مقالة منهجية

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في السلائف إينتيرنيورون القشرية

DOI:

10.3791/56358

⸱

ديسمبر 3, 2017

 , 
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول وسيلة لتوليد المتكفل إينتيرنيورون القشرية والسلائف الانقسامية بعد إينتيرنيورون من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس استخدام أسلوب الهيئة لأحادي الطبقة امبريويد معدلة. سلائف موروث يمكن أن تستخدم في المختبر أو فلوريسسينتلي فرز وزرعها في اللحاء الوليد الجديد لدراسة تحديد مصير، أو المستخدمة في التطبيقات العلاجية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إينتيرنيورونس القشرية جابايرجيك هي عدد سكان غير متجانسة من الخلايا التي تلعب أدواراً حاسمة في تنظيم إنتاج الخلايا العصبية الهرمية ضادات، فضلا عن تزامن نواتج الفرق العصبية الهرمية. العجز في الدالة إينتيرنيورون قد تورطت في مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية، بما في ذلك مرض الفصام والتوحد، والصرع. اشتقاق إينتيرنيورونس القشرية من الخلايا الجذعية الجنينية لا يسمح للدراسة لتنميتها ووظيفة فحسب، بل يوفر نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية الكامنة وراء الآلية المرضية للاضطرابات المتصلة إينتيرنيورون القشرية. وقد إينتيرنيورونس أيضا قدرة رائعة على البقاء على قيد الحياة والهجرة والاندماج في المضيف الدوائر القشرية بعد انتهاء الزرع، جعلها مرشحا مثاليا للاستخدام في العلاجات المستندة إلى الخلية. نقدم هنا، قابلة للتحجيم، ذات كفاءة عالية، وتعديل أسلوب الهيئة لأحادي الطبقة امبريويد للإعراب عن Nkx2.1 إينتيرنيورون المتكفل وذرياتهم من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (ميسكس). استخدام خط ©جميع مراسل مزدوج Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP، Nkx2.1 موروث أو ذرياتهم الانقسامية بعد الإعراب عن Lhx6 يمكن معزولة عن طريق تنشيط fluorescence الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) وبعد ذلك، تستخدم في عدد من التطبيقات المتلقين للمعلومات. كما نقوم بتوفير أساليب لإثراء بارفالبومين (PV) أو سوماتوستاتين (SST) إينتيرنيورون الفرعية، التي قد تكون مفيدة لدراسة الجوانب لتحديد مصير أو للاستخدام في التطبيقات العلاجية التي ستستفيد من إينتيرنيورون إثراء الفريق الفرعي عمليات الزرع.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في كل من الفئران والبشر، تقريبا نصف عدد جميع القشرية إينتيرنيورونس المثبطة (قطرية) تنشأ داخل بنية subcortical عابر المعروف نيافة ganglionic الآنسي (MGE)، حيث المتكفل نيوروبيثيليال من قطرية وغيرها من الخلايا العصبية الدبقية مجموعات فرعية تعبر عن عامل النسخ Nkx2.11،2. يتم تعريف مجموعات فرعية CIn أو الأنواع الفرعية المتقاطعة المورفولوجية، الكيميائية العصبية، والكهربية، وربط الخصائص3،4. قطرية المستمدة من MGE يمكن تجميعها في فئات فرعية معظمها غير متداخلة استناداً إلى التعبير عنها أما PV أو درجة حرارة سطح البحر، التعبير عن الذي يرتبط مع النزعات الكهربية واتصال خاص5. خلل إينتيرنيورونس، لا سيما تلك الموجودة في الفريق الفرعي الكهروضوئية، كان متورطا في عدة العصبية اضطرابات وأمراض6،7. والهدف العام لهذا الأسلوب إنتاج المستمدة من الخلايا الجذعية المتكفل الانقسامية والسلائف المهاجرة إثراء لمصير الكهروضوئية أو SST CIn لدراسة البيولوجيا إينتيرنيورون القشرية ولاستخدامها في العلاجات المستندة إلى الخلية.

