Method Article

أسلوب أنبوب الاسطوانة المعدلة لتصوير متقطعة الذات المترجمة ومتكررة خلال ثقافة طويلة الأجل من شرائح المخ في نظام مغلق

DOI:

10.3791/56436

⸱

December 28th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Molecular, Cellular and Integrated Neuroscience Program, Colorado State University, 2IBMC-Instituto de Biologia Molecular e Celular, i3S-Instituto de Investigaçãoe Inovação em Saúde, ICBAS, Universidade do Porto, 3Denali Therapeutics

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدم هنا طريقة أنبوب اسطوانة معدلة لاستزراع وتصوير عالي الدقة متقطعة من الدماغ القوارض شرائح الأسابيع كثيرة مع إعادة تنظيم دقيق في كوفيرسليبس فوتوتشيد. كذلك يتم الاحتفاظ بصلاحية الخلايا العصبية ومورفولوجيا شريحة. يتم توفير تطبيقات هذا النظام مغلق تماما استخدام الفيروسات للتعبير نوع من الخلايا المحددة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شرائح الدماغ القوارض مثقف مفيدة لدراسة سلوك الخلايا العصبية وإطلاق في بيئة التي يحتفظ العديد من تفاعلاتها طبيعية في فيفو الخلوية والجزيئية. الشرائح التي تم الحصول عليها من مجموعة متنوعة من خطوط الماوس المحورة وراثيا أو استخدام النواقل الفيروسية للتعبير عن البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة أو الصحفيين في شرائح الدماغ نوع البرية السماح للتصوير عالي الدقة بالفحص المجهري الأسفار. على الرغم من أن قد وضعت عدة طرق لتصوير شرائح المخ، الجمع بين الثقافة شريحة مع القدرة على القيام بتصوير عالي الدقة المتكررة من خلايا معينة في شرائح حية على مدى فترات زمنية طويلة قد يطرح مشاكل. وهذا ينطبق بشكل خاص عند استخدام النواقل الفيروسية للتعبير عن البروتينات الخارجية حيث يتم ذلك أفضل في نظام مغلق حماية المستخدمين ومنع حدوث التلوث المنتقل. ويفاد بسيطة التعديلات التي أدخلت على أسلوب ثقافة شريحة الدماغ أنبوب الاسطوانة التي تسمح بتصوير عالي الدقة المتكررة لشرائح على مدى أسابيع عديدة في نظام مغلق. استزراع شرائح في كوفيرسليبس فوتوتشيد يسمح باستخدام علامات الاعتماد لسرعة ودقة تعيين موضع مرحلة الصورة الميدانية متطابقة مع مرور الوقت قبل وبعد العلاجات المختلفة. وترد أمثلة لاستخدام هذا الأسلوب جنبا إلى جنب مع تلطيخ الخلايا العصبية المحددة والتعبير لمراقبة التغييرات في بنية شريحة هيبوكامبال والفيروسية بوساطة التعبير العصبية من البروتينات الفلورية وتطوير علم الأمراض كوفيلين، سابقا الذي لوحظ في قرن آمون لمرض الزهايمر (AD) ردا على معاملة الشريحة مع ليغومرات الببتيد اميلويد-بيتا (Aβ).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الثقافة الأولية من الخلايا العصبية معزولة من مناطق الدماغ القوارض هو أداة هامة يستخدمها الباحثون لمراقبة الردود على مرضية المتورطين المحفزات. غير أن هذه الدراسات قد عيب تبحث في الخلايا العصبية في 2D فقط ودون نظام الدعم لهم الدبقية. وعلاوة على ذلك، إلا إذا نمت في ظروف كثافة عالية جداً (640 الخلايا العصبية/مم2 أو حوالي 16% من المساحة السطحية) الذي يصبح من المستحيل متابعة ثمرة عشوائية تغصن أو إكسون لأكثر من مسافة قصيرة من جهازها الخليوي، هيبوكامبال صلاحية الخلايا العصبية أكثر من 4 أسابيع انخفاضات كبيرة1، الحد من استخدام الثقافات معزولة لإجراء دراسات موسعة للأمراض المرتبطة بالسن. استزراع شرائح أعدت من الدماغ القوارض هو خيار جذاب أن يتغلب على هذه القيود من خلال الحفاظ العمارة خلية المنظمة وقدرتها على البقاء لأسابيع أو أشهر. وكانت الظروف للحفاظ على العديد من مناطق مختلفة من الدماغ القوارض في ثقافة شريحة وصف2.

اثنين من الأساليب الرئيسية تستخدم على نطاق واسع لثقافة طويلة الأجل من شرائح المخ: يسمح لتدوير في حاضنة اسطوانة توفير تهوية4استزراع على الأغشية في واجهة الهواء السائل3 أو استزراع في كوفيرسليبس في أنابيب محكمة الإغلاق. يمكن تصويرها شرائح مثقف على الأغشية مباشرة مع الفحص المجهري الفلورية العالية الاستبانة استخدام مجهر تستقيم والماء الغمر الأهداف5. بدلاً من ذلك، تم نقل شرائح مثقف في الأغشية للزجاج أسفل الأطباق التوصل إلى حل جيد للعمود الفقري الجذعية استخدام مجهر مقلوب6. ومع ذلك، كلا أساليب التصوير شرائح نمت على الأغشية هي النظم المفتوحة التي تتطلب التغييرات متوسطة، وغالباً ما تستخدم مضاد و/أو المضادات الحيوية لمنع أو الحد من تلوث5،6. الشرائح في غشاء في الواجهة الجوية المتوسطة الحفاظ على مورفولوجيا ممتازة والبقاء على قيد الحياة، ولكن العودة إلى المواقع بدقة أثناء التصوير المتكرر في تضخم عالية من الصعوبة ما لم يتابع التجربة مجموعات صغيرة فقط من الخلايا وإذ تعرب عن علامة نيون. على الرغم من أن قد استخدمت شرائح نمت على الأغشية مع التعبير الفيروسية بوساطة من المتسلسلات5،6، بروتوكولات السلامة الأحيائية قد تتطلب ستستخدم نظام ثقافة مغلقة لبعض النواقل الفيروسية التي يتم استخدامها من أجل وإذ تعرب عن فلوريسسينتلي معلم البروتينات والصحفيين لفيزيولوجيا الخلية. وعلاوة على ذلك، تتطلب أهداف الغمر إزالة التلوث بين العينات التي سيتم اتباعها في الثقافة5. تطبيق الرئيسية واحد من الغشاء واجهة الثقافات هو الجمع بين التصوير عالي الدقة مع الكهربية في وقت واحد النقاط7.

