ويصف هذا البروتوكول وسيلة لتوليد المتكفل إينتيرنيورون القشرية والسلائف الانقسامية بعد إينتيرنيورون من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس استخدام أسلوب الهيئة لأحادي الطبقة امبريويد معدلة. سلائف موروث يمكن أن تستخدم في المختبر أو فلوريسسينتلي فرز وزرعها في اللحاء الوليد الجديد لدراسة تحديد مصير، أو المستخدمة في التطبيقات العلاجية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في السلائف إينتيرنيورون القشرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إينتيرنيورونس القشرية جابايرجيك هي عدد سكان غير متجانسة من الخلايا التي تلعب أدواراً حاسمة في تنظيم إنتاج الخلايا العصبية الهرمية ضادات، فضلا عن تزامن نواتج الفرق العصبية الهرمية. العجز في الدالة إينتيرنيورون قد تورطت في مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية، بما في ذلك مرض الفصام والتوحد، والصرع. اشتقاق إينتيرنيورونس القشرية من الخلايا الجذعية الجنينية لا يسمح للدراسة لتنميتها ووظيفة فحسب، بل يوفر نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية الكامنة وراء الآلية المرضية للاضطرابات المتصلة إينتيرنيورون القشرية. وقد إينتيرنيورونس أيضا قدرة رائعة على البقاء على قيد الحياة والهجرة والاندماج في المضيف الدوائر القشرية بعد انتهاء الزرع، جعلها مرشحا مثاليا للاستخدام في العلاجات المستندة إلى الخلية. نقدم هنا، قابلة للتحجيم، ذات كفاءة عالية، وتعديل أسلوب الهيئة لأحادي الطبقة امبريويد للإعراب عن Nkx2.1 إينتيرنيورون المتكفل وذرياتهم من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (ميسكس). استخدام خط ©جميع مراسل مزدوج Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP، Nkx2.1 موروث أو ذرياتهم الانقسامية بعد الإعراب عن Lhx6 يمكن معزولة عن طريق تنشيط fluorescence الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) وبعد ذلك، تستخدم في عدد من التطبيقات المتلقين للمعلومات. كما نقوم بتوفير أساليب لإثراء بارفالبومين (PV) أو سوماتوستاتين (SST) إينتيرنيورون الفرعية، التي قد تكون مفيدة لدراسة الجوانب لتحديد مصير أو للاستخدام في التطبيقات العلاجية التي ستستفيد من إينتيرنيورون إثراء الفريق الفرعي عمليات الزرع.
المقدمة
في كل من الفئران والبشر، تقريبا نصف عدد جميع القشرية إينتيرنيورونس المثبطة (قطرية) تنشأ داخل بنية subcortical عابر المعروف نيافة ganglionic الآنسي (MGE)، حيث المتكفل نيوروبيثيليال من قطرية وغيرها من الخلايا العصبية الدبقية مجموعات فرعية تعبر عن عامل النسخ Nkx2.11،2. يتم تعريف مجموعات فرعية CIn أو الأنواع الفرعية المتقاطعة المورفولوجية، الكيميائية العصبية، والكهربية، وربط الخصائص3،4. قطرية المستمدة من MGE يمكن تجميعها في فئات فرعية معظمها غير متداخلة استناداً إلى التعبير عنها أما PV أو درجة حرارة سطح البحر، التعبير عن الذي يرتبط مع النزعات الكهربية واتص....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: السطر ©جميع مراسل المزدوج الموصوفة في هذا البروتوكول متاح عند الطلب (sande@mail.med.upenn.edu).
1-إعداد وسائط الإعلام
ملاحظة: الحارة جميع وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها في خلية ثقافة.
-
وسائط تنتجها الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) (لإعداد 500 مل)
- إضافة 50 مل مصل البقر الجنين (FBS) لمل 449 دولبيكو للمتوسطة (دميم تعديل النسر)، وعامل التصفية من خلال وحدة تصفية 500 مل 0.22 ميكرومتر المسامية.
