مقالة منهجية

سير العمل على أساس المزيج تجارب التتبع النظائري للتحقيق الأيض الميكروبي من عدة مصادر المغذيات

DOI:

10.3791/56393

⸱

يناير 22, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UMR SPO, INRA, SupAgroM, Université de Montpellier, 2IWBT Stellenbosch University, 3PILI, Toulouse White Biotechnology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول إجراء تجريبي للكمية وشاملة التحقيق الأيض من عدة مصادر المغذيات. يسمح سير العمل هذا، استناداً إلى مجموعة من التجارب الراسم النظائر المشعة وإجراء التحليل، مصير المواد الغذائية المستهلكة ومنشأ الأيضية سينثيتيزيد جزيئات من الكائنات الحية الدقيقة تحديد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسات في مجال علم الأحياء الدقيقة تعتمد على تنفيذ مجموعة واسعة من المنهجيات. على وجه الخصوص، تطوير أساليب مناسبة إلى حد كبير يسهم في توفير معرفة واسعة بالتمثيل الغذائي للكائنات الدقيقة التي تنمو في المعرفة كيميائيا الوسائط التي تحتوي على مصادر الكربون والنيتروجين فريدة من نوعها. على النقيض من ذلك، ما زالت إدارة مصادر المغذيات متعددة، على الرغم من وجودها الواسع في البيئات الطبيعية أو الصناعية، من خلال التمثيل الغذائي تقريبا غير مستكشفة. وهذه الحالة يرجع أساسا إلى الافتقار إلى منهجيات مناسبة، مما يعوق التحقيقات.

نحن تقرير استراتيجية تجريبية كمياً وشاملة استكشاف كيفية تشغيل الأيض عندما يتم توفير مغذيات كخليط من جزيئات مختلفة، أي، مورد معقدة. هنا، نحن تصف تطبيقها لتقييم تقسيم مصادر النيتروجين متعددة من خلال شبكة الأيضية الخميرة. سير العمل يجمع بين المعلومات التي تم الحصول عليها من خلال تجارب الراسم النظائر المستقرة باستخدام المحدد 13ج-أو ركائز المسمى ن 15. الأولى تتكون من تخمير موازية واستنساخه في المتوسط نفسها، التي تضم خليط جزيئات المحتوية على ن؛ ومع ذلك، يسمى مصدر نيتروجين محدد في كل مرة. يتم تنفيذ مزيج من الإجراءات التحليلية ([هبلك]، GC-MS) لتقييم أنماط التوسيم للمركبات المستهدفة وقياس الاستهلاك والانتعاش من ركائز في نواتج الأيض الأخرى. تحليل متكامل لمجموعة البيانات كاملة يوفر لمحة عامة عن مصير ركائز المستهلكة داخل الخلايا. ويتطلب هذا النهج بروتوكولا دقيقة لجمع العينات – تيسير نظام الروبوت للرصد على الإنترنت لتخمير – وتحقيق العديد من التحليلات تستغرق وقتاً طويلاً. على الرغم من هذه القيود، فقد أتاح فهم، للمرة الأولى، على تقسيم مصادر النيتروجين متعددة في جميع أنحاء الشبكة الاستقلابية الخميرة. توضيح توزيع النيتروجين من مصادر أكثر وفرة تجاه المركبات الأخرى ن، وتحدد أصول الأيضية للجزيئات المتطايرة والأحماض الأمينية قائمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فهم كيف يعمل الأيض الميكروبي مسألة أساسية لتصميم استراتيجيات فعالة لتحسين عمليات التخمير وتعدل إنتاج المركبات معفن. التقدم في علم الوراثة وعلم الجينوم الوظيفي في هذين العقدين الماضي ساهمت إلى حد كبير إلى توسيع نطاق معرفة طبولوجيا الشبكات التمثيل الغذائي في العديد من الكائنات الحية الدقيقة. الوصول إلى هذه المعلومات أدت إلى تطوير النهج التي تهدف لإجراء استعراض شامل لوظيفة الخلوية1. غالباً ما تعتمد هذه المنهجيات على تفسير يستند إلى نموذج لمعايير قابلة للقياس. وتشمل هذه البيانات التجريبية، من ناحية، معدلات الإقبال والإنتاج المستقلب، ومن ناحية أخرى، تجارب كمية المعلومات داخل الخلايا التي يتم الحصول عليها من الراسم النظائر. توفر هذه البيانات معلومات أساسية لخصم النشاط في فيفو مسارات مختلفة في تعريف شبكة الاستقلابية2،3،4. التقنيات التحليلية المتاحة حاليا، فقط تمكين الكشف عن دقة وصف أنماط الجزيئات عند استخدام أحد نظائر عنصر مفرد، وربما عندما وسم يشترك مع عنصرين النظائر. وعلاوة على ذلك، تحت ظروف نمو معظم، مصدر الكربون يتكون فقط من واحد أو اثنين--المركبات. ونتيجة لذلك، النهج القائمة على تتبع النظائر ج 13من ركائز الكربون بنجاح وعلى نطاق واسع وطبقت على التوصل إلى فهم كامل للكربون الأيضية شبكة عمليات5،6،7 ،8.

وفي المقابل، في العديد من البيئات الطبيعية والصناعية، المورد متاح النيتروجين التي تدعم النمو الميكروبي غالباً ما تتألف من مجموعة واسعة من الجزيئات. على سبيل المثال، أثناء تخمير النبيذ أو البيرة، يتم توفيرها من النيتروجين كخليط من الأحماض الأمينية والأمونيوم في تركيزات متغير918. هذا الصفيف ن المركبات التي يمكن الوصول إليها لابتناء يجعل هذه الشروط المعقدة وسائل الإعلام مختلفة إلى حد كبير عن تلك التي تستخدم عادة للدراسات الفسيولوجية، كما هذا الأخير يتم تحقيقه باستخدام مصدرا فريداً للنيتروجين، عادة من الأمونيوم.

وعموما، مستوعبة النيتروجين قد أدرجت في البروتينات المركبات مباشرة أو كاتابوليزيد. بنية الشبكة استقلاب النيتروجين في العديد من الكائنات الحية الدقيقة، بما في ذلك الخميرة Saccharomyces cerevisiae، معقد للغاية وفقا لتنوع ركائز. العريضة، ويقوم هذا النظام على تركيبة النواة المركزية استقلاب النيتروجين الذي يحفز إينتيركونفيرسيون من الجلوتامين والغلوتامات و α-كيتوجلوتاراتي10،11، مع اميناز وديميناسيس. من خلال هذه الشبكة، وهي تجمع مجموعات أمين من الأمونيوم أو الأحماض الأمينية الأخرى والإفراج عن الأحماض α-keto. هذه الوسيطة أيضا سينثيتيزيد من خلال الكربون المركزية الأيض (CCM)12،13. هذا العدد الكبير من ردود فعل تشعبت والمواد الوسيطة، تشارك في الانتقاض مصادر خارجية النيتروجين وابتناء قائمة الأحماض الأمينية، يفي بمتطلبات المنشطة للخلايا. كما يؤدي النشاط من خلال هذه الطرق المختلفة المترابطة في إفراز نواتج الأيض. على وجه الخصوص، قد توجيه الأحماض α-keto من خلال المسار ايرليك لإنتاج الكحول أعلى وما خلات إستر المشتقات14، التي هي من المساهمين أساسيا للملامح الحسية للمنتجات. وفي وقت لاحق، كيف تعمل استقلاب النيتروجين دوراً رئيسيا في إنتاج الكتلة الأحيائية وتشكيل الجزيئات المتطايرة (رائحة).