قمنا بتطوير أسلوب للتحجيم، ذات كفاءة عالية للإعراب عن Nkx2.1 إينتيرنيورون المتكفل وذرياتهم من ميسكس. استخدام Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP مراسل المزدوج مسك خط8، Nkx2.1 موروث أو يمكن معزولة عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية ذرياتهم الانقسامية بعد الإعراب عن Lhx6 وبعد ذلك، تستخدم في عدد من التطبيقات المتلقين للمعلومات. عن طريق التلاعب في عدد من مسارات الإشارات، والمدة للثقافة، ووضع للخلايا، يمكننا الحصول على ملايين سلائف إينتيرنيورون المسمى فلوريسسينتلي مناسبة لمجموعة كبيرة من التطبيقات المتلقين للمعلومات.

وبالرغم من وجود عدة طرق أخرى لتوليد مثل MGE موروث من ميسكس9،10،11،12،،من1314، لدينا أسلوب، والذي يعتمد على Wnt خصم XAV-939، كفاءة خاصة في توليد Foxg1/Nkx2.1 المشترك معربا عن موروث تيلينسيفاليك. وباﻹضافة إلى ذلك، القدرة على تحديد إينتيرنيورون موروث أو ذرياتهم الانقسامية بعد الإعراب عن Lhx6 عن طريق نظامنا مراسل المزدوج، يعزز بشكل كبير قدرة على توليد فروعه المتميزة وذرياتهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: السطر ©جميع مراسل المزدوج الموصوفة في هذا البروتوكول متاح عند الطلب (sande@mail.med.upenn.edu).

1-إعداد وسائط الإعلام

ملاحظة: الحارة جميع وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها في خلية ثقافة.

  1. وسائط تنتجها الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) (لإعداد 500 مل)
    1. إضافة 50 مل مصل البقر الجنين (FBS) لمل 449 دولبيكو للمتوسطة (دميم تعديل النسر)، وعامل التصفية من خلال وحدة تصفية 500 مل 0.22 ميكرومتر المسامية.
    2. أضف 1 مل عامل مضادات الميكروبات (50 ملغم/مل) بعد الترشيح. تخزين الوسائط عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد أو قاسمة ومخزن في ≤-20 درجة مئوية.
  2. وسائط N2 (لإعداد 500 مل)
    1. إضافة 5 مل L-ألانين-L-الجلوتامين (100 x) و 500 ميليلتر 2-Mercaptoethanol (55 مم) لمل 489.5 دميم: "مزيج المغذيات" F-12 (دميم/و-12)، وعامل التصفية من خلال وحدة تصفية 500 مل 0.22 ميكرومتر المسامية.
    2. أضف 1 مل عامل مضادات الميكروبات (50 ملغم/مل) و 5 مل N2 الملحق باء بعد الترشيح. تخزين الوسائط في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. المتوسطة النمو خالية من المصل (قصر) (لإعداد 500 مل)
    1. إضافة 75 مل خالية من المصل المتوسط الملحق، مل 5 لتر-الجلوتامين (100 x)، 5 مل MEM "الأحماض الأمينية" الأساسية عدم (MEM-نيا) (100 x)، و 500 ميليلتر 2-Mercaptoethanol (55 مم) إلى غير مل 413.5 الجلوتامين التي تحتوي على دميم، وتصفية من خلال وحدة تصفية 500 مل 0.22 ميكرومتر المسامية.
    2. أضف 1 مل عامل مضادات الميكروبات (50 ملغم/مل) بعد الترشيح. تخزين الوسائط عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  4. وسائط الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (لإعداد 500 مل)
    1. إضافة 75 مل الخلايا الجذعية الصف FBS، 5 مل MEM-نيا (100 x)، 5 مل لام الجلوتامين (100 x)، و 500 ميليلتر 2-Mercaptoethanol (55 مم) إلى غير مل 413.5 الجلوتامين التي تحتوي على دميم، وتصفية من خلال وحدة تصفية 500 مل 0.22 ميكرومتر المسامية.
    2. أضف 1 مل عامل مضادات الميكروبات (50 ملغم/مل) بعد الترشيح. تخزين الوسائط في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى شهر واحد أو قاسمة ومخزن في ≤-20 درجة مئوية.