- أضف 1 مل عامل مضادات الميكروبات (50 ملغم/مل) بعد الترشيح. تخزين الوسائط عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد أو قاسمة ومخزن في ≤-20 درجة مئوية. <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
البروتوكول، المذكورة في هذه الورقة هي نسخة معدلة من أعمالنا البروتوكولات المنشورة15،،من1617 وقد الأمثل للاستخدام مع خطنا مسك المزدوج-مراسل Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. عن طريق إضافة مثبطات Wnt XAV 939 من DD0-5، جنبا إلى جنب مع إعادة الطلاء في DD8، يمكننا أن نحقق قوية Nkx2.1 التعريفي، وفيها ما يزيد عن 50% من جميع DAPI + نوى في الثقافة أيضا Nkx2.1 يعبرون عن (الشكل 1 أ
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بينما يكون هذا الأسلوب فعالة للغاية في الزخرفة المستمدة من J1 ميسكس (سكرك-1010)، شهدنا نجاح متغير مع خطوط مسك ويعزل الاستنساخ الأخرى. على سبيل المثال، Foxg1::venus ميسكس (EB3 المشتقة؛ دانجو et al. 13) الاستجابة ضعيفة لهذا البروتوكول وتحريض Foxg1 من DD12 عادة ما يقارب 1-2%. للأسباب التي لا نفهم تماما، استنساخ مراسل المزدوج Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP آخر (يسمى JQ59) التي كانت معزولة في وقت واحد كخط الموصوفة في هذا البروتوكول (يسمى JQ27)، تنتج أقل من 1% Nkx2.1-الإعراب عن خلايا عندما نما في ظر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونحن ممتنون "شو تشينغ" على تطوير Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP مراسل المزدوج مسك خط فضلا عن تايسون جنيفر والتوقيع عاصف، وتروس تيم لعملهم في وقت مبكر في المساعدة على تطوير هذا البروتوكول. ونشكر أيضا ختم التدفق الخلوي الأساسية للمساعدة التقنية. أيد هذا العمل MH066912 R01 المعاهد الوطنية للصحة (SA) و F30 MH105045-02 (DT).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنبوب اختبار | Corning | CLS430769 | |
| مع مصفاة الخلية ، غطاء المفاجئ | ، الخلايا | الجنينية 352235 | |
| ThermoFisher Corning (CF-1 MEF IRR 7M) | MTI-Globalstem | GSC-6101G | 1 قارورة من 7M MEFs كافية لأربع لوحات TC مقاس 10 سم. المراجع: 29< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 35< / sup> |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Primocin | Invivogen | Ant-pm-2 | المعروف أيضا باسم عامل مضاد للميكروبات. لا تقم بالتصفية باستخدام الوسائط الأساسية - أضفها بعد الترشيح. المراجع: 9< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 11< / sup> ، < / sup>< up class = "xref" > 36< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" >37< / sup> |
| N2 supplement-B | Stemcell Technologies | 7156 | لا تقم بالتصفية باستخدام الوسائط الأساسية - أضف بعد الترشيح |
| Glutamax (100x) | ThermoFisher | 35050061 | المعروف أيضا باسم L-alanine-L-glutamine. المراجع: 9< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 11< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 38< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 39< / sup> |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | ThermoFisher | 10828028 | يعرف أيضا باسم المكملات الغذائية المتوسطة الخالية من المصل. المراجع: <فئة الدعم = "xref" >9< / sup> ، < / sup>< class = "xref" > 11 < / sup> |
| L-glutamine (100x) ThermoFisher | 25030081 | ||
| MEM-NEAA (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher | 21985023 | |
| KnockOut DMEM | ThermoFisher | 10829018 | يعرف أيضا باسم غير الجلوتامين الذي يحتوي على DMEM. المراجع: 9< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 11< / sup> |
| Hyclone FBS | VWR | 82013-578 | يعرف أيضا باسم درجة الخلايا الجذعية FBS. المراجع: 9< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 11< / sup> |
| طبق معالج بزراعة الأنسجة (10 سم) BD | Falcon | 353003 | |
| طبق بتري معقم غير ملتصق (10 سم) | VWR | 25384-342 | |
| عامل مثبط لسرطان الدم (mLIF) | Chemicon | ESG1107 | لا تجمد ، قم بتخزينه في 4'C. المراجع: 9< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" >11< / sup> |
| ThermoFisher | 11330032 | ||
| 0.1٪ محلول جيلاتين | ATCC | ATCC PCS-999-027 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P6282 | |
| Trypsin-EDTA (0.05٪) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Accutase | ThermoFisher | A1110501 | يعرف أيضا باسم كاشف تفكك الخلايا غير التربسين المحتوي على ذلك. المراجع: 9< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" >11< / sup> |
| RQ1 RNase Free DNase | Promega | M610A | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | إعادة التعليق في DMSO وتخزينها في -80 درجة مئوية في الحصص ذات الاستخدام الواحد |
| XAV939 | Stemgent | 04-0046 | إعادة التعليق في DMSO وتخزينها عند -80 درجة مئوية في حصص الاستخدام الفردي |
| rhFGF-2 | R & D Systems | 233-FB | Resuspend في PBS مع 0.1٪ BSA وتخزينها عند -80 درجة مئوية في الاستخدام الواحد |
| rhIGF-2 | R & D Systems | 291-G1 | Resuspend في PBS مع 0.1٪ BSA وتخزينها عند -80 درجة مئوية في استخدام واحد لمانع |
| ROCK (Y-27632) | Tocris | 1254 | Resuspend في DMSO وتخزينه في -80 درجة مئوية في استخدام واحد ناهض |
| ناعم (SAG) | Millipore | 56660-1MG | Repense في H20 وتخزينه في -80 درجة مئوية في الاستخدام |
| rm Sonic Hedgehog / SHH | R & D Systems | 464-SH-025 | إعادة التعليق في PBS مع 0.1٪ BSA وتخزينها عند -80 درجة مئوية في استخدام واحد |
| PKC & zeta ؛ مثبط الركيزة الزائفة ، | 539624 | EMD Millipore | في H20 وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية في حصص للاستخدام الفردي |
المراجع
- Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