ردود الفعل والأنزيمات والجينات المشاركة في استقلاب النيتروجين توصف على نطاق واسع في الأدب. بيد أن مسألة توزيع مصادر النيتروجين متعددة في جميع أنحاء شبكة التمثيل الغذائي لم تعالج بعد. هناك اثنين من الأسباب الرئيسية التي تفسر هذا النقص في المعلومات. أولاً، نظراً لتعقيد مهمة شبكة استقلاب النيتروجين، كمية كبيرة من البيانات الكمية المطلوبة لفهم كامل لعملها أن لم تكن متاحة حتى الآن. ثانيا، العديد من القيود التجريبية والقيود المفروضة على الطرق التحليلية حالت دون تنفيذ النهج التي كانت تستخدم سابقا لتوضيح الدالة CCM.

للتغلب على هذه المشاكل، اخترنا لوضع نهج مستوى النظام تقوم على التوفيق بين البيانات من سلسلة من التجارب الراسم النظائر. يتضمن سير العمل:
--مجموعة من تخمير نفذت تحت نفس الظروف البيئية، بينما يسمى مصدر مغذيات محددة مختلفة (الركيزة) في كل مرة.
--مزيج من الإجراءات التحليلية ([هبلك]، GC-MS) لتحديد دقيق، في مراحل مختلفة من التخمير، تركيز المتبقية من الركازة المسمى والتركيز وإثراء المركبات المشتقة من النظائر المشعة تقويض للجزيء المسمى، بما في ذلك الكتلة الحيوية المشتقة.
-عملية حسابية للتوازن الشامل والنظائر المشعة لكل تستهلك الجزيء المسمى ومزيد من تحليل متكامل لمجموعة البيانات للحصول على لمحة عامة لإدارة مصادر المغذيات متعددة من الكائنات الحية الدقيقة من خلال تحديد نسب التمويه .

لتطبيق هذه المنهجية، يجب إيلاء الاهتمام لسلوك استنساخه من السلالة/الكائنات الدقيقة بين الثقافات. وعلاوة على ذلك، يجب أخذ عينات من ثقافات مختلفة خلال نفس التقدم التخمير محددة تحديداً جيدا. في الأعمال التجريبية التي ذكرت في هذه المخطوطة، يستخدم نظام الروبوت للرصد على الإنترنت لتخمير لمراعاة هذه القيود.

وعلاوة على ذلك، من الضروري أن تختار مجموعة من ركائز المسمى (مجمع، والطبيعة، ووضع العلامات) التي مناسبة معالجة مشكلة الدراسة العلمية. هنا، تم اختيار 15المسمى ن الأمونيوم، الجلوتامين، وارجينين كمصادر النيتروجين الرئيسية الثلاثة الموجودة في عصير العنب. وهذا يسمح بتقييم نمط توزيع النيتروجين من المركبات المستهلكة للأحماض الأمينية قائمة. نحن تهدف أيضا إلى التحقيق في مصير العمود الفقري الكربون من الأحماض الأمينية المستهلكة ومساهمتها في إنتاج الجزيئات المتقلبة. آيسولوسين، ثريونين، وحمض أميني أساسي للوفاء بهذا الهدف، وشكل موحد لوسين المسمى ج 13، قد أدرجت في الدراسة الأحماض الأمينية المستمدة من المواد الوسيطة الرئيسية للمسار ايرليك.

عموما، فإننا استكشاف كمياً كيف يدير الخميرة مورد نيتروجين معقدة بإعادة توزيع مصادر النيتروجين الخارجية للوفاء بمتطلباتها الابتنائية طوال التخمير أثناء إزالة فائض السلائف الكربون كما بالإضافة إلى ذلك الجزيئات المتقلبة. يمكن تطبيق الإجراءات التجريبية عنها في هذه الورقة للتحقيق في مصادر المغذيات المتعددة الأخرى المستخدمة من قبل أي من الكائنات الدقيقة الأخرى. ويبدو أن نهج مناسب لتحليل تأثير الخلفية الجينية أو الظروف البيئية على السلوك الأيضية للكائنات الحية الدقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-التخمير وأخذ العينات