2-استزراع ميسكس

  1. لوحة ميتوتيكالي الخاملة MEF تغذية الخلايا في وسائل الإعلام MEF على لوحات زراعة الأنسجة المعالجة 3-4 × 104 خلايا/سم2. السماح على الأقل 12 ح لهم لتسوية في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع ≥ 95% رطوبة نسبية و 5% CO2 قبل الطلاء في ميسكس. إذا لم تستخدم فورا، استبدال الوسائط MEF كل 3 أيام. التخلص من ميفس إذا لم تستخدم في غضون 7 أيام طلاء.
  2. إضافة ميسكس (كثافة تتراوح بين 1-4 × 104 خلايا/سم2) إلى لوحات MEF في مسك الوسائط التي تحتوي على "الماوس اللوكيميا العوامل المثبطة" (مليف) (1,000 U/mL). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع ≥ 95% رطوبة نسبية و 5% CO2.
  3. ممر ميسكس التربسين-يدتا (0.05% التربسين) باستخدام (1:5-1:10) عندما يصبح الطبق ~ روافد 70-80%، أو إذا بدأت المستعمرات للمس. وهذا عادة يحدث كل يومين، ولكن يمكن أن إلى 4 أو 5 أيام اعتماداً على كثافة الطلاء الأولى.
  4. الحفاظ على ميسكس على طبقة وحدة تغذية MEF في مسك المتوسطة للحفاظ على بلوريبوتينسي.
  5. قبل البدء في المفاضلة، مرور الخلايا مرة واحدة على الأقل على لوحات الجيلاتين مغلفة دون ميفس تمييع بها ميفس.
    1. إعداد لوحات الجيلاتين المغلفة بإضافة 0.1% الجيلاتين في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع Ca2 +/Mg2 + إلى طبق استنبات الأنسجة تعامل وترك في 37 درجة مئوية على الأقل 1 حاء لوحة 1.5-2 × 106 خلايا/10 سم لوحة (2.7-3.6 × 104 خلايا/سم2) والسماح بتوسيع لمدة يومين قبل بداية تمايز الخلايا.

