماغ الإنسان يشكل 2% فقط من وزن الجسم ولكنه يستهلك حوالي 25% من مجموع الجلوكوز داخل الجسم1. أنه تم توثيقه جيدا أن خلل استقلاب الجلوكوز أحد التغيرات الباثولوجية الرئيسية أثناء السكتة الدماغية، وأمراض الأعصاب المختلفة، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) ومرض هنتنغتون (HD)، ومرض باركنسون (PD) 2،3. نقص الجلوكوز والإقبال على ضعف تحمل الجلوكوز أو الفسفرة يمكن أن تؤثر تأثيراً مباشرا على إنتاج ATP وكذلك الحث على موت الخلايا العصبية، التي قد تزيد من خطر خلل الخلايا العصبية، مما يوحي بأن الحفاظ على بقاء الخلية أو تأخير الإصابة الخلية بعد الجلوكوز الحرمان قد يكون نهجاً معقولاً لعلاج هذه الأمراض. التحقيق في آثار محصن عن طريق التحوير الجلوكوز، مع التركيز على العوامل المضادة للالتهابات، أيون قناة المغيرون، الزبالين الراديكالية الحرة، وعوامل نيوروتروفيك، كانت إلخ للفائدة. ومع ذلك، لم ترجمة لهذه النهج محصن من مقاعد البدلاء للممارسة السريرية ناجحة4.

الضغط الجوي طائرات البلازما (عبيس) هي نوع جديد من تكنولوجيا تصريف الغاز الغلاف الجوي درجات الحرارة المنخفضة التي جذبت انتباه العديد من الباحثين من تخصصات متعددة في السنوات الأخيرة. أبجس وقد استخدمت على مدى عقود في مختلف التطبيقات الطبية مثل علاج سرطان الخلية، المنظمة البكتيرية، تخثر الدم، والتئام الجروح، وطب الفم، إلخ5،6، بسبب انبعاثاته أنواع متعددة للنيتروجين التفاعلي الأنواع (RNS) والأكسجين التفاعلية (روس) (الشكل 1)7. تطبيقات الطب الحيوي البلازما السابقة ركزت أساسا على الإجهاد التأكسدي و/أو نيتراتيفي في البكتيريا والخلايا والأنسجة8. ومع ذلك، يمكن أبي أيضا "سيف ذو حدين" أن RNS وروس جزيئات الإشارات داخل الخلايا الهامة المتصلة بالعديد من العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية9. أكسيد النيتروز (لا) يتحكم في مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية وتقوم بدور مزدوج في الجسم البشري، ولا سيما في الجهاز العصبي المركزي (CNS). وأظهرت انخفاض مستويات لا أنشطتها محصن على حد سواء في المختبر و في فيفو عبر مسارات الإشارات متعددة10. دراستنا السابقة ذكرت أولاً أن الهليوم أبي الناجمة عن أي إنتاج متورط في أثر أبي محصن ضد الإصابات الناجمة عن الإجهاد التأكسدي11. ومع ذلك، لم تبلغ آثار عبيس على إصابات أخرى. ولذلك، الهدف من هذه الدراسة تقديم بروتوكولا علاج في المختبر فيما يتعلق بالتطبيقات محصن من الهليوم أبي عن الضرر الناجم عن الحرمان الجلوكوز في الخلايا SH-SY5Y. يختلف عن الدراسات السابقة، لدينا بروتوكول تستخدم المعالجة بالبلازما الجرعات المنخفضة لتطبيقات محصن دون العواقب الإصابات المفرطة المستحثة بالبلازما، مشيراً إلى أنه يمكن استخدام العلاج أبي يحتمل أن تكون كرواية "لا المخدرات المانحين "للبحث في المستقبل، وحتى بالنسبة للترجمة السريرية. كما اقترح هذا البروتوكول لاستخدامها كتطبيق cytoprotective لأنواع الخلايا الأخرى ذوي العاهات المختلفة، ولكن ظروف العلاج أبج يجب أن تكون إعادة تعديلها وجرعة العلاج يجب أن تكون منخفضة نسبيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إعداد الجهاز أبج

تنبيه: الرجاء مراجعة صحائف بيانات السلامة المادية ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. الرجاء استخدام ممارسات السلامة المناسبة عند إجراء جميع التجارب، بما في ذلك استخدام غطاء الدخان ومعدات الحماية الشخصية (سلامة النظارات، وقفازات واقية، ومعطف مختبر، إلخ). يتطلب البروتوكول قياسي خلية معالجة تقنيات (تعقيم، استرداد خلية، خلية باساجينج، تجميد الخلايا، وتلطيخ الخلايا، إلخ).