  1. إعداد الوسائط والتخمير
    ملاحظة: تعريف كل تخمير يتم يضطلع بالتوازي، باستخدام نفس السلالة وفي نفس كيميائيا المتوسطة الاصطناعية (SM، التكوين الواردة في الجدول 1)، الذي يتضمن مزيجاً من الأمونيوم والأحماض الأمينية حسب مصادر النيتروجين15. لكل التخمير، يتم توفيرها مركب النتروجين واحد حصرا في شكل موحد المسمى 13ج أو نموذج 15ن (100%)، بينما لا يزال الآخرون غير مسمى. لكل مصدر النيتروجين المسمى الذي يتم استخدامه في مجموعة التجارب (هنا: 15NH4، يو-15N4-الأرجنتين، يو-15N2-جلن، يو-13C6-لوي، يو-13C5-فال، يو-13C6-إيل، يو-13C4-الثريونين)، وهما وتعد المخمرات. لكل شرط، تتم التخمير المكررة باستخدام فقط غير مسمى جزيئات (تخمير التحكم 7).
    1. لكل N-مصدر لدراستها، وإعداد 500 مل SM المسمى المتوسط الذي يحتوي على كافة مصادر النيتروجين المذكورة في الجدول 1، باستثناء المجمع لاستخدامها في 100% النموذج.
      ملاحظة: يتم إضافة الجزيء المسمى في الخطوات التالية.
    2. بسترة كل المتوسطة في قارورة ل 1 (10 دقيقة، 100 درجة مئوية) التي تحتوي على شريط إثارة مغناطيسية. وزن المقدار المناسب من جزيء المسمى للوصول إلى تركيز النهائية التي يتم الإبلاغ عنها في الجدول 1 وحله في الأجل المتوسط.
    3. تعقيم المتوسطة استخدام نظام ترشيح فراغ المتاح (غشاء اسيتات السليولوز، 0.22 ميكرومتر). باستخدام اسطوانة قياس عقيمة، تقسيم المتوسطة بين المخمرات معقمة قبل سنتين (250 مل) التي تحتوي على شريط إثارة مغناطيسية وهي مجهزة بإقفال التخمير تجنب دخول الأوكسجين ولكن السماح بالإفراج عن أول أكسيد الكربون2.
    4. الحرارة قوارير التخمير إلى 28 درجة مئوية عن طريق وضعها في غرفة الحضانة لليلة واحدة (درجة الحرارة في 28 درجة مئوية).
  2. التطعيم والرصد لتخمير
    1. تنمو سلالة S. cerevisiae في أنابيب معقمة تحتوي على 10 مل متوسطة YPD في 28 درجة مئوية مع الهز (150 لفة في الدقيقة) ح 12. ثم بيبيت 1 مل YPD بريكولتوري ونقلها إلى 10 مل من SM المتوسطة (في أنابيب معقمة 15 مل). احتضان ثقافة ح 12 في 28 درجة مئوية مع الهز (150 لفة في الدقيقة).
    2. تحت الاندفاق الصفحي، جمع من بريكولتوري الكوة والتحديد الكمي للسكان الخلية باستخدام عداد جسيمات إلكترونية التي يتم تركيبها مع فتحه 100 ميكرومتر. الطرد المركزي بريكولتوري (2,000 x ز، 15 دقيقة، 4 درجة مئوية) وتعليق بيليه في وحدة تخزين مناسبة من الماء المعقم للحصول على تركيز نهائي 2.5 × 108 خلايا/مل. تطعيم كل تخمير مع 1 مل تعليق خلية.
      ملاحظة: النظام الروبوتية المستخدمة لرصد التقدم المحرز في التخمير يرد في الشكل 1.
    3. إعداد منهاج التخمير بتثبيت التخمير في أدلة الدعم التي يتم وضعها على لوحات التحريك 21-الموقف بشكل صحيح وتعيين معدل إثارة 270 لفة في الدقيقة. لبدء الرصد المباشر لكل التخمير، بدء تشغيل التطبيق الروبوت--عنصر تحكم، ثم انقر فوق الزر "بدء الفحص" وحدد حجم التخمر سيضطلع (300 مل).
    4. واجهة عرض يسمح الإشارة إلى عدد وموقف المخمرات على المنصة. لضمان حدوث ذلك، انقر على الحق في مكان فتحه واختر "تمكين" تفعيل رصد تخمير يقع في هذا الموضع.
    5. تهيئة البرنامج حساب، تعمل بشكل دائم على النظام، قبل البدء في اكتساب الوزن. انقر فوق الزر "إينيتياليسير"، والتحقق من صحة مع "موافق". انقر على زر "ابدأ" روبوت لمراقبة التطبيق لبدء عمليات الشراء الوزن.
  3. إجراءات أخذ العينات
    ملاحظة: لكل تخمير، وتؤخذ عينات عندما يصل إنتاج2 CO (القيمة المعروضة على شبكة الإنترنت على الكمبيوتر الذي يشغل البرنامج حساب) النقطة المحددة المطلوبة: 5، 10 و 40 و 90 جرام/لتر في هذه الدراسة.
    1. أخذ العينات الداخلي للثقافات مع مركبات مسماة.
      1. الطرد المركزي عينتين 6 مل (2,000 x ز, 5 دقيقة, 4 درجة مئوية). حفظ وتخزين supernatants المجمدة في مختبرين اثنين في-80 درجة مئوية. تغسل الكريات مرتين مع 5 مل المقطر ماء ومخزن في-80 درجة مئوية لقياس الفاسدون النظائر.
    2. أخذ العينات الداخلي للثقافات دون مركبات مسماة
      1. حصاد 10 مل ثقافة، والذي سيتم استخدامه لتحديد الوزن الجاف. بيليه الخلايا من 10 مل عينتين بالطرد المركزي (2,000 x ز, 5 دقيقة, 4 درجة مئوية). تغسل الكريات مرتين مع 10 مل ماء المقطر وتخزينها في-80 درجة مئوية لتحديد محتوى البروتين والأحماض الأمينية.

2-التحديد الكمي لمصادر النيتروجين المستهلكة

  1. تصميم الانزيمية تركيزات الأمونيا المتبقية
    ملاحظة: يتم تحديد تركيز الأمونيا في supernatants استخدام مجموعة المستندة إلى إنزيم تجارية؛ جميع الكواشف توفرها الشركة المصنعة.
    1. تعد حلاً الأمونيا قياسية (61.4 مغ/لتر) بإذابة 25 ملغ من دقة وزنه (NH4)2حتى4 في قارورة حجمية 100 مل.
    2. للوفاء بإرشادات الشركة المصنعة، نفذ إضعاف 1:2 للعينات التي أخذت قبل التخمير والساعة 5 غ/لتر من CO2 صدر. ضبط الأس الهيدروجيني للعينات لما يقرب من 8 بإضافة 1 م كوه. يحيط علما بحجم المضافة وأخذها في الاعتبار في معامل التخفيف.
    3. في 4 مل جهاز المطياف الضوئي الترعة، المقطر مزيج 100 ميكروليتر من عينة (المخفف إذا لزم الأمر)، المياه أو محلول الأمونيا القياسية مع 2 مل كاشف 1 (0.75 مم ADP و 30 U/mL غلوتامات نازعة في المخزن المؤقت للأس الهيدروجيني 7.8) و 500 ميليلتر من كاشف 2 (1.3 مم NADH). احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وقراءة امتصاص NADH في 340 نانومتر (A1).
    4. إضافة 500 ميليلتر من الكاشف 3 (60 ملم α-كيتوجلوتاراتي في المخزن المؤقت لدرجة الحموضة 8) واحتضان العينة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وقراءة امتصاص NADH في 340 نانومتر (A2).
    5. حساب تركيز الأمونيا باستخدام:
      جالنشادر (غرام/لتر) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)عينة-(0.839 x A1-A2)ماء مقطر]
    6. تحقق من أن يتم الحصول على التركيز الصحيح مع الحل القياسية.
  2. تصميم الكروماتوغرافي تركيزات الأحماض الأمينية المتبقية
    ملاحظة: تحديد تركيزات الأحماض الأمينية في supernatants يتحقق باستخدام نظام تحليل الأحماض الأمينية مخصصة تقوم على التبادل الأيوني اللوني مع وظيفة العمود derivatization ن-المركبات مع نينهيدرين، الذي يسمح بها كشف اللونية.
    1. إعداد حل مرجع بإضافة 200 ميليلتر من خليط تجاري من الأحماض الأمينية محايدة والحمضية و 200 ميليلتر من خليط تجاري من الأحماض الأمينية الأساسية 200 ميليلتر من الجلوتامين 2.5 ملم إلى 400 ميليلتر من 200 ملم الليثيوم سترات عازلة، درجة الحموضة 2.2. هذا الحل إشارة محددة كيميائيا يعامل كعينة.
    2. إضافة 200 ميليلتر من حل حمض سولفوساليسيليك 25% (w/v) الذي يحتوي على 2.5 مم نورليوسيني (الداخلية القياسية) إلى 800 ميليلتر من عينة لإزالة الجزيئات ذات الأوزان الجزيئية العالية. احتضانها ح 1 في 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي (3,000 x ز، 10 دقيقة، 4 درجة مئوية) وعامل التصفية عن طريق غشاء النيتروسليلوز حجم المسام 0.22 ميكرومتر (نظام الحقن).
    3. في برنامج مبرمج، انقر فوق الزر "تشغيل" لبدء اللوني السائل التحليلات (LC) مع محلل مزودة بعمود تبادل الأيونات الموجبة (نموذج الليثيوم). الوت الأحماض الأمينية مع المخازن المؤقتة الليثيوم المتعاقبة لإنشاء تدرج الأس الهيدروجيني وتدرج في تركيز أيون مكافحة في تركيبة مع تدرج درجة الحرارة (الجدول 2).
    4. تحديد كمية مركبات النيتروجين بعد derivatization نينهيدرين بجهاز كشف سبيكتروفوتوميتريك في 570 نانومتر (الأرجواني التلون: تفاعل بين مجموعة نينهيدرين وأمين من الأحماض الأمينية) و 440 نانومتر (الأصفر تلوين: تفاعل بين مجموعة نينهيدرين وايمين برولين).
    5. إجراء معايرة داخلية نقطة واحدة استخدام حل مرجع ونورليوسيني كمعيار داخلية لحساب تركيزات الأحماض الأمينية في العينات باستخدام البرنامج الخاص بالشركة المصنعة.