3-التفريق بين ميسكس تجاه "موروث تيلينسيفاليك" مثل MGE

  1. يوم التمايز (دد) 0 = "تعويم الخلايا"
    1. بعد أن نمت ميسكس لوحات الجيلاتين المغلفة لمدة يومين، نضح وسائط الإعلام وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني دون Ca2 +/Mg2 +. إضافة ما يكفي يدتا التربسين (0.05% التربسين) لتغطية سطح اللوحة (عادة 4 مل التربسين-يدتا لطبق استنبات الأنسجة 10 سم واحد)، ووضع الخلايا مرة أخرى في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع إيه ناين فايف % رطوبة نسبية و 5% CO2 لدقيقة 4.
    2. وبعد 4 دقائق، إخماد التربسين-يدتا باستخدام 2 إضعاف حجم مع وسائط الإعلام ©جميع. نقل الخلايا إلى أنبوب حجم مناسب للطرد مركزي والطرد المركزي الخلايا في ز 200 x لمدة 5 دقائق. وبعد 5 دقائق، إزالة الأنبوب ونضح وسائل الإعلام دون إزعاج بيليه. ريسوسبيند بيليه في 1 مل KSR:N2 وسائل الإعلام (1:1) التي تحتوي على مثبطات BMP LDN-193189 (250 نيوتن متر) ومثبطات Wnt XAV-939 (10 ميكرون).
    3. قياس تركيز الخلية باستخدام هيموسيتوميتير أو العداد الآلي الخلية. بدء زراعة الخلايا كهيئات امبريويد (EBs) عن طريق إضافة خلايا/مل 75,000 في KSR:N2 وسائل الإعلام (1:1) التي تحتوي على LDN-193189 (250 nM) و XAV-939 (10 ميكرون) في أطباق زراعة الأنسجة غير ملتصقة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع ≥ 95% رطوبة نسبية و 5% CO2.
  2. في DD1، التحضير للخلية "الهبوط" بطلاء أطباق زراعة الأنسجة تعامل مع بولي-L-يسين (10 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني مع Ca2 +/Mg2 +) بين عشية وضحاها (O/N) عند 37 درجة مئوية مع ≥ 95% رطوبة نسبية أو على الأقل 1 ح.
  3. في DD2، نضح بولي-L-يسين ومعطف اللوحات مع laminin (10 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني مع Ca2 +/Mg2 +) س/ن في 37 درجة مئوية مع ≥ 95% رطوبة نسبية.
    ملاحظة: بينما O/N الأمثل، وأقل من 2 ح قد تكون كافية. إذا لم يتم استخدام لوحات في اليوم التالي، نضح laminin واستبدال مع برنامج تلفزيوني دون Ca2 +/Mg2 +وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  4. Dd3 سعة ("الأراضي خلايا")
    1. قبل بداية تفكك المجلس التنفيذي، نضح في laminin والسماح باللوحات ليجف تماما في غطاء زراعة الأنسجة. لا تستخدم اللوحات التي تظهر لامعة أو الرطب واضح. نقل الحديدية مع وسائط الإعلام إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 3-4 دقيقة في 15 × ز أو حتى يكون القريبون الحديدية.
  5. نضح وسائط الإعلام وأضف 3 مل من محلول مفرزة الخلية التي تحتوي على الدناز (يو 2/mL)، واحتضان في 37 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 95% ≥ ونفض الغبار أنبوب كل 3 دقائق المعونة في الانفصال من المجلس التنفيذي بلطف من 5% CO2 ل 15 دقيقة.
  6. بمجرد الحديدية لم تعد مرئية أو انقضت مدة 15 دقيقة، إضافة 6 مل KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على الدناز (1 يو/mL) وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ز.
  7. لوحة الخلايا في KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على LDN-193189 (250 نيوتن متر)، XAV-939 (10 ميكرون)، ومثبط روك Y-27632 (10 ميكرون) 4.5-5 × 104 خلايا/سم2.

4-إثراء SST "البروتوكول": "DD12 بروتينات فلورية خضراء عالية سونيك القنفذ (SHH)" (استمرارا من الخطوة 3، 7)

