يصف لنا هنا أسلوب الذي يجمع بين الطفرات ينقول مع التسلسل الفائق لتحديد وتقدير حجم ينقول ليبتوسبيرال طفرات في الأنسجة بعد تحديا الهامستر. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لطفرات الشاشة للبقاء على قيد الحياة، ونشر في الحيوانات، ويمكن تطبيقها أيضا على الدراسات في المختبر .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التسلسل الفائق موازية "قياس اللياقة البدنية" الإصابة إينتيروجانس Leptospira ينقول الإدراج طفرات خلال الذهبي السوري الهامستر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذه المخطوطة، يصف لنا ينقول التسلسل (Tn-Seq) تقنية لتحديد وتقدير حجم Leptospira إينتيروجانس طفرات غيرت في اللياقة البدنية خلال عدوى الهامستر السوري الذهبي. تينيسي-Seq يجمع بين الطفرات ينقول عشوائي مع قوة تكنولوجيا التسلسل الفائق. وتحدي الحيوانات مع مجموعة من ينقول طفرات (تجمع الإدخال)، متبوعاً بحصاد الدم والأنسجة بضعة أيام في وقت لاحق لتحديد وقياس عدد طفرات في كل جهاز (مجمعات الإنتاج). تتم مقارنة في تجمعات الإخراج إلى تجمع الإدخال لتقييم اللياقة في فيفو كل متحولة. ويتيح هذا النهج فحص مجموعة كبيرة من طفرات في عدد محدود من الحيوانات. مع تعديلات طفيفة، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول مع أي نموذج من نماذج حيوانية لداء البريميات، وخزان المضيف نماذج مثل الفئران، ونماذج الإصابة الحادة مثل الهامستر، فضلا عن الدراسات في المختبر . تينيسي-Seq يوفر أداة قوية للشاشة لطفرات بعيوب اللياقة البدنية في الجسم الحي وفي المختبر .
المقدمة
من الصعب تحديد الجينات الفوعة لبعض أنواع البكتيريا، مثل Leptospira spp.، بسبب العدد المحدود من الأدوات الجينية المتاحة. أحد النهج استخداماً هو إنشاء مجموعة من طفرات من الطفرات العشوائية ينقول متبوعاً بتحديد موقع الإدراج في كل متحولة واختبار الفوعة طفرات ينقول الفردية في نموذج حيوان. وهذا النهج هو مضيعة للوقت ومكلفة، ويتطلب عدد كبير من الحيوانات.
عندما الطفرات العشوائية وضعت أولاً لمسببات المرض Leptospira إينتيروجانس، حددت الجينات المعنية بضراوة عن طريق اختبار طفرات الفردية في نموذج حيوان1. واختيرت طفرات استناداً إلى معايير مثل أدوارها المحتملة في الإشارات أو حركية أو الغشاء الخارجي المتوقعة أو موقع ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تنبيه: يجب معالجة سلالات ممرضة من Leptospira spp. تحت إجراءات الاحتواء 2 مستوى السلامة الأحيائية (BSL-2). يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية). ثانيا فئة السلامة الأحيائية مجلس الوزراء يجب أن يستخدم لجميع المعالجات من الممرضة Leptospira spp.
1-إنشاء ينقول مكتبة متحولة15
-
نقل ينقول إلى spp Leptospira . بتصريف (رقم 1)
- تطعيم كمية من ثقافة المرحلة الأسية spp المسببة للأمراض في. Leptospira الموافق 107 الخلايا إلى 10 مل من الينغاوسين-مكولوغ-جونسون-هاريس متو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إنشاء مكتبة طفرات ينقول في إينتيروجانس L. بالاقتران يتطلب وحدة ترشيح، كما هو مبين في الشكل 1. أننا تعافي ترانسكونجوجانتس 100-200 من كل التزاوج.