3-التحديد الكمي لقائمة الأحماض الأمينية

  1. قياس الوزن الجاف خلية
    1. تصفية 10 مل ثقافة من خلال عامل تصفية النيتروسليلوز (المسام حجم 0.45 ميكرومتر) موزون مسبقاً في كأس ألومنيوم، واستخدام جهاز الشفط. تغسل مرتين مع 50 مل ماء المقطر.
    2. وضع عامل التصفية في كأس الألمنيوم والجافة في فرن حرارة عند 105 درجة مئوية ح 48 (حتى يتم ملاحظة أي تغيير زيادة في الوزن) قبل ريويغينج عامل التصفية في الكأس. حساب فرق الوزن.
    3. حساب متوسط قياسات مستقلة على الأقل 3 لدقة تحديد الوزن الجاف خلية ثقافة الخميرة.
  2. التحديد الكمي لمحتوى البروتين من الخلايا
    ملاحظة: يتم إجراء التحديد الكمي للجزء من البروتين الخلايا على الأقل في ثلاث نسخ باستخدام الكريات غير مسمى الخلية التي تم الحصول عليها كما هو موضح في القسم 1-3-2.
    1. استخراج البروتينات بإضافة 1 مل من محلول [دمس] (50% v/v) إلى الكريات المجمدة واحتضان عند 105 درجة مئوية ح 1 في فرن حرارة جافة.
    2. التحديد الكمي لمحتوى البروتين في المقتطفات [دمس] باستخدام مقايسة اللونية البيوكيميائية يرتكز على الحد من البروتينات Cu++ إلى أيونات Cu+ التي هي كذلك عجلت بحمض بيسينتشونينيك في مجمع زرقاء (مقايسة اتفاق التعاون الأساسي).
  3. تحديد المساهمات النسبية للأحماض الأمينية في البروتينات
    ملاحظة: يتم تحديد ملف التعريف من قائمة الأحماض الأمينية على الأقل في ثلاث نسخ من خلية غير مسمى الكريات (1.3.2.).
    1. إعداد مقتطف المؤكسد بتعليق بيليه الخلية في 200 ميليلتر من حمض بيرفورميك (حمض الفورميك 90%، وفوق أكسيد الهيدروجين 10%). احتضانها ح 4 في 4 درجات مئوية ويتوقف رد الفعل بإضافة كبريتات الصوديوم ملغ 33.6.
      ملاحظة: الخطوة أكسدة مطلوب تحويل سيستين والميثيونين حمض الميثيونين [سولفون] وسيستيك، مما سوف يمكن تحديدها كمياً المزيد من التبادل الأيوني اللوني. ومع ذلك، بعض الأحماض الأمينية (تيروزين، فينيلالاناين، الحامض الأميني، وارجينين) هي التشويه والتحريف أثناء علاج الأكسدة. ونتيجة لذلك، يتم إعداد اثنين من البروتينات (مع ودون الأكسدة).
    2. إضافة 800 ميليلتر من 6N HCl إلى حبيبات الخلية أو تتأكسد استخراج واحتضان العينة في أنبوب زجاج مختومة بأحكام ح 16 عند 110 درجة مئوية في فرن وحرارة جافة. إضافة 200 ميليلتر من نورليوسيني 2.5 ملم وإزالة HCl مع تيار نيتروجين. أغسل (ريسوسبيندينج استخراج المجففة وثم إزالة السائل مع تيار نيتروجين) مرتين مع 800 ميليلتر من الماء المقطر ثم مع 800 ميليلتر من الإيثانول. يستغرق في 800 ميليلتر من 200 ملم الليثيوم خلات العازلة، الأس الهيدروجيني 2.2.
      ملاحظة: ينبغي إيلاء الاهتمام لفترة الحضانة للتحلل المائي بعض الأحماض الأمينية ليست مستقرة تحت الظروف الحمضية. ويقدر الكسر التربتوفان في البروتين من البيانات الموجودة في الأدبيات16، الأحماض الأمينية هذا هو التشويه والتحريف تماما أثناء التحلل HCl.
    3. إعداد معيار هيدروليساتي لمعايرة الداخلية نقطة واحدة. إضافة 160 ميليلتر للتوصل إلى حل تجاري لتحلل الأحماض الأمينية إلى 840 ميليلتر 200 ملم الليثيوم خلات المخزن المؤقت، الأس الهيدروجيني 2.2، يحتوي على 625 [سولفون] الميثيونين ميكرومتر وحمض سيستيك ميكرومتر 625 625 مكم نورليوسيني.
    4. تحديد تركيزات النسبية من الأحماض الأمينية في البروتينات باستخدام الأسلوب الكروماتوغرافي الموصوفة في القسم 2-2.
  4. العمليات الحسابية
    1. حساب نسبة وزن كل من الأحماض الأمينية في البروتينات بتقسيم مبلغ محسوب لكل حمض أميني (مغ/لتر) بمبلغ إجمالي قدرة الأحماض الأمينية التي تم قياسها في استخراج البروتين (مجموع في مغ/لتر).
    2. تتضاعف هذه النسبة المئوية بتركيز البروتينات في الثقافة (مغ/لتر)، و أي، والمنتج بين محتوى البروتين من الكتلة الأحيائية والوزن الجاف، لتقييم تركيز كل حمض أميني قائمة في الثقافة (مغ/لتر).

4-قياس تخصيب النظائر المشعة من قائمة الأحماض الأمينية

ملاحظة: لقياس تخصيب النظائر المشعة من قائمة الأحماض الأمينية، استخدام الكريات خلية مسماة. وتستخدم ثلاثة عوامل مختلفة لخطوة derivatization كمياً في إثراء النظائر المشعة من الأحماض الأمينية. يتم قياس كثافة الكتلة أيونات لتقدير أنماط التوسيم من الأحماض الأمينية. الإشارة من كل أيون الكتلة يتوافق مع وفرة إيسوتوبوميرس الشامل (م0 = بدون تسمية، m+ 1 = 1 ذرة المسمى،...) جزء من الأحماض الأمينية. ويرد مثال على تشروماتوجرام التي تم الحصول عليها بعد إجراء دمادمف في الشكل 2.