  1. في DD5، تغيير الوسائط مع KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، منتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/مل)، و SSH (50 نانوغرام/مل).
  2. إعداد لوحات زراعة الأنسجة لإعادة الطلاء في يوم 8 (الخطوة 4، 4) باستخدام الإرشادات الموضحة في الخطوات 3.2-3.3.
  3. في DD7، تغيير الوسائط مع KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، منتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/مل)، و SHH (50 نانوغرام/مل).
  4. في DD8، إعادة لوحة الخلايا.
    ملاحظة: في حين أن هذه الخطوة غير ضرورية، إعادة طلاء الخلايا يمكن أن تقلل أنواع الخلايا المبكر متباينة، وغير المرغوب فيها. إعادة طلاء أيضا يكسر كرات خلايا التي تجعل من الصعب تحليلات المناعي المصب، ويزيد من كفاءة نظام مراقبة الأصول الميدانية في نقاط زمنية لاحقة.
    1. إعادة لوحة الخلايا، وفصل الخلايا من اللوحة مع التربسين-يدتا (0.05% التربسين) لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية مع إيه ناين فايف % رطوبة نسبية و 5% CO2. آرو التربسين-يدتا باستخدام 2 إضعاف حجم مع KSR:N2، وأجهزة الطرد المركزي في ز 200 x 5 كحد أدنى لتصفية الخلايا عن طريق أنبوب تصفية 40 ميكرون لإزالة أي كتل. إعادة لوحة الخلايا 250,000 الخلايا/سم2 في N2/قصر (1:1) تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، منتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/مل)، و Y-27632 (10 ميكرون) مع SHH (50 نانوغرام/مل).
      ملاحظة: إذا كان بدلاً من ذلك، هو اتخاذ القرار لا بإعادة لوحة خلايا DD8، تغيير الوسائط مع KSR:N2 التي تحتوي على SHH (50 نانوغرام/مليلتر) كل يومين من DD7 إلى DD12 والاستمرار في إضافة منتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/مل) وصندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل) حتى DD9.
  5. في DD10، تغيير الوسائط مع KSR:N2 التي تحتوي على SHH (50 نانوغرام/مل).
  6. في DD12، للحصول على الخلايا التي يتم إثراء للأنواع الفرعية التليسكوب، استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لعزل Lhx6::GFP-فقط الإعراب عن الخلايا.
    1. لفصل الخلايا، استخدم كاشف الانفصال من الخلية التي تحتوي على غير التربسين بدلاً من يدتا التربسين. يغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني دون Ca2 +/Mg2 +. إضافة المعالجون مسبقاً غير التربسين التي تحتوي على الانفصال من الخلية كاشف المحتوية على الدناز (يو 2/mL) للخلايا. مكان لهم في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع إيه ناين فايف % رطوبة نسبية و 5% CO2 على 10-30 دقيقة أو حتى قد فصل الخلايا. اضغط بلطف لوحات كل 5 دقائق للمساعدة الانفصال.
      ملاحظة: للثقافات DD11-12، قد يكون فقط 10-15 دقيقة ضرورية. للثقافات DD15-16، 30 دقيقة أو أكثر قد تكون مطلوبة من أجل الانفصال الكامل.
    2. مرة واحدة قد انطلق الخلايا تماما في اللوحة، تمضي إلى عزل نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام البروتوكولات القياسية أو استخدام الخلايا في تحليلات أخرى للمتلقين للمعلومات.

5-إثراء PV "البروتوكول": "مشري DD11/DD17 + أبكسي" (استمرارا من الخطوة 3، 7)

  1. في DD5، تغيير الوسائط مع KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، ومنتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/ملليلتر).
  2. إعداد لوحات زراعة الأنسجة لإعادة طلاء على DD8 (الخطوة 4، 4) باستخدام الإرشادات المذكورة في الخطوات 3.2-3.3.
  3. في DD7، تغيير الوسائط مع KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، ومنتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/ملليلتر).
  4. في DD8، إعادة لوحة الخلايا كما هو موضح في الخطوة 4، 4 مع الاستثناءات التالية: عند إعادة طلاء الخلايا، استبدال SHH بطرية مؤثر (تبلد؛ 30 نانومتر) وإضافة مثبطات PKC شاذة (أبكسي؛ 2 ميكرومتر). مجتمعة، وسائل الإعلام إعادة الطلاء هو الآن N2/قصر (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، منتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/ملليلتر)، Y-27632 (10 ميكرومتر)، تبلد (30 نانومتر)، وأبكسي (2 ميكرومتر).
  5. في DD10، قم بتغيير وسائل الإعلام مع KSR:N2 التي تحتوي على أبكسي (2 ميكرومتر).
  6. DD11
    ملاحظة: عند هذه النقطة، أثري Nkx2.1::mCherry+ الخلايا لتصبح قطرية الكهروضوئية.
    1. فصل الخلايا من اللوحة لنظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام نفس البروتوكول المذكورة في الخطوة 4، 6. إذا اتخذ القرار بجمع الخلايا Nkx2.1::mCherry+ في يوم لاحق من تمايز، تجاهل هذه الخطوة.
  7. في DD12، قم بتغيير وسائل الإعلام مع KSR:N2 التي تحتوي على أبكسي (2 ميكرومتر). في DD14، قم بتغيير وسائل الإعلام مع KSR:N2 التي تحتوي على أبكسي (2 ميكرومتر). في DD16، قم بتغيير وسائل الإعلام مع KSR:N2 التي تحتوي على أبكسي (2 ميكرومتر). في DD17، جمع الخلايا Nkx2.1::mCherry+ باستخدام نفس البروتوكول المذكورة في الخطوة 4، 6.