لا يسمح الأسلوب أنبوب الاسطوانة مع كوفيرسليبس داخل أنبوب بلاستيكي أي الكهربية أو تصوير عالي الدقة دون إزالة ساترة. وهكذا طبق هذا الأسلوب في أغلب الأحيان للدراسات الطويلة الأجل التي جعلت الملاحظات التثبيت بعد8. الموصوفة هنا هو طريقة التي يستخدم تقنية الثقافة أنبوب الاسطوانة ولكن المحافظة على أنابيب حفر السحب مع شرائح في كوفيرسليبس التي يمكن تصويرها متكررة لطالما الثقافات. يتطلب أي تغيير متوسطة لتصوير نظام مغلق ويستخدم كوفيرسليبس فوتويتشيد لتقديم علامات الاعتماد التي تسمح للتصوير في تضخم عالية، بعد أيام أو أسابيع، حقول محددة سبق تصويرها.

نقوم بتطبيق هذا الأسلوب لدراسة التغيرات في الحصين القوارض، منطقة الدماغ رئيسية مشاركة في الذاكرة والتعلم. وكثيراً ما يتم دراستها الحصين القوارض كنموذج للتغيرات المرضية أو المرتبطة بالسن التي لوحظت أثناء التطوير من ضعف الإدراك9، مثل تلك التي تحدث في الإعلان. أسلوبنا مناسبة خاصة لدراسة التغييرات المرضية التي تضع ضمن شريحة واحدة على مر الزمن في الاستجابة للتغيرات البيئية، مثل الزيادات في الببتيدات Aβ، التي من سمات AD8. وهو أحد الأمراض المرتبطة بالإنسان والقوارض الدماغ الإعلانية وجود المجاميع كوفيلين-أكتين وقضبان، الحزم التي تحتوي على هذا الأخير من خيوط الأكتين وكوفيلين في 1:1 نسبة مولى10،11، 12-قضبان وقد لوحظت في الشرائح الثابتة الحصين الفئران بعد العلاج Aβ، وكذلك ضمن شريحة الدماغ القوارض يعيش معربا عن التعرض لنقص8كوفيلين-بروتينات فلورية خضراء، وأنها قد تسهم في اختلال وظيفي متشابك في الإعلان والسكتة الدماغية. هنا نستخدم هذا الأسلوب الجديد في تثقيف للالتزام بالوقت بالطبع والتوزيع داخل شرائح أعرب البروتينات الفلورية تشيميريك خارجية عشر أدخلت بأنواع مختلفة من الفيروسات. ثم نستخدم تعبيراً محدداً الخلايا العصبية لبناء كوفيلين مراسل لمتابعة وضع قضيب كوفيلين وأمراض الكلي في شرائح هيبوكامبال استجابة للعلاج مع ليغومرات Aβ القابلة للذوبان (Aβس).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام الحيوان يتبع تربية المعتمدة وبروتوكولات استخدام الحيوانات التي تتوافق مع "العناية بالحيوان" و "استخدام المبادئ التوجيهية من جامعة ولاية كولورادو".

ملاحظة: بروتوكول أدناه يصف طريقة إعداد والثقافة للحضانة الطويلة الأجل وتصوير متقطعة شرائح هيبوكامبال. شريحة هيبوكامبال واحدة موصولة إلى ساترة فوتوتشيد أعدت خصيصا استخدام تجلط بلازما، وثم مختومة كوفيرسليبس على الجانب المسطح من أنبوب حفر خارج الاسطوانة، التي يتم الاحتفاظ بها في حاضنة اسطوانة. يتم حل تجلط البلازما لازمين قبل العدوى الفيروسية لتعبير البروتينات الفلورية وتصوير عالي الدقة. يتم استخدام صبغة حيوية الخلايا العصبية فلورسنت الصورة في الخلايا العصبية داخل الشرائح.