  1. اختيار أنبوب كوارتز مع قطرها داخلي 1 مم وسلس قطر خارجي من 3 مم. في المقاطع العرضية في كلا طرفي إحباط الصقل باستخدام-
  2. استخدام إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ مطلية يبلغ قطرها 1.0 مم كعاليه الجهد الكهربائي. طحن في تلميح إلى نصف قطر انحناء 0.05 مم.
    3. فوهة
  3. التفاف رقائق الألومنيوم (2 مم في العرض) حول أنبوب الكوارتز في 1 سم من أنبوبة الكوارتز. إصلاح نقطة إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ في 1 سم من الطرف الآخر من رقائق الألومنيوم. استخدم الطوق رقائق الألومنيوم كمسري الجهد المنخفض-

2. الحصول على طائرات

  1. لتوفير إشارة التيار متردد، وتوصيل مكبر للصوت السلطة الفولت العالي مولد الإشارات الدالة التي تعمل كإمدادات طاقة. لتسجيل في الطول الموجي للجهد المطبق على مسرى الجهد العالي، تواصل واحدة من نهاية التحقيق الفولت العالي للذبذبات الرقمية وتوصيل الطرف الآخر للإمداد بالطاقة. لحماية الدارة، استخدم ك 2 Ω المقاوم كمقاوم واقية. الاتصال الدائرة كما هو مبين في الشكل 2-
    تنبيه: لا تلمس خطوط الجهد العالي-
  2. باستمرار تمرير الهليوم (حجم الكسر، 99.999%) عبر أنبوب الكوارتز والتحكم في معدل تدفق الغاز في مستقرة قياسية 1.4 لتر في الدقيقة (حركة تحرير السودان)-
    ملاحظة: نحن لا نستخدم عامل تصفية قبل علاج الثقافات الخلية. حجم جزء صغير من الهليوم التي استخدمت في التجربة 99.999%، ومعظم الكائنات الحية الدقيقة لا يمكن أن يعيش في ظل هذه الظروف-
  3. تشغيل الطاقة الذبذبات ومولد الإشارات، ومضخم قدرة عالية الجهد. قم بتدوير مقبض ضبط التردد إلى 5 كيلو هرتز. تدريجيا بزيادة الجهد إلى قيمة الذروة إلى الذروة من 6 كيلو فولت-
    ملاحظة: jet طويل بما يكفي (3 سم تقريبا) عندما تكون قيمة الذروة إلى الذروة من الجهد المطبق في الإبرة حوالي 6 كيلو فولت.

3. إعداد "الخلايا" SH-SY5Y

المتوسطة
  1. خط الخلية البشرية المستمدة من نيوروبلاستوما تنمو SH-SY5Y في 25 سم 2 قارورة في RPMI 1640 تستكمل مع 15% مصل العجل الجنين (FBS). الحفاظ على الخلايا في حاضنة هوميديفيد التي تحتوي على 5% أول أكسيد الكربون الجوي 2 و 95% في 37 درجة مئوية.
  2. عندما الخلايا التوصل إلى التقاء 85%، بعناية نضح وسائل الإعلام الثقافة وإضافة 1 مل 0.25% التربسين + 0.1% أدتا إلى الخلايا.
  3. بعد 15 ثانية حضانة في درجة حرارة الغرفة، بعناية نضح التربسين وإضافة 2 مل 1640 RPMI التي تحتوي على 15% FBS لتحييد.
  4. بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً، غسل أسفل البئر، حتى أحادي الطبقة SH-SY5Y يتم فصل تماما.
  5. عد الخلايا عن طريق هيموسيتوميتير وضبط تركيز الخلية إلى 2 × 10 5 خلايا/مل بإضافة RPMI 1640 متوسطة + 15% FBS، ومن ثم نقل 100 ميليلتر من تعليق خلية لكل بئر من صفيحة 96-جيدا-
  6. تسمح للخلايا لنعلق على 12 ح في حاضنة خلية قبل العلاج أبي-