6-إثراء PV "البروتوكول": "مشري DD17 منخفض SHH" (استمرارا من الخطوة 3، 7)

  1. في DD5، تغيير الوسائط مع KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، ومنتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/ملليلتر). في DD7، تغيير الوسائط مع KSR:N2 (1:1) التي تحتوي على صندوق الأجيال القادمة-2 (10 نانوغرام/مل)، ومنتدى إدارة الإنترنت-1 (20 نانوغرام/ملليلتر).
  2. في DD9، قم بتغيير وسائل الإعلام مع KSR:N2 (1:1). من هذه النقطة فصاعدا، لا عوامل نمو إضافية ضرورية.
    1. الاستمرار في تغيير وسائل الإعلام كل يومين حتى حصاد الخلايا على DD17.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول، المذكورة في هذه الورقة هي نسخة معدلة من أعمالنا البروتوكولات المنشورة15،،من1617 وقد الأمثل للاستخدام مع خطنا مسك المزدوج-مراسل Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. عن طريق إضافة مثبطات Wnt XAV 939 من DD0-5، جنبا إلى جنب مع إعادة الطلاء في DD8، يمكننا أن نحقق قوية Nkx2.1 التعريفي، وفيها ما يزيد عن 50% من جميع DAPI + نوى في الثقافة أيضا Nkx2.1 يعبرون عن (الشكل 1 أ