1-إعداد الاسطوانة أنبوب حامل

  1. استخدام القالب هو مبين في الشكل 1 طباعة حجم سيظهر في شريط مقياس. مع مسمار، لكمه ثقوب صغيرة (كبيرة بما يكفي لعلامة نقطة غرامة) في قالب تتمحور حول الثقوب.
  2. تعيين القالب في أسفل طبق استنبات الأنسجة 15 سم (القطر الأسمى من 14 سم) ووضع علامة على موضع الثقوب. كرر هذا الإجراء في صحن ثاني.
  3. مع لقم الثقب مصمم للاستخدام على البلاستيك، حفر ثقوب قطرها 1.5 سم ستة في كل طبق في صفيف (4.8 سم مركز إلى مركز) سداسية مع مراكز هول 2.5 سم من حافة الطبق. حفر ثقوب ثلاثة (3 مم في القطر) 12 مم من الحافة التي توضع اكويديستانتلي بين اثنين من أكبر الثقوب كما هو مبين في الشكل 1ألف.
  4. مع القيعان من كل طبق في مواجهة بعضهما البعض، مكان المسمار آلة طويلة مقاس 2.5 بوصة (قطرها 3/16 بوصة) مع غسالة مسطح من خلال واحدة من الثقوب الصغيرة تليها غسالة شقة ثاني، قطعة من البولي إيثيلين الأنابيب (فاصل، 4.7 سم)، وآخر غسيل مسطح ، طبق استنبات الأنسجة الثانية وغسيل مسطح آخر وغسالة قفل والجوز.
  5. كرر الخطوة 1، 4 مسامير الجهاز اثنين آخرين، وتشديد فضفاضة فقط حتى يتم كل آلة مسامير في المكان. ثم تشديد المكسرات بشكل أمن.
  6. تعمل الحلقات (5/16 بوصة سميكة، 5/8 بوصة حفرة قطرها) في الثقوب للطبق السفلي للحصول على أنابيب الاسطوانة النهائية الحامل (الشكل 1ب؛ سيظهر مع اثنين من الأنابيب في مكان). وضع ملصق على كل رف برقم فريد.

2-إعداد أنابيب الرول وكوفيرسليبس

  1. مما يجعل الرقصة لحفر الحفرة في أنابيب الرول
    1. حفر حفرة 1.5 سم عمق 8 سم في الجانب مركز 2 × 4 × 5.5 بوصة كتلة خشبية في زاوية من هذا القبيل أن أنبوب الجانب المسطح من الاسطوانة سوف تكون تقريبا بالتوازي مع الكتلة عند إدراج (الشكل 2أ).
    2. تكبير الثقب باستخدام ملف خشب جولة إلى كل من الاتساع وتفتق حفرة للسماح بإدخال أنبوب (أنابيب الاسطوانة أكبر قليلاً في قطر بالقرب من نهاية عملية النداءات الموحدة) (الشكل 2ب).
    3. حفر ثقب عمودي قطرها 1.5 سم، سم 5.5 من الجانب من الكتلة، وتتوسط الحفرة الجانبية (الشكل 2-ج).
    4. عندما ثقب الجانب هو مدبب ما يكفي، إدراج أنبوب اسطوانة التي تم وضع علامة في المكان المطلوب لمركز الحفرة للشريحة ووضع الأنبوب حيث يتركز الفور ملحوظ في حفرة رأسية 1.5 سم.
    5. إزالة الأنبوب وقياس المسافة من النقطة إلى نهاية الأنبوب. وضع علامة على هذه المسافة من مركز الثقب في الرقصة وإدراج مسمار لتوفير حد لوضع الأنبوب للحفر (السهم في الشكل 2ج) بشكل صحيح.
    6. استخدم منشارا قطع الأظافر دافق مع سطح كتلة الخشب لمنع الإصابة.
    7. إضافة قصاصات الربيع في الجزء السفلي من الرقصة إذا كان هناك صحفي الحفر مع الفتحات التي تسمح لها بأن تكون رأسية (الشكل 2د الأسود السهم). خلاف ذلك، استخدام سي المشابك لعقد الرقصة بشكل أمن على الصحافة الحفر.
  2. استخدام الرقصة الموصوفة أعلاه عقد ووضع أنبوب بلاستيك ثقافة مسطحة الوجهين سم 11 مع الجانب مسطحة (الشكل 2أ)، وحفر حفرة قطرها 6 مم مع مركز 1.0 سم من الأسفل، وتركزت بين الجانبين من الأنبوب.
    ملاحظة: يجب استخدام مثقاب مصممة للبلاستيك.
  3. مع أداة deburring الدوران، وتجانس حواف الحفرة (الشكل 2ه) وجعل الأخاديد 4 داخل حافة الحفرة (الشكل 2ه، اقحم) تيسيرا لتجفيف الحفرة أثناء التناوب.
  4. مع وجود ثقب 12 مم لكمه، وقطع أقراص قطرها 12 مم من أوراق المطاط غير سامة مزدوج الوجهين لاصق السيليكون. استخدام لكمه ثقب واحد ورق قياسية (6 مم)، أحداث فجوة في وسط كل قرص.
  5. شطف أنابيب حفر مع الإيثانول 70%، والهواء الجاف لهم في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء، وتعقيم الأنابيب وأقراص لاصقة لكمات لمدة 40 دقيقة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (30 ث على مسافة 70 سم ومتوسط) في السلامة البيولوجية مجلس الوزراء.
  6. تغيير موضع أنابيب وأقراص بعد 20 دقيقة حيث أن يجري تعقيم جميع الأسطح المكشوفة. تحت ظروف معقمة، تقشر الأبيض النسخ من قرص لاصق وإلصاق سيليكون المطاط إلى خارج الأنبوب، محاذاة الثقوب (الشكل 2و).
    تنبيه: لتجنب التعرض للأشعة فوق البنفسجية، ارتداء العين حماية وإغلاق مجلس الوزراء قبل تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
  7. تنظيف 12 ملم قطر فوتوتشيد (100 مركز مرقمة 1 مم المربعات) الزجاج الألماني كوفيرسليبس. اضغط كوفيرسليبس بلطف بالملقط وتراجع في الإيثانول المطلقة، متبوعاً بالماء، يليه الإيثانول المطلقة مرة أخرى، وأخيراً تراجع كوفيرسليبس في لهب لحرق الإيثانول. السماح كوفيرسليبس لتبرد.
  8. عقد في كوفيرسليبس بالملقط، تراجع في نسبة 2% 3-أمينوبروبيلتريثوكسيسيلاني في الأسيتون شطف س. 10 كوفيرسليبس مع الماء عالي النقاوة والسماح للهواء الجاف.
  9. تعيين كوفيرسليبس على ورق الترشيح العقيمة داخل سلامة بيولوجية مجلس الوزراء وتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يعرض كل جانب من كوفيرسليبس لمدة 20 دقيقة.
    تنبيه: لتجنب التعرض للأشعة فوق البنفسجية، ارتداء العين حماية وإغلاق مجلس الوزراء قبل تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية.