4. معاملة SH-SY5Y أبي

  1. ضبط المسافة بين الفوهة الكوارتز الأنبوب ومنهاج العمل حيث سيتم وضع لوحة 96-جيدا إلى 3 سم. التأكد من أن الحزم يمكن لمس سطح المتوسطة الثقافة.
    ملاحظة: لا تقاس المسافة من الجزء السفلي من اللوحة. أولاً ضبطه إلى 3 سم بين فوهة أنبوب الكوارتز ومنصة تستخدم لوضع لوحة 96-جيدا-
  2. قبل العلاج أبي، وتغيير المتوسطة الثقافة في كل بئر ما عدا الآبار التحكم إلى RPMI 1640 دون المتوسطة الجلوكوز.
  3. وضع اللوحة تحت فوهة أبي والتأكد من أن الطائرات يمكن إطلاق النار عمودياً في كل بئر-
    4. S
  4. علاج الخلايا في آبار منفصلة مع أبي ل 0, 1 ثانية، 2 ق، 4 ق، 8 s، و 12 س.
    ملاحظة: يتم إنشاء أبي بالإشعاعات المؤينة الهليوم ( الشكل 1). تعامل الخلايا أصيب بالحرمان الجلوكوز بواسطة 4 s وتدفق الهليوم s 8 للقضاء على آثار الهليوم على الخلايا. يجب أن يتم تنفيذ جميع العلاجات في ثلاث نسخ.

5. خلية "تحليل الجدوى"

ملاحظة: لا تقم بتغيير وسيلة في هذه الخطوة.

  1. بعد العلاج أبي، واحتضان الخلايا ح 1 في حاضنة خلية.
  2. إضافة 10 ميليلتر لخلية العد كيت-8 (CCK-8) إلى حل لكل بئر.
  3. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ل 4 h.
    ملاحظة: خط الخلية SH-SY5Y حساس ل ظروف الحرمان الجلوكوز 12. بقاء الخلية ينخفض إلى ما يقرب من 50 ٪ بعد ح 1 الجلوكوز الحرمان، الذي هو شرط بقاء الخلية المثلى للدراسات الدوائية. CCK-8 لا سيتوتوكسيسيتي للخلايا والخلايا هي المحتضنة مع كاشف CCK-8 لآخر ح 4 في ظروف الحرمان الجلوكوز بعد العلاج أبي للتحقق من سلامة الخلية. بعد ح 8 الجلوكوز الحرمان والمعاملة أبي، إلى حد كبير خفض تأثير وقائي من أبي لمدة الطويلة من الحرمان الجلوكوز أدى إلى أضرار جسيمة للخلايا SH-SY5Y. لم يكن هناك دليل من الخلايا الحية بعد 24 ساعة الجلوكوز الحرمان 11-
  4. قياس امتصاص 450 نانومتر مع قارئ ميكروسكوبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم التعبير عن البيانات ك ± يعني SD على الأقل ثلاث تجارب مستقلة. تم تحليل نتائج المجموعة للتباين باستخدام ANOVA. أجريت جميع التحليلات باستخدام برمجيات التحليل الإحصائي المنشور وف < 0.05 كانت العتبة لدلالة إحصائية.