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بينما يكون هذا الأسلوب فعالة للغاية في الزخرفة المستمدة من J1 ميسكس (سكرك-1010)، شهدنا نجاح متغير مع خطوط مسك ويعزل الاستنساخ الأخرى. على سبيل المثال، Foxg1::venus ميسكس (EB3 المشتقة؛ دانجو et al. 13) الاستجابة ضعيفة لهذا البروتوكول وتحريض Foxg1 من DD12 عادة ما يقارب 1-2%. للأسباب التي لا نفهم تماما، استنساخ مراسل المزدوج Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP آخر (يسمى JQ59) التي كانت معزولة في وقت واحد كخط الموصوفة في هذا البروتوكول (يسمى JQ27)، تنتج أقل من 1% Nkx2.1-الإعراب عن خلايا عندما نما في ظر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون "شو تشينغ" على تطوير Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP مراسل المزدوج مسك خط فضلا عن تايسون جنيفر والتوقيع عاصف، وتروس تيم لعملهم في وقت مبكر في المساعدة على تطوير هذا البروتوكول. ونشكر أيضا ختم التدفق الخلوي الأساسية للمساعدة التقنية. أيد هذا العمل MH066912 R01 المعاهد الوطنية للصحة (SA) و F30 MH105045-02 (DT).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب اختبارCorningCLS430769
مع مصفاة الخلية ، غطاء المفاجئ، الخلاياالجنينية 352235
ThermoFisher Corning (CF-1 MEF IRR 7M)MTI-GlobalstemGSC-6101G1 قارورة من 7M MEFs كافية لأربع لوحات TC مقاس 10 سم. المراجع: 29< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 35< / sup>
FBSAtlanta BiologicalsS11150H
PrimocinInvivogenAnt-pm-2المعروف أيضا باسم عامل مضاد للميكروبات. لا تقم بالتصفية باستخدام الوسائط الأساسية - أضفها بعد الترشيح. المراجع: 9< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 11< / sup> ، < / sup>< up class = "xref" > 36< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" >37< / sup>
N2 supplement-BStemcell Technologies7156لا تقم بالتصفية باستخدام الوسائط الأساسية - أضف بعد الترشيح
Glutamax (100x)ThermoFisher35050061المعروف أيضا باسم L-alanine-L-glutamine. المراجع: 9< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 11< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 38< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 39< / sup>
KnockOut Serum Replacement (KSR)ThermoFisher10828028يعرف أيضا باسم المكملات الغذائية المتوسطة الخالية من المصل. المراجع: <فئة الدعم = "xref" >9< / sup> ، < / sup>< class = "xref" > 11 < / sup>
L-glutamine (100x) ThermoFisher25030081
MEM-NEAA (100x)ThermoFisher11140050
2-MercaptoethanolThermoFisher21985023
KnockOut DMEMThermoFisher10829018يعرف أيضا باسم غير الجلوتامين الذي يحتوي على DMEM. المراجع: 9< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 11< / sup>
Hyclone FBSVWR82013-578يعرف أيضا باسم درجة الخلايا الجذعية FBS. المراجع: 9< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" > 11< / sup>
طبق معالج بزراعة الأنسجة (10 سم) BDFalcon353003
طبق بتري معقم غير ملتصق (10 سم)VWR25384-342
عامل مثبط لسرطان الدم (mLIF)ChemiconESG1107لا تجمد ، قم بتخزينه في 4'C. المراجع: 9< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" >11< / sup>
ThermoFisher11330032
0.1٪ محلول جيلاتينATCCATCC PCS-999-027
LamininSigmaL2020
Poly-L-lysineSigmaP6282
Trypsin-EDTA (0.05٪)ThermoFisher25300054
AccutaseThermoFisherA1110501يعرف أيضا باسم كاشف تفكك الخلايا غير التربسين المحتوي على ذلك. المراجع: 9< / sup> ، < / sup>< sup class = "xref" >11< / sup>
RQ1 RNase Free DNasePromegaM610A
LDN-193189Stemgent04-0074إعادة التعليق في DMSO وتخزينها في -80 درجة مئوية في الحصص ذات الاستخدام الواحد
XAV939Stemgent04-0046إعادة التعليق في DMSO وتخزينها عند -80 درجة مئوية في حصص الاستخدام الفردي
rhFGF-2R & D Systems233-FBResuspend في PBS مع 0.1٪ BSA وتخزينها عند -80 درجة مئوية في الاستخدام الواحد
rhIGF-2R & D Systems291-G1Resuspend في PBS مع 0.1٪ BSA وتخزينها عند -80 درجة مئوية في استخدام واحد لمانع
ROCK (Y-27632)Tocris1254Resuspend في DMSO وتخزينه في -80 درجة مئوية في استخدام واحد ناهض
ناعم (SAG)Millipore56660-1MGRepense في H20 وتخزينه في -80 درجة مئوية في الاستخدام
rm Sonic Hedgehog / SHHR & D Systems464-SH-025إعادة التعليق في PBS مع 0.1٪ BSA وتخزينها عند -80 درجة مئوية في استخدام واحد
PKC & zeta ؛ مثبط الركيزة الزائفة ،539624EMD Milliporeفي H20 وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية في حصص للاستخدام الفردي
، الخلايا الليفية الواحد تعليق

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841(2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956(2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622(2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Mouse Embryonic Stem CellsCortical Interneuron DifferentiationNkx2 1 ProgenitorsFluorescence Activated Cell SortingEmbryoid Body Monolayer MethodParvalbumin Interneuron EnrichmentSomatostatin Interneuron SubgroupsDual Reporter mESC LineCell Transplantation ProtocolNeural Fate Determination

مقالات ذات صلة