3. إعداد شريحة هيبوكامبال

  1. قبل البدء التشريح، إعداد نصفين شفرات الحلاقة حدين للمروحية الأنسجة. أمثال الريش طوليا بعناية مع الأصابع والمفاجئة في نصف.
  2. شطف نصفي بليد مع الأسيتون باستخدام مسحه القطن لتنظيفها، تليها الشطف في الإيثانول المطلقة وهواء التجفيف.
قبل تركيب شفرة نصف على المروحية الأنسجة، تعقيم قبل الشطف مع الإيثانول 70%.
  • اتبع البروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الاستخدام؛ ورعاية الحيوان المؤسسية بعد التخدير إيسوفلوراني، euthanize جرو الفأر أو الجرذ يوم 4-7 قديمة بقطع الرأس وإزالة الرأس بالمقص أو مقصلة.
    ملاحظة: بروتوكول ثقافة شريحة الدماغ مستقل من سلالة الفئران أو ماوس أو الوراثي. وقد استخدمت العديد من خطوط الماوس المحورة وراثيا مع مختلف الخلفيات الوراثية.
  • شطف الرأس مع الإيثانول 70%، ثم ضعه في 60 مم طبق بيتري. حتى التركيب النهائي من شريحة الدماغ على أنبوب الاسطوانة، جميع الخطوات التالية تتم في غطاء الاندفاق الصفحي للحفاظ على العقم.
  • استخدام شفرة جراحية #21، جعل قطع السهمي عن طريق الجلد والجمجمة. مع ملقط دومون #5، العودة قشر الجلد والجمجمة لفضح الدماغ.
  • مع الملقط مغلقة، بلطف ندف خارج الدماغ كله، وإطلاقه معسر مع الملقط عبر جذع الدماغ وراء المخيخ. ضع الدماغ في طبق 60 ملم معقمة تحتوي على Solution/0.5% الملح متوازنة الجلوكوز 4 درجة مئوية جي (جبس/الجلوكوز).
  • استخدام مجهر تشريح لتصور الدماغ (الشكل 3أ)، ضع الجانب الظهرية الدماغ أعلى وقطع الثالث الجبهة من المخ والمخيخ بشفرة جراحية (الشكل 3ب).
    1. مع الملقط، عقد في الجانب الخلفي للدماغ المشذبة أعلى والجانب البطني ضد الجانب طبق بيتري للاستقرار. بلطف ندف السحايا بعيداً حول خط الوسط السهمي وإزالة الأنسجة midbrain استخدام ملقط دومون #5 مقلوب غرامة (الشكل 3جيم، دائرة متقطع).
    2. إجراء تخفيضات اثنين على طول الجانب من الدماغ لتنتشر مفتوحة (الشكل 3جيم، خطوط متقطعة). حالما يتم وضع الدماغ الظهرية الجانبية إلى أسفل وفتح انتشار، الشق هيبوكامبال يجب أن تكون مرئية (الشكل 3د، السهم).
    3. نقل انتشار المخ مفتوحة لقطعة من الفيلم بوليتشلوروتريفلوروثيليني البلاستيك ووضعه لتقطيع المرحلة من المروحية الأنسجة. الرطب بليد مع جبس/الجلوكوز وختم الحصين إلى ~ 300 ميكرون شرائح سميكة.
    4. مع ماصة نقل، مسح الدماغ شرائح إيقاف الفيلم البلاستيك إلى طبق جديد 60 ملم تحتوي على جبس/الجلوكوز (الشكل 3ه). بلطف قرصه قبالة وندف بعيداً، مع غرامة الملقط مقلوب والسحايا المتبقية والأنسجة الأخرى غير هيبوكامبال (الشكل 3و) من الشرائح (الشكل 3ز، ح).