وتم قياس جدوى خلية بعد ح 4 من حضانة CCK-8. كما هو موضح في الشكل 3، الحرمان الجلوكوز تخفيض صلاحية الخلايا SH-SY5Y إلى 44.1 ± 2.6% مقارنة بمجموعة المراقبة (الخلايا المستزرعة عادة في المتوسط RPMI 1640 التي تحتوي على 15% FBS). علاج أبي زيادة كبيرة في بقاء...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ش-SY5Y الخلايا خط خلية المستمدة من نيوروبلاستوما بشرية وتستخدم على نطاق واسع كنموذج خلية مناسبة للدراسات في المختبر بشأن السمية العصبية أو نيوروبروتيكشن12. وكان خط الخلية SH-SY5Y حساسة لظروف الحرمان الجلوكوز. بقاء الخلية انخفضت إلى ما يقرب من 50 ٪ بعد ح 1 الجلوكوز الحرمان، الذي هو شرط بقاء الخلية المثلى للدراسات الدوائية. وعلاوة على ذلك، كاشف CCK-8 وقد لا سيتوتوكسيسيتي للخلايا والخلايا كانت المحتضنة مع كاشف CCK-8 لآخر ح 4 في ظروف الحرمان الجلوكوز بعد العلاج أبي للتحقق من سلامة الخلية. في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وقد أعلنت لا تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذه الورقة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل صندوق الابتكار من معهد بكين للجراحة العصبية (2014-11)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 11475019 و 81271286) ومؤسسة العلوم الطبيعية بكين (رقم 7152027).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خط الخلية SH-SY5Yمركز الصين لمجموعة ثقافة النوع3111C0001CCC000026
RPMI 1640 21875091 علمي حراري متوسطمخزن عند 4 درجات ؛ C
RPMI 1640 متوسط بدون جلوكوز11879020 علمي حراريمخزن عند 4 درجات ؛ C
مصل عجل الجنينThermo Scientific16000044مخزن في -20 درجة ؛ حل C
tripsin-EDTASolarbioT1300المخزن في 4 درجات ؛ C
96 آبار لوحةكورنينج3599
مجموعة عد الخلايا -8 (CCK-8)مختبرات DojindoCK04مخزنة عند 4 درجات ؛
قارئ الصفيحة الدقيقةTecanM200 Proلقياس الامتصاص عند 450 نانومتر
الجهد العالي & مضخم الطاقةTrekPD06087لتضخيم وظيفة
مولد إشارةMaZe Electronics Science & التكنولوجيا AT30120لتوفير إشارة محددة
عالية & ndash ؛ مسبار الجهدTektronixP6015Aللكشف عن
راسم الذبذبات الرقميTektronixDPO4104Bلعرض الإشارة
C عالي الجهد

المراجع

  1. Yang, S. H., et al. Alternative mitochondrial electron transfer for the treatment of neurodegenerative diseases and cancers: Methylene blue connects the dots. Prog. Neurobiol. , (2015).
  2. Bhat, A. H., et al. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegenerative diseases; a mechanistic insight. Biomed. Pharmacother. 74, 101-110 (2015).
  3. Bullon, P., Newman, H. N., Battino, M. Obesity, diabetes mellitus, atherosclerosis and chronic periodontitis: a shared pathology via oxidative stress and mitochondrial dysfunction? Periodontol. 2000. 64 (1), 139-153 (2014).
  4. Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for ischaemic stroke: translation from the bench to the bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
  5. Yan, D., et al. Principles of using Cold Atmospheric Plasma Stimulated Media for Cancer Treatment. Scientific Reports. 5 (5), 18339(2015).
  6. Lu, X., Laroussi, M., Puech, V. On atmospheric-pressure non-equilibrium plasma jets and plasma bullets. Plasma Sources Science & Technology. 21 (3), 034005(2012).
  7. Lu, X., et al. Reactive species in non-equilibrium atmospheric-pressure plasmas: Generation, transport, and biological effects. Phys. Rep. 630, 1-84 (2016).
  8. Lu, X., Naidis, G. V., Laroussi, M., Ostrikov, K. Guided ionization waves: Theory and experiments. Phys. Rep. 540 (3), 123-166 (2014).
  9. Di, M. S., Reed, T. T., Venditti, P., Victor, V. M. Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions. Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (22), 1245049(2016).
  10. Contestabile, A., Ciani, E. Role of nitric oxide in the regulation of neuronal proliferation, survival and differentiation. Neurochemistry International. 45 (6), 903-914 (2004).
  11. Yan, X., et al. Protective effect of atmospheric pressure plasma on oxidative stress-induced neuronal injuries: an in vitro study. J. Phys. D: Appl. Phys. 50 (9), 095401(2017).
  12. Xie, H. R., Hu, L. S., Li, G. Y. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson's disease. Chin. Med. J. 123 (8), 1086-1092 (2010).
  13. Tsutsui, C., et al. Treatment of cardiac disease by inhalation of atmospheric pressure plasma. Japanese Journal of Applied Physics. 53 (6), 060309(2014).
  14. Graves, D. B. Low temperature plasma biomedicine: A tutorial review. Physics of Plasmas. 21 (8), 104-117 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

اختبار حيوية الخلاياطقم عد الخلايا 8معدل تدفق الهيليوممضخم جهد عالٍعلاج واقٍ للأعصابتطبيق الطب البلازميبروتوكول في المختبر
تطبيق جديد لطائرة البلازما الضغط الجوي كعامل العصبية واقية ضد الإصابات الناجمة عن الحرمان الجلوكوز خلايا ش SY5Y
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.