  1. التحلل المائي الكتلة الأحيائية
    1. يتحلل الكريات الخلية (الموافق 1-2 مغ من الكتلة الأحيائية الجافة) بإضافة 1.2 مل من 6 M HCl وتفرخ العينة ح 16 عند 105 درجة مئوية في أنابيب زجاجية مغلقة بأحكام في فرن حرارة جافة.
    2. إضافة 1.2 مل من الماء المقطر وأجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلوية. توزيع المادة طافية في ستة 400 ميليلتر الكسور في أنابيب زجاجية مفتوحة. الجاف الكسور في فرن حرارة عند 105 درجة مئوية حتى تصل إلى اتساق شراب (ح 4-5).
  2. Derivatization اثيلتشلوروفورماتي (ECF)
    1. حل هيدروليساتي المجفف في 200 ميليلتر من عيار 20 ملم HCl؛ ثم أضف ميليلتر 133 بيريدين: الإيثانول (1:4). إضافة 50 ميليلتر من ECF ديريفاتيزي الأحماض الأمينية والانتظار حتى لقد تم الإفراج عن جميع CO2 . نقل الخليط الطرد المركزي أنابيب تحتوي على 500 ميليلتر من الميثان لاستخراج المركبات ديريفاتيزيد.
    2. دوامة الأنابيب 10 s والطرد المركزي لهم لمدة 4 دقائق في 10,000 س ز؛ جمع المرحلة العضوية أقل مع بيبيت باستور ونقل إلى GC قارورة تحتوي على إدراج الزجاج مخروطية الشكل حيث أن العينات قد حقنت مباشرة الصك GC/MS.
  3. (ن، ن)-ديميثيلفورماميدي ثنائي ميثيل أسيتال (دمفدما) derivatization.
    1. حل هيدروليساتي المجفف في 50 ميليلتر من الميثانول و 200 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل. إضافة 300 ميليلتر من دمفدما. دوامة الأنبوب ونقل العينات إلى GC أوتوسامبلير زجاجة تحتوي على إدراج الزجاج مخروطية الشكل.
  4. ن، س-مكررا (تريميثيلسيليل) تريفلورواسيتاميدي (بستفا) derivatization
    1. تعليق هيدروليساتي في 200 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل. إضافة 200 ميليلتر من بستفا ومغلقة بأحكام إغلاق أنبوب زجاج واحتضانها ح 4 في 135 درجة مئوية قبل نقل النص المقتبس مباشرة إلى قارورة GC.
  5. تحليل GC-MS
    1. تحليل العينات مع كروماتوجرافيا الغاز مجهزة حاقن أوتوسامبلير وهو بالإضافة مطياف كتلة.
      1. استخدام البرمجيات الخاصة بأداة للتحكم في الصك وتحليل في تشروماتوجرامس. في قائمة "سلسلة"، انقر فوق "نموذج سجل الجدول" لإنشاء قائمة نماذج، وانقر فوق الزر "تشغيل" لبدء الحقن.
        ملاحظة: كروماتوجرافيا الغاز مزودة بعمود شعري السليكا أبولار 30 م × 0.25 مم مع سماكة فيلم ميكرومترات 0.15. ضبط درجة حرارة الرباعي مطياف كتلة عند 150 درجة مئوية وعقد خط نقل على 250 درجة مئوية لكل التحليلات. وتستخدم ثلاثة برامج تحليلية، كل واحدة محددة لكل عامل derivatization،.
      2. ECF المشتقات المالية: استخدام الهيليوم كمرحلة المتنقلة مع تدفق 1.2 مل/دقيقة اضبط درجة حرارة المدخل في 230 درجة مئوية، وأن المصدر عند 250 درجة مئوية. برنامج أوتوسامبلير لحقن 1 ميليلتر من العينات بتقسيم نسبة 3:1. تشغيل هذه التحليلات، تدريجيا على زيادة درجة حرارة الفرن كما يلي: 130 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ التدرج من 15 درجة مئوية/دقيقة إلى 260 درجة مئوية؛ الحفاظ على درجة حرارة 260 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      3. مشتقات دمفدما: استخدام الهيليوم كمرحلة المتنقلة مع تدفق مستمر من 1.2 مل/دقيقة اضبط درجة حرارة المدخل في 230 درجة مئوية، وأن المصدر عند 250 درجة مئوية. برنامج أوتوسامبلير لحقن 1 ميليلتر من العينات بتقسيم نسبة 3:1. تشغيل هذه التحليلات، تدريجيا على زيادة درجة حرارة الفرن كما يلي: 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ التدرج في الدقيقة 20 درجة مئوية إلى 130 درجة مئوية؛ التدرج الثانية من 4 درجة مئوية/دقيقة إلى 260 درجة مئوية؛ الحفاظ على درجة حرارة 260 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      4. مشتقات بستفا: استخدام الهيليوم كمرحلة المتنقلة مع تدفق مستمر من 1.2 مل/دقيقة اضبط درجة حرارة المدخل في 275 درجة مئوية، وأن المصدر في 300 درجة مئوية. تشغيل التحليلات (الحقن: 1 ميليلتر)، تدريجيا زيادة درجة حرارة الفرن كما يلي: 110 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ التدرج الأولى من 2 درجة مئوية/دقيقة إلى 154 درجة مئوية؛ التدرج الثانية من 5 درجة مئوية/دقيقة إلى 300 درجة مئوية؛ الحفاظ على درجة حرارة 300 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      5. الكشف الداخلي: لوضع كل من derivatization، حقن عينة (1 ميليلتر) في وضع المسح الضوئي مع الإلكترون الإيجابي أثر التأين في 70 eV والإحاطة بوقت الاحتفاظ بكل من الأحماض الأمينية.
      6. استخدم هذه القيم لتحديد الإطارات الزمنية في جميع أنحاء في chromatogram والايونات مختلفة مختارة، ومميزة لكل من الأحماض الأمينية والمدرجة في الجدول 3؛ ينبغي أن تكون هذه القيم لكل من الأحماض الأمينية. تضمين هذه المعلومات في برنامج الكشف عن سيم وتشغيل التحليلات في وضع سيم مع الإلكترون الإيجابي أثر التأين في 70 eV.
    2. جمع نتائج التحليلات؛ هي لكل من الأحماض الأمينية، سجل مجموعة من الشدة التي تتوافق مع إلى ما إيسوتوبوميرس أسلحة مختلفة. معالجة البيانات باستخدام ديديكاتيدسوفتواري17 لتصحيح لوضع العلامات الطبيعية وحساب تخصيب النظائر المشعة من قائمة الأحماض الأمينية (ويعرف الكسر مسماة من الأحماض الأمينية فيما يتعلق بالمبلغ الإجمالي للبروتين عينات).
      ملاحظة: في إثراء النظائر لجزيء (أي)، كنسبة مئوية، يتم حساب قسمة مجموع كثافات تصحيحها من إيسوتوبوميرس الشامل مع وضع العلامات (م1، م2،...mن) على مجموع المصوبة كثافة من جميع إيسوتوبوميرس أسلحة (م0، م1، م2... من):
      أولاً هاء = (م1 + م2 +... + من)/(م0 + م1+ م2 +... + من)