    • 4-طلاء الشرائح

    1. مرة واحدة وقد تم الحصول على شرائح، ضع 2 ميليلتر من البلازما الدجاج في مركز فوتويتشيد في الجانب ساترة استعداد. وانتشرت في البلازما قليلاً لتحقيق بقعة قطرها 3-4 ملم.
      ملاحظة: أن الجانب فوتويتشيد على الجانب العلوي من ساترة عندما ينظر إليها من خلال مجهر تشريح أن الأرقام التي تتجه بشكل صحيح.
    2. نقل شريحة الدماغ 1 مع ملعقة نصيحة الضيقة عقيمة (الشكل 4أ) على الفور البلازما (الشكل 4ب). استخدام الملقط مغلقة للحفاظ الشريحة على طرف الملعقة حين رفع الشريحة من جبس/الجلوكوز.
    3. تلمس الملعقة للبلازما بقعة ساترة، ومع الملقط مغلقة، ودفع الشريحة على ساترة.
    4. ميليلتر 2.5 مزيج من البلازما مع 2.5 ميليلتر من ثرومبين في أنبوب منفصل. بسرعة ضع ميليلتر 2.5 من هذا الخليط أكثر وحول شريحة وبيبيت صعودا وهبوطاً بلطف مزيج (الشكل 4ب).
      ملاحظة: سوف تجلط البلازما داخل 10-15 ثانية، حيث يجب أن يتم ذلك بسرعة. إذا كان الالتصاق شريحة تمثل مشكلة، مزيج 5 ميليلتر البلازما مع 5 ميليلتر ثرومبين واستخدام 4-5 ميليلتر في الشريحة، إزالة بعض بعد خلط حيث أن الشريحة تقع الشقة على ساترة.
    5. إزالة البلاستيك الشفاف الذي يغطي من الجهة المكشوفة من لاصق مطاط السيليكون سابقا الملصقة على أنبوب اسطوانة وساترة مع شريحة الدماغ على لاصق محاذاة الشريحة داخل الحفرة (الشكل 4ج).
    6. لضمان الالتصاق، تطبيق لينة، الضغط حتى إلى ساترة مع الإبهام بالضغط ساترة بالتساوي، وعقد لحوالي 1 دقيقة أثناء نقلها إلى السلامة البيولوجية مجلس الوزراء.
    7. في مجلس الوزراء سلامة بيولوجية، إضافة 0.8 مل من إكمال A نيوروباسال الثقافة المتوسطة (جدول المواد) لكل أنبوبة (الشكل 4د).
    8. تدفق مزيج هواء 5% CO295 في المائة عن طريق عقيمة الوتر القطن باستور ماصة عقدته المشبك بشكل أمن. تدفق أنبوب الاسطوانة مع خليط الغاز وسرعة في آب الأنبوب حيث يتم سحبه من حولها الماصة.
    9. تسمية الأنابيب مع رقم الشريحة ورقم الرف. إدراج أنابيب في حامل الرول، ضمان أنها متوازنة بشكل هندسي. إذا كان هناك عدد فردي من الأنابيب، إضافة أنابيب لتحقيق التوازن.
    10. وضع الرفوف في حاضنة اسطوانة 35 درجة مئوية مع تحول حامل الرول في حول بكرات الأستاذ 10-13 (الشكل 4ه). للحفاظ على المتوسط في الجزء السفلي من الأنابيب، يعود إمالة الحاضنة حوالي 5 درجة برفع به الجبهة في مجلس.
    11. أدخل رقم الشريحة وأنبوب على جدول بيانات، الذي يستخدم لتسجيل كافة المعلومات من العلاجات شريحة وتواريخ المراقبة.
    12. في حوالي يوم 6 في الثقافة، وإضافة 1 ميليلتر (0.002 يو) من النشطة لازمين لكل أنبوبة.
    13. بعد الجلطات تذوب تماما (عادة في غضون ساعات قليلة)، إزالة المتوسطة واستبدالها بالطازجة المتوسطة دون لازمين. إذا لزم الأمر، يمكن المحتضنة شرائح مع لازمين بين عشية وضحاها وتغير المتوسط في اليوم التالي.
    14. عادة ما يتم المحتضنة شرائح على الأقل 7-10 أيام قبل استخدامها في التجارب. نضح المتوسطة ويحل محله في يوم 3 أو 4، مرة أخرى في اليوم السابع، وبعد ذلك كل 7 أيام.

    5-إعداد النواقل الفيروسية للتعبير التحوير

    ملاحظة: التعبير عن المتسلسلات في الخلايا العصبية للثقافات شريحة يتحقق أما باستخدام العقول من القوارض المهندسة وراثيا، أو عن طريق إدخال التحوير بالإصابة بفيروسات النسخ المتماثل المؤتلف ناقصة.غدية (AV)، وفيروسات الغدد المرتبطة (إف)، وناقلات lentivirus المؤتلف جميعا قد استخدمت في ثقافاتنا شريحة هيبوكامبال للتعبير عن التركيبات بروتين فلوري مختلف شرائح المخ.

    1. إعداد النسخ المتماثل AV قاصرة للتعبير عن الحمض النووي الريبي للفائدة وفقا للأساليب الموصوفة في أماكن أخرى13،14. عيار الفيروسات المعدية يو/مل بطريقة التخفيف التسلسلي استخدام جسم مضاد لبروتين فيروسي أعرب كوصف14. لمراقبة كوفيلين المجاميع وتشكيل قضبان كوفيلين-أكتين، الاستفادة من كوفيلين-R21Q-مرفب كدنا (بلازميد #51279)16.
      ملاحظة: المروج 1 سينابسين اختياراً ممتازا للخلايا العصبية تعبيراً محدداً15، بينما المروج الفيروس المضخم للخلايا مفيدة للقيادة مستويات عالية من التعبير في العديد من أنواع الخلايا13.
    2. إعداد إف من تعداء المشارك لنقل بلازميد يحتوي على الجينات للفائدة وبلازميد rep/كاب، مع أو بدون بلازميد مساعد، في HEK293 تغليف الخلايا، التي تزود الجين E1 الفيروسية، كما هو موضح سابقا17،في الفترة من18.
      ملاحظة: إف المؤتلف يمكن أيضا إجراء للإدراج المستهدفة إلى جينوم الخلية المضيفة19. بلازميد نقل، نستخدم كوفيلين البشرية 1 ج-محطة mRFP1 fluorescence بروتين علامة (بلازميد #50856) المستنسخة في سينابسين المحتوية على مروج إف بلازميد المصب من أجهزة الاستشعار GCaMP5G الكالسيوم20. يتم إدراج قطعة من الترميز الذاتي كليفينج P2A الببتيد تسلسل الحمض النووي بواسطة PCR بين GCaMP5G وكوفيلين--طلب تقديم العروض أثناء إعداد بلازميد نقل لتوفير تعبير البروتينات كلا من إف نسخة واحدة21.
    3. إعداد ناقلات lentivirus المؤتلف من تعداء المشارك لنقل بلازميد يحتوي على الجينات أو كدنا إشارات الاهتمام والتكامل، جنبا إلى جنب مع لينتيفيروس الجيل الثالث تغليف الخليط الذي يقسم هفوة الفيروسية، وبول، والقس، والجينات منظمة-ز على ثلاثة منفصلة والبلازميدات22،23.
    4. بلازميد نقل، استخدام خطوة واحدة استنساخ النظام24 لتجميع سينابسين المروج وكدنا كوفيلين-R21Q-مرفب (من بلازميد #51279) في pLKO.1-التجارة والنقل (بلازميد #30323)، مع مروج سينابسين واستبدال في هبجك كوفيلين-R21Q-مرفب المروج وكدنا بروتينات فلورية خضراء، على التوالي.
    5. ترانسفيكت بلازميد النهائي إلى خلايا HEK293T بفوسفات الكالسيوم كما هو موضح سابقا23.
    6. جمع المتوسطة من أربعة أطباق 10 سم والتركيز إلى 500 ميليلتر استخدام مركزات الطرد المركزي 150 كقطع تخزين lentivirus النهائي في-80 درجة مئوية في مختبرين الصغيرة بعد التجميد السريع في نيتروجين سائل. ذوبان الجليد الكوة إلا مرة واحدة لإصابة الخلايا.
    7. تحديد تجريبيا حجم كل نوع من أنواع الفيروسات على استعداد لتحقيق درجة التعبير المنشود بإقامة عدد من ثقافات مختلفة من شريحة لتتبع التعبير عن المتسلسلات بعد الإصابة بأحجام مختلفة من الفيروس.
      ملاحظة: عادة ما يستخدم 1-10 ميليلتر من الفيروس كل شريحة.