يتم تحديد موقع الإدراج ينقول في كل متحولة حسب تسلسل المنتج بكر ولده بكر شبه عشوائي يستهدف نهاية ينقول والمضيفة المجاورة تسلسل15 (الشكل 2A). ويرد مثال على نتائج PCR شبه عشوائي في
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على الرغم من أن يتم عرض النتائج من لدينا تجربة رائدة لتحدي إينترابيريتونيلي مع 42 إينتيروجانس L. طفرات الهامستر17، ونتوقع أن تجمعات أكبر من طفرات يمكن أن يكون صاحبها ما يليها تينيسي لأن تواتر ترانسكونجوجانتس منخفضة (100-200 ترانسكونجوجانتس/التزاوج)، ماتينجس عدة ضرورية لإنشاء عدد كاف من طفرات كبيرة Tn Seq التجارب. الحفاظ على عدد كبير من طفرات في الثقافات السائل يعرض التحديات اللوجستية التي يجب معالجتها. يمكن المحتضنة الثقافات في لوحات عميقة 96-جيدا. يمكن رصد كثافة الثقافة بقراءات الكثافة ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
أيد هذا العمل على "جائزة الجدارة شؤون قدامى المحاربين" (إلى D.A.H.)، و "المعهد الوطني للصحة" منح R01 منظمة العفو الدولية 034431 (D.A.H.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كبريتات كاناميسين من Streptomyces kanamyceticus< / em> | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| 2،6-diaminopimelic acid | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 المجهر مع مكثف المجال | المظلم Zeiss | 490950-001-000 | |
| طقم DNeasy للدم والأنسجة | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR طقم تنقية | Qiagen | 28104/28106 | |
| موديل 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2.5 "كوب قرن | فيشر Scientific | FB-4625 | |
| حبة Ruptor 24 | أومني إنترناشيونال | 19-010 | الخطوة 3.1.2.4 |
| المحطة ديوكسي نوكليوتيديل ترانسفيراز | Promega | M828C | |
| ماستر ميكس Phusion | Thermo Scientific | F531 | تحضير المكتبات الجينومية ، الخطوة 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011 / K9012 | تحديد موقع إدخال الينقولات ، الخطوة 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix / USBProducts | 77112 | |
| T100 Thermal cycler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 مقياس الفلور | Invitrogen | Q32866 | الخطوة 3.6. |
| كيوبيت dsDNA HS الفحص مجموعة | Invitrogen | Q32851 / Q32854 | الخطوة 3.6. |
| حياة أنابيب فحص | Qubit Q32856 | الخطوة 3.6. | |
| PBS درجة الحموضة 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| مشرط يمكن التخلص منه No10 | Feather | 2975 # 10 | |
| بلاستيك K2< / sub> أنابيب EDTA 2 مل حقنة | vacutainer | 367841 | |
| U-100 مع 26G x & frac12 ؛ ” إبرة | BD vacutainer | 329652 | تحدي IP ، الخطوة 2.2.1. |
| 3 مل من محقنة طرف Luer-Lok | BD vacutainer | 309657 | ثقب القلب ، الخطوة 2.4.2. |
| 25G X 5/8 "إبرة | BD فراغ | 305901 | القلب ، الخطوة 2.4.2. |
| قاعدة زجاجية ممزجة مقاس 25 مم مع سدادة | EMD Millipore | XX1002502 | نظام وحدة الترشيح ، الخطوة 1.1.7. |
| 25 مم الألومنيوم الربيع المشبك | EMD Millipore | XX1002503 | نظام وحدة الترشيح ، الخطوة 1.1.7. |
| 15 مل قمع زجاجي بوروسيلكات | EMD Millipore | XX1002514 | نظام وحدة الترشيح ، الخطوة 1.1.7. |
| قارورة Erlenmeyer ذات الذراع الجانبي سعة 125 مل | EMD Millipore | XX1002505 | نظام وحدة الترشيح ، الخطوة 1.1.7. |
| مرشح الأسيتات والسليلوز VVPP (حجم المسام 0.1 مم ؛ القطر 25 مم) | EMD Millipore | VVLP02500 |
المراجع
- Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
- Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