5-التقدير الكمي والنظائر إثراء المتطايرة

  1. استخراج المركبات المتطايرة المسمى
    1. إضافة 10 ميليلتر من الديوتيريوم المعايير الداخلية إلى 5 مل من المادة طافية (تركيز مركبات الديوتيريوم النهائي: 100 ميكروغرام/لتر) في أنبوب زجاج 15 مل. إضافة 1 مل الميثان وأحكام إغلاق الأنابيب ويهز لهم على منصة هزاز لأدنى 20 جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3,000 س ز وجمع في مرحلة انخفاض العضوية في أنبوب زجاج 15 مل. كرر استخراج الميثان.
    2. الجاف لاستخراج العضوية أكثر من 500 مغ كبريتات الصوديوم اللامائية وجمع الطور السائل مع بيبيت باستور. التركيز الاستخراج بمعامل أربع تحت التمويه النيتروجين ونقلها إلى قنينة أوتوسامبلير GC.
  2. تقدير المركبات المتطايرة GC-MS
    1. تزويد كروماتوجرافيا الغاز مع عمود شعري والسليكا فوسيد 30 م × 0.25 مم 0.25 ميكرو فيلم سمك وتطبيق تدفق هليوم مستمر من 1.0 مل/دقيقة عقد محقن وخط نقل في 250 درجة مئوية.
    2. حقن 2 ميليلتر من عينة بنسبة 10:1 تقسيم وفصل الجزيئات المتطايرة المستخرجة باستخدام التشكيل الجانبي التالي لدرجة حرارة الفرن: اضغط بدرجة الحرارة لمدة 3 دقائق عند 40 درجة مئوية، وزيادتها من خلال 4 درجة مئوية/دقيقة يصل إلى 220 درجة مئوية، وعقد بعد ذلك الفرن على 220 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    3. الكشف عن المركبات باستخدام مطياف كتلة مع درجة حرارة المصدر بها تعيين في 230 درجة مئوية ودرجة الحرارة الرباعي مطياف كتلة تعيين عند 150 درجة مئوية. تسجيل الأطياف الشامل في الوضع المحدد أيون الرصد (SIM) مع الإلكترون الإيجابي أثر التأين في 70 eV واستخدام كتل أيون المحددة للمركبات المتطايرة التي ترد في الجدول 4.
    4. استخدام معايرة 7-النقطة خارجية لقياس تركيزات الجزيئات المتطايرة من مبالغ كثافة الكتلة أيون المطابق. إعداد حلول الأسهم لكل مجمع (10 غرام/لتر) في الإيثانول 100%. ثم، إعداد الحلول القياسية لكل فئة من الجزيئات المتطايرة (استرات الإيثيل، والاسيتات والكحول والأحماض) عن طريق خلط الحلول الأسهم. وأخيراً، يؤدي إلى تمييع كميات مختلفة من الحلول القياسية في حل hydroalcoholic 12% يحتوي على حمض الطرطريك 5 غرام/لتر مع درجة الحموضة تعديلها إلى 3.3 لإعداد حلول المعايرة.
    5. في موازاة ذلك، تصحيح للعلامات الطبيعية من شدة كل مجموعة أيون وحساب إثراء النظائر للمركبات المتطايرة، الذي يعرف الكسر مسماة من الجزيئات، ويتم التعبير عنها كنسبة مئوية باستخدام برامج مخصصة 17.