    6-شريحة العلاجات

    1. شرائح إصابة بالفيروس
      1. تعمل في مجال سلامة بيولوجية مجلس الوزراء الموافقة على عمل الفيروس على مستوى السلامة البيولوجية المناسبة لمكافحة ناقلات، مزيج قاسمة الفيروس (عادة 1-10 ميليلتر) مع 0.8 مل متوسطة كاملة.
      2. نضح المتوسطة من شريحة باستخدام ماصة باستور معقمة في فخ مجموعة التي تحتوي على التبييض. يتم دائماً استخدام مصيدة ثانوية بين فخ الأولى ومصدر فراغ.
      3. استبدال هذه الوسيلة بقاسمه المحتوية على الفيروس أعد أعلاه والعودة أنابيب الثقافة برف، ووضع في الحاضنة.
      4. بعد 2-5 أيام من حضانة الشرائح مع الفيروس في السلامة البيولوجية مجلس الوزراء، إزالة المتوسطة المحتوية على الفيروس مع ماصة نقل عقيمة ووضعه في زجاجة تحتوي على عامل المضادة للفيروسات معتمدة لقتل الفيروس.
    2. تلوين الخلايا العصبية مع صبغ الحيوية
      1. تحضير وتخزين مختبرين لصبغ الحيوية العصبية الفلورسنت25 من ميليلتر 4 التجميد السريع لمختبرين في النتروجين السائل بتركيز 100 ميكرومتر وتخزين هذه في-20 درجة مئوية. عدم تجميد/ذوبان الصبغة أكثر من مرة.
      2. تسمية الخلايا العصبية للتصور بالفحص المجهري الأسفار وذوبان الجليد قاسمة واحد من صبغة حيوية الخلايا العصبية وتضعف إلى 4 مل في كامل نيوروباسال المتوسطة (تركيز الصبغ النهائي هو 100 nM).
      3. إزالة المتوسطة من شرائح بتطلع (أو مع ماصة نقل إذا المتوسط يحتوي على الفيروس) واستبدله 0.8 مل المتوسطة التي تحتوي على 100 نانومتر صبغ الخلايا العصبية الحيوية. العودة الشرائح إلى جهاز الاسطوانة في الحاضنة.
      4. بعد حضانة الشرائح من ح 2، نضح المتوسطة المحتوية على صبغ واستبدله 0.8 مل متوسطة كاملة جديدة في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء.
        ملاحظة: تسمية الخلايا العصبية في شرائح مع صبغ الحيوية يتطلب عدة ساعات للحضانة. عادة ما تؤخذ الصور الأولى ح 24 بعد العلاج صبغ. على الرغم من أن تتم تسمية الخلايا العصبية على وجه التحديد، هناك خلفية الأسفار أن ينخفض أكثر من 2-3 أيام لإعطاء أفضل تصوير الخلايا العصبية. انخفاض كثافة الصبغة الحيوية بعد 72 ساعة.
      5. لمتابعة التغييرات في مورفولوجيا شريحة على مر الزمن، ريلابيل الشرائح كل 7 أيام.

    7-شريحة التصوير

    1. عرض الشرائح على مجهر مقلوب. لتصوير fluorescence ألمع، في 24 ساعة قبل التصوير، وتبادل الثقافة المتوسطة مع المتوسط A نيوروباسال كاملة دون مؤشر الرقم الهيدروجيني الفينول الحمراء.
      ملاحظة: للتجارب التي ذكرت هنا، شرائح يتم عرضها على مجهر الأسفار [كنفوكل] قرص مقلوب لغزل مزودة بخطى ترميز x، y المرحلة مع مراقبة z بيزو وكاميرا رقمية ذات دقة عالية حساسية.
    2. نقل الأنبوب مع ثقافة شريحة تصويرها من الجهاز أنبوب الاسطوانة لصاحب الأنبوبة مصنوعة خصيصا (الشكل 5A)، التي وضعت في مرحلة محول (الشكل 5ب)، للحفاظ ساترة عمودي والهدف والحفاظ على الشريحة في نفس اتجاه خلال جلسات التصوير المتكرر على مدى فترات زمنية طويلة.
    3. دفع المنزلق على محول المرحلة مشددة ضد أنبوب لعقد الأنبوب في الموقف (الشكل 5ب).
    الحفاظ على شريحة درجة حرارة 35 درجة مئوية أثناء التصوير باستخدام التدفئة شرائط وتحكم الجراحية في صلب المحول المرحلة مصنوعة خصيصا (الشكل 5ج).
    ملاحظة: تفاصيل صاحب الأنبوبة، مرحلة محول، ويمكن الوصول إلى سخان في: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
  • استخدام قوة منخفضة (على سبيل المثال.، 4 X) الهدف وميدان مشرق تضوء، التركيز على نمط الشبكة فوتوتشيد (الشكل 6A) تحت الشريحة. لدورة التصوير الأولى، مسح حول شريحة لتحديد موقع وتسجيل العدد لمختلف المناطق حيث يتم رغبت أعلى التكبير التصوير بسرعة (مثلاً، قرن أمونيس (CA) 1، CA3، المغزلي المسنن (المدير العام)، و ما إلى ذلك).
  • نقل المسرح إلى ساحة الشبكة الأولى تحتوي على منطقة للفائدة. قم بالتبديل إلى 20 × الهدف الجوي وتحديد موقع علامة الاعتماد (مثلاً.، تلميح عدد المحفور) (الشكل 6ب).
  • قم بالتبديل إلى هدف سلطة العليا (40 X أو 60 X)، ترجمة العلامة الاعتماد، وسجل ثم x وموقف y للمرحلة. الانتقال من مرحلة للبحث عن الحقل أو حقول الفائدة القريبة وسجل يزيح عن x و y من علامة الاعتماد (الشكل 6ب، السهم). كرر في مجالات شبكة أخرى إذا رغبت في ذلك.
    ملاحظة: هذه المواقف المقاصة من علامة الاعتماد تسمح بإبراز متسقة من نفس الموقع ساترة عندما يتم تصويرها الشريحة، على الرغم من أن تغيير الإعداد y من علامة الاعتماد الأصلي x، عندما المحول أنبوب أو مرحلة إزالة واستبدال.
  • قم بالتقاط صورة Z-المكدس داخل كل حقل محدد باستخدام مجهر مراقبة موضوعية أو عنصر تحكم مرحلة بيزو، إذا كانت متوفرة.
    ملاحظة: صورة طائرات يتم عادة الحصول على فترات من 0.5 ميكرومتر إلى 2 ميكرومتر، تبعاً لحجم والقرار المطلوب من ملامح الصورة. ويتطلب بناء صورة ثلاثية الأبعاد ذات جودة أن ملامح الصورة تمتد عدة طائرات لاقتناء، وحتى لتصور ملامح أصغر، أصغر فترات مطلوبة بين الطائرات.
  • الحفاظ على مجموع التصوير الوقت لكل شريحة قصيرة قدر الإمكان.
    ملاحظة: ذكرت معظم دورات التصوير هنا كانت تحت 18 دقيقة/شريحة. بيد أننا قد تصويرها بعض شرائح عشرة أو أكثر الأوقات، وحتى كدام 40 دقيقة في جلسة واحدة، دون إلحاق أي ضرر واضح في بقاء على المدى الطويل من الشريحة.

    • Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    يمكن أن تستخدم لتحديد مدى دقة علامات الاعتماد reimage نفس الخلايا داخل نفس الحقول على مر الزمن، قمنا بدراسة الشرائح التي نمت في فوتوتشيد كوفيرسليبس (الشكل 6A). كانت تصور الخلايا العصبية بصبغة بصبغة حيوية (100 نانومتر ح 2؛ لا وصمة عار الخلايا غير العصبية)، الذي يختفي من الخلايا العصبية على مر الزمن دون إلحاق الأذى بالخلايا25. وقد حددنا الاعتماد علامة اختيار في مربع شبكة واحدة (الشكل 6