6-العمليات الحسابية لإجراء تحليل متكامل لمجموعة البيانات

  1. جمع البيانات الأولية
    1. استخدام جداول البيانات المبينة في الجداول 5، 6، 7، و 8، قم بإدخال قيم البيانات الخام التي تتوافق مع تركيز الأحماض الأمينية خارج الخلية، الخلية من الوزن الجاف، ومحتوى البروتين في الخلايا، وتركيز الجزيئات المتقلبة، والنظائر المشعة الإثراء من قائمة الأحماض الأمينية والجزيئات المتقلبة.
      ملاحظة: يتم التعبير عن البيانات الواردة في الجداول في مم. ويعبر أيضا عن جميع النتائج في مغ/لتر بضرب القيم في مم الوزن الجزيئي لكل جزيء أو مغ N/لتر بضرب ميليمولار تركيز الأحماض الأمينية قائمة الكتلة الذرية من النيتروجين (14 ش) وعدد من النيتروجين أتو مرض التصلب العصبي المتعدد التي يتم توفيرها من تقويض لهذا الجزيء.
    2. حساب النسبة المئوية الشامل لكل من الأحماض الأمينية في البروتينات بقسمة كميته في مغ/لتر في هيدروليساتي مبلغ إجمالي قدرة الأحماض الأمينية (بمجموع في مغ/لتر).
    3. حساب الوسائل والانحرافات المعيارية، والأخطاء المعيارية للوسط من البيانات التي تم الحصول عليها في التجارب المستقلة.
    4. حساب تركيز قائمة (مغ/لتر) لكل من الأحماض الأمينية بضرب النسبة المئوية لهذه الأحماض الأمينية في البروتينات (مغ أإ/ز البروتينات) بواسطة الكسر البروتين في الكتلة الأحيائية (ز البروتينات/ز دويتشه فيلة) ومحتوى الوزن الجاف (إنتاج الكتلة الأحيائية) في المتوسطة (ز DW/لتر).
  2. 15 تجارب التتبع النظائري N
    1. استخدام جداول البيانات التي ترد في الجدول 9، حساب الكسور المسماة وغير المسماة النيتروجين الموجودة في قائمة الأحماض الأمينية (معبراً عنها بملغ N/لتر) من تلك التركيزات الإجمالية (معبراً عنها بملغ N/لتر)، وعلى الفاسدون النظائر. لكل من الأحماض الأمينية، الكسر المسمى يتوافق مع المنتج بين تركيزه الكلي وتخصيب النظائر المشعة، والجزء غير مسمى هو الفرق بين المجموع المبالغ المسماة.
    2. ثم تحديد جزء صغير من مجموع النتروجين في البروتينات التي ترد في قائمة الأحماض الأمينية كمياً في هذه الدراسة بجمع المبلغ الإجمالي لعلاء، الغليسين، Val، آسيا والمحيط الهادئ، الفنيل ألانين، لوي، إيل، Thr، سر، برو، ليز، وله، وغلو والأرجنتين (في ملغ N/لتر)، وقسمة المجموع جبل النيتروجين الواردة في البروتينات بهذا المبلغ.
    3. حساب النيتروجين المقدمة من ارجينين، الجلوتامين أو الأمونيوم التي تم استردادها في قائمة الأحماض كمياً في هذه الدراسة بجمع الكسر المسمى (بملغ N/لتر) من قائمة الأحماض الأمينية التي تم تقديرها كمياً في الدراسة (علاء، الغليسين، فال، آسيا والمحيط الهادئ، Phe، لوي، إيل، Thr، سر، برو، ليز، له، وغلو، والأرجنتين) أثناء تجارب حضور 15ن المسمى ارجينين، الجلوتامين، أو الأمونيوم وقسمة المبلغ الإجمالي للنيتروجين في قائمة كمياً الأمينية هذا الكسر يسمى النيتروجين الأحماض.
    4. تقييم مساهمة الأحماض الأمينية الأكثر وفرة 3 إلى تجمع داخل الخلايا من النتروجين التي تستخدم تخليق حيثياته الحيوي عن طريق الجمع بين البيانات من 13ج و 15ن النظائر الراسم تجارب (جدول البيانات في الجدول 7).
    5. من إجمالي المبلغ (معبراً عنه بوحدات مم) من قائمة Val، لوي، وايل، أو Thr، خصم الجزء مستمدة من الإدماج المباشر للمركبات المستهلكة (13ج التجارب) والجزء الذي كان سينثيتيزيد نوفو دي استخدام النتروجين من 3 المصادر الرئيسية لتقييم الكسر الذي كان سينثيتيزيد نوفو دي استخدام النتروجين من الأحماض الأمينية الأخرى.
    6. ثم، حساب نسبة الكمية من الأحماض الأمينية دي نوفو سينثيتيزيد استخدام النتروجين تقدمها جلن، والأرجنتين، و NH4+ (مجموع المعرب عنها في مم) بمبلغ إجمالي قدرة قائمة الأحماض الأمينية (في مم) لقياس المساهمة ارجينين، الجلوتامين، والأمونيوم إلى تجمع النيتروجين داخل الخلايا.
  3. 13 تجارب التتبع النظائري ج
    1. حساب الكسور المسماة وغير المسماة الأحماض الأمينية قائمة من التركيزات في ملم والنظائر الفاسدون من قائمة الأحماض الأمينية التي تم الحصول عليها من خلال تجارب حضور 13ج المسمى اليورانيوم المنخفض التخصيب، فال، إيل أو Thr-(انظر 6.2.1، الجدول 10).
    2. حساب كسور المتطايرة من التركيزات في ملم والفاسدون النظائر للمركبات المتطايرة التي تم الحصول عليها من خلال تجارب حضور 13ج المسمى اليورانيوم المنخفض التخصيب، فال أو إيل Thr ( المسماة وغير المسماة الجدول 10).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 3 رسم تخطيطي لسير العمل الذي تنفذه الخميرة من تعدد مصادر النيتروجين التي تم العثور عليها أثناء تخمير النبيذ للتحقيق في الإدارة.
للحصول على نقاط مختلفة لأخذ العينات والخصائص البيولوجية معلمات – النمو وأنماط استهلاك النيتروجين وملف التعريف من قائمة الأحماض الأمينية – تظهر إمكانية تكرار نتائج عالية بين تخمير (الشكل 4). هذا التناسق بالتحقق من صحة بأهمية النهج القائم على مجموعة البيانات التي تم إنشاؤها من خلال مجموعة من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحديد الكمي لتقسيم المركبات عن طريق شبكات الأيضية باستخدام تجارب التتبع النظائري نهج واعدة لفهم عملية الأيض الميكروبي. هذه المنهجية، بينما طبقت بنجاح مع واحد أو اثنين من ركائز المسمى، لا يمكن حاليا تنفيذ دراسة أيض مصادر مختلفة باستخدام نظائر عنصري مسماة متعددة (أي، ركائز اثنين أو أكثر). وفي الواقع، تمكين التقنيات التحليلية المتاحة تحديد دقيق لوضع العلامات أنماط قائمة الأحماض الأمينية والجزيئات حصرا عند استخدام النظائر المشعة لعنصر واحد، وربما عندما وسم يشترك مع هذين العنصرين. ونتيجة لذلك، معالجة أوجه القصور هذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر موريت جان روش وديكين سيلفي وجان-ماري ساباليروليس للمساهمة في تصور نظام الروبوتية ساعد التخمير وبردال مارتين، نيكولا بوفييه وباسكال بريال لتقديم الدعم التقني لهم. التمويل لهذا المشروع كان قدمت دي وزارة التعليم الوطني، de la البحوث وتكنولوجي de la.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
D-GlucosePanReac141341.0416
D-FructosePanReac142728.0416
DL-Malic acidSigma AldrichM0875
حامض الستريك أحادي الهيدراتSigma AldrichC7129
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةSigma AldrichP5379
كبريتات البوتاسيومSigma AldrichP0772
كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدراتسيجما ألدريتش230391
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتسيجما ألدريتشC7902
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشS9625
كلوريد الأمونيومسيجما ألدريتشA4514
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش71690
كبريتات المنغنيز أحادية الهيدراتسيجما ألدريتشM7634
كبريتات الزنك سباعي هيدراتسيجما ألدريتشZ4750
كبريتات النحاس (II) خماسي هيدراتسيجما ألدريتشC7631
يود البوتاسيومسيجما ألدريتشP4286
الكوبالت (II) كلوريد سداسي الهيدراتسيجما ألدريتشC3169
حمض البوريكسيجما ألدريتشB7660
الأمونيوم سباعي الموليبداتسيجما ألدريتشA7302
ميو إينوزيتولسيجما ألدريتشI5125
D-حمض البانتوثنيك ملح هيميكالسيومسيجما ألدريتش21210
الثيامين ، هيدروكلوريدسيجما ألدريتشT4625
حمض النيكوتينيكسيجما ألدريتشN4126
بيريدوكسينسيجما ألدريتشP5669
البيوتينسيجما ألدريتشB4501
Ergost & eacute ؛ رولسيجما ألدريتشE6510
توين 80سيجما ألدريتشP1754
الإيثانول المطلقVWR الكيميائية101074F
الحديد (III) كلوريد سداسي هيدراتسيجما ألدريتش236489
حمض الأسبارتيكL-Sigma AldrichA9256
L-Glutamic acidSigma AldrichG1251
L-AlanineSigma AldrichA7627
L-ArginineSigma AldrichA5006
L-CysteineSigma AldrichC7352
L-GlutamineSigma AldrichG3126
GlycineSigma AldrichG7126
L-HistidineSigma AldrichH8000
L-Isoleucineسيجما ألدريتشI2752
L-LeucineSigma AldrichL8000
L-LysineSigma AldrichL5501
L-MethionineSigma AldrichM9625
L-فينيل ألانينسيجما AldrichP2126
L-ProlineSigma AldrichP0380
L-SerineSigma ألدريتشS4500
L-ثريونينسيجما ألدريتشT8625
L-تريبتوفانسيجما ألدريتشT0254
L-التيروزينسيجما ألدريتشT3754
L-فالينسيجما ألدريتشV0500
13< / sup>C5-L-ValineEurisotopCLM-2249-H-0.25
13< / sup>C6-L-LeucineEurisotopCLM-2262-H-0.25<
sup>15< / sup>N-Ammonium كلوريدEurisotopNLM-467-1
ALPHA-15< / sup>N-L-GlutamineEurisotopNLM-1016-1
U-15< / sup>N4-L-ArginineEurisotopNLM-396-PK
أسيتات إيثيلسيجما ألدريتش270989
إيثيل بوبانواتسيجما ألدريتش112305
إيثيل 2-ميثيل بروبانواتسيجما ألدريتش246085
إيثيل بوتانواتسيجما ألدريتشE15701
إيثيل 2-ميثيل بوتانواتسيجما ألدريتش306886
إيثيل 3-ميثيل بوتانواتسيجما ألدريتش8.08541.0250
إيثيل هيكسانواتسيجما ألدريتش148962
إيثيل أوكتانواتسيجما ألدريتشW244910
إيثيل ديكانواتسيجما ألدريتشW243205
إيثيل دوديكانواتسيجما ألدريتشW244112
إيثيل لاكتاتسيجما ألدريتشW244015
ثنائي إيثيل سكسيناتسيجما ألدريتشW237701
2-ميثيل بروبيل أسيتاتسيجما ألدريتشW217514
2-ميثيل بوتيل أسيتاتسيجما ألدريتشW364401
3-ميثيل بوتيل أسيتاتسيجما ألدريتش287725
2-فينيل إيثيل أسيتاتسيجما ألدريتش290580
2-ميثيل بروبانولسيجما ألدريتش294829
2- ميثيل بوتانولسيجما ألدريتش133051
3-ميثيل بوتانولسيجما ألدريتش309435
هيكسانولسيجما ألدريتش128570
2-فينيل لثانولسيجما ألدريتش77861
حمض البروبانويكسيجما ألدريتش94425
حمض البيوتانويكسيجما ألدريتش19215
2-حمض ميثيل بروبانويكسيجما ألدريتش58360
2-حمض ميثيل بوتانويكسيجما ألدريتش193070
حمض 3-ميثيل بوتانويكسيجما ألدريتشW310212
حمض الهكسانويكسيجما ألدريتش153745
حمض الأوكتانويكسيجما ألدريتشW279900
حمض الديكانويكسيجما ألدريتشW236403
حمض الدوديكانويكسيجما ألدريتشL556
المخمر 1 لترLegallaisAT1357مخمر مصنوع يدويا للتخمير
نظام الترشيح الفراغي القابل للتصرفدومينيك دويتشر029311
المخمرات (250 مل)LegallaisAT1352مخمر مصنوع يدويا للتخمير
أنابيب معقمةSarstedt62.554.502
أقفال التخميرLegallaisAT1356أقفال التخمير المصنوعة يدويا للتخمير
BactoYeast ExtractBecton و Dickinson and Company212750
BactoPeptoneBecton و Dickinson and Company211677
شاكر حاضنةInfors HT
عداد الجسيماتبيكمان كولتر6605697Multisizer 3 Coulter Counter
الطرد المركزيJouanGR412
لوحة الخادم الشخصي نظام الروبوتخدمات المختبر BVPF0X-MAلوحة الخادم الأوتوماتيكية
خدمات مختبرروبوت البرمجيات
روب روب فيوداخليا المطور برنامج الحساب
الخاص بي SQLقاعدة بيانات المصدر الدولية
Cimarec i Telesystem Multipoint StirrersThermo Fisher Scientific50088009String Drive 60
BenchBlotter منصة الروكDutscher60903
مجموعة الأمونيا الأنزيميةR-Biopharm AG5390
Cuvettes مقياس الطيفVWR634-0678
مقياس الطيف الضوئي UviLine 9400الأحماض الأمينية Secomam
الفسيولوجية - الحمضية والمحايدةSigma AldrichA6407
معايير الأحماض الأمينية الفسيولوجية - الأساسياتSigma AldrichA6282
Citrate مخازن الليثيوم - كاشف النينهيدرين الفائقBiochromBC80-6000-06
حمض السلفوساليسيليكSigma AldrichS2130
نورليوسينسيجما ألدريتشN1398
Biochrom 30 AAABiochrom
EZChrom EliteBiochrom أداة التحكم وتحليل البيانات
برنامج Ultropac 8 راتنج ليثيومبيوكرومBC80-6002-47ليثيوم عالي الدقة مرشح العمود الفسيولوجي
Millex GVMerck MilliporeSLGVX13NLMillex GV 13 مم (حجم المسام 0.22 وميكرو ؛ م)
مرشح الغشاء PALLVWR514-4157Supor-450 47 مم 0.45 ومايكرو ؛ م
مضخة فراغ Millivac MiniMilliporeXF5423050
طبق وزن أملس من الألومنيوم 70 ممVWR611-1380
ميزان دقيقMettlerمواصفات AE163
ثنائي ميثيل سلفوكسيد مجففMerck 1029310161(بحد أقصى 0.025٪ H2< / sub>O)
الاحتراقLegallais
مجموعة فحص البروتين بيرس BCAInterchimUP40840A
حمض الفورميكFluka94318
بيروكسيد الهيدروجينSigma AldrichH1009
حمض الهيدروكلوريك المدخن 37٪ EmsureMerck1003171000Grade ACS و ISO و Reag. Ph Eur
Lithium acetate bufferBiochrom80-2038-10
حل تجاري للأحماض الأمينية المتحللةSigma AldrichAAS18
L-Methionine sulfoneSigma AldrichM0876
L-Cysteic acid monohydrateSigma Aldrich30170
أنابيب زراعة زجاج PyrexSigma AldrichZ653586
بيريدينأكروس أورجانكس13178050099٪
إيثيل كلوروفورماتالنقاء سيجما ألدريتش23131
ثنائي كلورو ميثانسيجما ألدريتش32222
قارورةسيجما ألدريتش854165
ميكروإدكس لقوارير 1.5 ملسيجما ألدريتشSU860066
GC / MSAgilent Technologies5890 GC / 5973 MS
ChemstationAgilent Technologiesبرنامج التحكم في الأدوات وتحليل البيانات
الميثانولSigma Aldrich34860Chromasolv ، ل HPLC
AcetonitrileSigma Aldrich34998ChromasolvPlus ، ل HPLC
N ، N-Dimethylformamide dimethyl acetalSigma Aldrich394963
BSTFASigma Aldrich33024
DB-17MS عمودAgilent Technologies122-473130 م * 0.25 مم * 0.15 وميكرو ؛ م
كبريتات الصوديوم ، اللامائيةسيجما ألدريتش238597
النيتروجين التقنيمنتجات الهواء14629
Zebron ZB-WAX العمودPhenomenex7HG-G007-1130 م * 0.25 مم * 0.25 & micro ؛ م
منتجات الهيليوم BIPAir26699
ماصات باستور زجاجيةVWR612-1702
البرمجيات BV الضوئي معايير فرن SeccoSolv ممتاز

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
  2. Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
  3. Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
  4. Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
  5. Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266(2008).
  6. Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
  7. Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
  8. Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
  9. Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
  10. Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
  11. Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
  12. Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).
  13. Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).
  14. Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
  15. Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
  16. Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
  17. Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Isotopic Tracer ExperimentsMicrobial MetabolismNitrogen Source PartitioningYeast Metabolic NetworkStable Isotope LabelingParallel FermentationsHPLC GC MS AnalysisRobot Assisted MonitoringAmino Acid AnalysisVolatile Molecule Quantification

مقالات ذات صلة