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    الاسطوانة أنبوب الأسلوب الموصوفة هنا يسمح لاستزراع طويلة الأجل وعالية الدقة تصوير حية من أنسجة المخ شرائح. مسألة رئيسية واحدة مع تقنية شريحة المطبق هنا في التركيب والصيانة لشرائح. الطلاء ساترة التي تدعم انضمام شريحة، تشجيع شريحة رقيق بتعزيز ثمرة نيوريتيس والهجرة من الخلايا خارج الشريحة؛ وبالتالي، علينا تجنب استخدام هذه ركائز. إدراج المجموعات الأمينية على الزجاج بالمعاملة مع 3-أمينوبروبيلتريثوكسيسيلاني تحسن انضمام شرائح، لكن القليل أو الكثير من البلازما الدجاج على ساترة أيضا أن يسبب مشاكل الالتزام مما يؤدي إلى فقدان شريحة...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    قيعان من أطباق ثقافة 15 سمVWR Scientific25384-326
    مسامير آلة رأس فيليبس (# 10-32)أجهزة2.5 "طويلة و 3/16" في القطر
    غسالات مسطحة # 10ACE أجهزة
    آلة الصواميل اللولبية (# 10-32)ACE الأجهزة
    المطاط الحلقات  ACE5/16 "، سميكة ؛ 5/8 "، قطر الثقب ؛ 1.125 "،
    أنابيب البولي إيثيلين OD (5/16" ؛ OD ، 3/16 "؛ معرف)قطع الأجهزةإلى 1.8 "
    طول قفل غسالة # 10ACE الأجهزة
    الحفر الصحافة ، 5 سرعات   ؛Ace HardwareProTech Model 1201
    Nunclon Delta Flat-Sided TubesVWR62407-076
    لقم الثقب ، 3 مم ، 6 مم و 15 مم   ؛Ace HardwareDiablo freud العلامة التجاريةلقم الثقب لقطع البلاستيك.
    لقم ثقب للخشب ، ملف خشب Ace Hardware
    مستديرة منAce Harware
    مقاس 16 مم ، أداة
    مقاس 16 مم ،AceHardware 26307
    (ختم آمن) سماكةGrace Bio-Labs6665810.5 مم
    ثقب 6 مملكمة مكتب ماكس
    12 مم ثقبلكمة thepunchbunch.com
    70٪ من الإيثانول
    Phototeched Coverslips ، قطر 12 ممBellco Glass، Inc.1916-91012
    بنسن الموقد
    المطلق الإيثانول
    النانو نقي المياه
    3-أمينوبروبيل تري إيثوكسيلانسيجما ألدريتشA3648
    الأسيتونسيجما ألدريتش179124
    # 5 ملقط دومونأدوات العلوم الدقيقة11251-30
    ماكلوين مروحية المناديلتيد بيلا ، إنك.10180
    شفرات حلاقة مزدوجة الحوافتيد بيلا ، إنك.121-6
    ورق ترشيح واتمانVWR28450-182مقطعة إلى دوائر قطرها 5.8 سم
    بولي كلورو ثلاثي فلورو إيثيلين (أكلار)تيد بيلا ، إنك.10501-10مقطعة إلى دوائر قطرها 5.8 سم
    # 21 شفرة جراحيةVWR Scientific25860-144
    # 5 ملقط دومونأدوات العلوم الدقيقة11251-30
    ملعقة ، غير قابلة للصدأ بنهاية مدببةVWR82027-518
    محلول الملح المتوازن من Gey'sSigma-AldrichG9779   ؛
      محلول الجلوكوزThermoFisher Scientific15023-02125٪ (وزن / حجم) ، مرشح 0.2 مم معقم
    ببلازما الدجاجكوكاليكو بيولوجيز30-0300-5 لترإعادة الترطيب في الماء المعقم ، جهاز الطرد المركزي عند 2500 × جم 30 دقيقة عند 4 درجات ؛ C ، تجميد سريع في النيتروجين السائل وتخزينه في  -80 درجة مئوية.
    الثرومبين ، موضعي (بقري)PfizerThrombin-JMIسريعة للتجميد في النيتروجين السائل عند 1,000 وحدة دولية / مل في المادة المخففة المقدمة وتخزينها عند -80 درجة مئوية. استخدم عند 250 وحدة / مل.
    نظام الأسطوانة الخلويةBellco BiotechSciERA
    حاضنة الأسطوانةفورماموديل 3956
    N21-MAXThermoFisher ScientificAR008
    القلم / البكتيريا العقدية (100X)ThermoFisherScientific 15140122
    200 ملي من الجلوتامينThermoFisher Scientific25030081
    الجلوكوزThermoFisher Scientific15023-02125٪ (وزن / حجم) محلول ، فلتر 0.2 مم معقم
    Neurobasal AThermoFisher Scientific10888-022   ؛الوسط الكامل: 48 مل Neurobasal A ، 1 مل N21-MAX ، 0.625 مل 200 ملي جلوتامين ، 0.180 مل 25٪ جلوكوز ، 0.250 مل 100x قلم / بكتيريا.
    تغليف الجيل الثالث من الفيروسات العدسيةLife TechnologiesK4975-00
    159 K مرشحات الطرد المركزي المقطوعة (Centricon)EMD Millipore
    نظام استنساخ الفيروسات العدسية (InFusion) Clonetech
    Plasmids 30323 ، 50856 ، 51279
    (NeuO)تقنيات الخلايا الجذعية1801قم بإذابة الثلج مرة واحدة والتجميد السريع في 4 ميكرو ؛ L aliquots. يخزن في -20 درجة ؛ C
    المجهر المقلوبأوليمبوسIX83
    أهداف المجهرأوليمبوسالهواء: 4X ، 20 ؛ الزيت: 40X ، 60X ،
    الغزل نظام متحد البؤرYokagawaCSU22
    مجهر EMCCD كاميراالقياسات الضوئيةCascade II
    خطي مشفر (x ، y) ، بيزو z المرحلة العلوية المسطحةASI
    الليزر المجهري والتكاملابتكارات التصوير
    HEK293T الخلايامجموعة الثقافة من النوع الأمريكيCRL-3216
    البلازمين البشريسيجما ألدريتشP18670.002 وحدة / مل في 0.1٪ ألبومين مصل البقر (مرشح 0.2 مم معقم) ، تجميد سريع في النيتروجين السائل وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
    الآس أجهزة ACE مقاس 1.5 سم و 1 مم ، مشابك زنبركية إزالة الحواف ذات الرأس الدوار من Ace Hardware لوح سيليكون لاصق مقاس 5 بوصات كميات صبغة جدوى الخلايا العصبية Addgene قرص الذكي

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
    2. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
    3. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
    4. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
    5. Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
    6. Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
    7. Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
    8. Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
    9. Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).
    10. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
    11. Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
    12. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
    13. He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
    14. Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
    15. Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
    16. Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609(2013).
    17. Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
    18. Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
    19. Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
    20. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
    21. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556(2011).
    22. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
    23. Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27(2010).
    24. Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89(2015).
    25. Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
    26. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
    27. Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
    28. Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
    29. Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
    30. Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10(2011).
    31. Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995(2014).
    32. Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6(2015).
    33. Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Brain Slice CultureRoller Tube MethodPhotoetched CoverslipsFluorescence ImagingViral Vector ExpressionNeuronal Vital DyeConfocal MicroscopyHippocampal SlicesLong term CultureEnclosed System

    Related Articles