مقالة منهجية

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

DOI:

10.3791/56446

⸱

أكتوبر 12, 2017

 ,  ,  , 
1Cell, Developmental, and Regenerative Biology Department, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Microscopy Core, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لجبل كاملة الفلورة والمستندة إلى الصور التحليل الحجمي الكمية المرحلة المبكرة الماوس الأجنة. أننا نقدم هذا الأسلوب كنهج قوية كمياً ونوعيا تقييم هياكل القلب خلال التنمية، واقترح أنه قد يكون على نطاق واسع التكيف مع أنظمة أخرى للجهاز.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قد ساهم باستخدام تقنيات التصوير النهوض من أي وقت مضى على نطاق واسع فهمنا المتزايد من التنمية الجنينية. غرس ما قبل التنمية و organogenesis هما مجالين من مجالات البحوث التي استفادت كثيرا من أوجه التقدم هذه، نظراً للجودة العالية للبيانات التي يمكن الحصول عليها مباشرة من التصوير قبل غرس الأجنة أو السابقين فيفو الأجهزة. في حين قبل غرس الأجنة قد أسفرت عن البيانات مع خاصة عالية الدقة المكانية، كانت المراحل اللاحقة أقل قابلية لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد. الحصول على بيانات عالية الجودة 3D أو الحجمي لهياكل الجنينية المعروفة في تركيبة مع تعيين مصير أو تتبع السلالة الجينية ستسمح بإجراء تحليل أكثر شمولاً للأحداث مورفوجينيتيك التي تجري أثناء امبريوجينيسيس.

ويصف هذا البروتوكول نهجاً الفلورة الجامع-جبل يسمح لوضع العلامات، والتصور، والتقدير الكمي للسكان خلية السلف داخل الهلال القلب النامية، تشكل بنية أساسية أثناء تطوير القلب. ويهدف النهج المتبع في مثل هذه طريقة التي يمكن الحصول على كل المعلومات على مستوى الخلايا والأنسجة. باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]، ومعالجة الصور، يسمح هذا البروتوكول للتعمير المكاني ثلاثي الأبعاد الهلال القلب، مما يوفر القدرة على تحليل التعريب وتنظيم السكان السلف محددة خلال هذه المرحلة الحرجة من قلب التنمية. الأهم من ذلك، يتيح استخدام الأجسام المضادة للإشارة لإخفاء المتعاقبة للهلال القلب والقياسات الكمية اللاحقة من المناطق داخل الهلال. هذا البروتوكول لن تمكن فقط دراسة تفصيلية للتنمية القلب في وقت مبكر، ولكن مع التعديلات يجب أن تنطبق على معظم أنظمة الجهاز في جاسترولا إلى مرحلة سميط المبكر الماوس الجنين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسة organogenesis طويلة تعتمد على مراقبة الأحداث مورفوجينيتيك في الجنين النامي. كثيرا ما تعتمد هذه الدراسات على استخدام الأصباغ الفلورية أو النسب تتبع الصحفيين في تركيبة مع تصنيف السكان إشارة محددة. 1 بمقارنة الأوضاع النسبية لهذه التسميات، يمكن استخلاصها المعلومات على المنشأ أو حركة، أو المساهمة في نهاية المطاف للسكان لمصلحة. زرع ومصير تعيين تجارب استخدام معالم المورفولوجية أو الحقن بالأصباغ في الأنساب غير متحركة لتحديد نقطة البداية للخلايا ذات الاهتمام، والتي يتم فحص ثم لمساهمة الجنين نمواً. 2 , 3 , 4 , 5 استخدام التجارب الجينية النسب-تتبع نفس المفهوم مع الآليلات مراسل المعالم التي تستخدم لتسمية الخلية السكان دون التلاعب التجريبية. المفتاح لهذه النهج هو القدرة على تحديد، مع عالية الدقة المكانية والمواقع التجريبية والعلامات المرجعية. حققت تقدما بارزا في التنمية قبل غرس هذه النهج و explant الدراسات أورجانوجينيسيس. 6 , 7 , 8 , 9

وكانت الأحداث التنموية التي تكمن وراء morphogenesis القلب وصفاً جيدا يتزايد في السنوات الأخيرة. 10 من الاكتشافات الكبرى في هذا المجال من البحوث هو وصف لعدد من السكان السلف التي يمكن تمييزها بالتعبير عن علامات فريدة من نوعها. 11 تشمل هؤلاء السكان الأولى والثانية حقول القلب (فهف وأفران الموجات الدقيقة)، التي موجودة داخل الهلال القلب في الجانب الأمامي للجنين في اليوم الجنينية (ه) 8.25 التنمية الماوس. 12 كثيرا ما يتم فحص هؤلاء السكان من خلال مزيج من واسع المجال المجهري، مما يوفر معلومات على مستوى الأنسجة، وتقطيع المسلسل مع فحوصات الفلورة، الذي يوفر دقة عالية الخلوية ولكن فقط المعلومات المكانية ثنائي الأبعاد. 13 هكذا، بينما تقدمت هذه الدراسات إلى حد كبير فهمنا للتنمية القلب، والأساليب المتاحة محدودة في عمق التحليل الكمي من morphogenesis خلال هذه المراحل، خلق الحاجة إلى اتباع نهج لدراسة منظمة لهؤلاء السكان على مستوى كل الكائنات.

الأخيرة التقدم في [كنفوكل] مجهرية وتحليل الصور الثلاثية الأبعاد يسمح بإعادة البناء حسابي عالية الاستبانة والفائق للخلايا والهياكل في الموقع بسهولة نسبية، يمهد الطريق لدراسات تفصيلية لمجمع الهياكل الخلوية. 14 مع زيادة الطاقة الحاسوبية وتطوير خوارزميات إدارة البيانات الكبيرة، على حد سواء اللازمة للتعامل مع الزيادة الهائلة الحجم لتصوير مجموعات البيانات، التحليلات يمكن الآن أن تكون مؤتمتة بالكامل. 15 التحليل الآلي للتصوير من مجموعات البيانات قد تستفيد من غير منحازة، ولكن فقط موثوقة بقدر جودة dataset المدخلات؛ ثم، من الضروري أن تستخدم أفضل الممارسات خلال اقتناء وتجهيز الصور قبل لضمان أعلى مستوى من الجودة، تحليل غير متحيزة. 16 البروتوكولات يمكن أن تكون مؤتمتة بالكامل ومشترك لإمكانية تكرار نتائج، والخوارزميات المستخدمة من قبل البرمجيات المسجلة الملكية متاحة من خلال المكتبات لاستخدامها من قبل العلماء الذين لديهم إلمام بالملكية الحديثة أو مفتوحة المصدر أدوات المطور. 17

ويوضح البروتوكول التالي الخطوات اللازمة لإجراء مثل هذا التحليل على نموذج محدد واحد ل organogenesis، تشكيل الهلال القلب أثناء تطوير قلب. على وجه التحديد، يصف هذا البروتوكول كيفية (1) الحصاد وتشريح الأجنة مرحلة الهلال القلب، (2) إجراء جبل كاملة الفلورة للمرجع (Nkx2-5) والتجريبية علامات (Foxa2Cre:YFP،من1819)، (3) إعداد وصورة الأجنة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]، وأخيراً (4) تحليل وتحديد حجم الصور الناتجة باستخدام نهج ثلاثي الأبعاد المتقدم. بينما يستخدم في الهلال القلب كمثال هنا، مع إدخال التعديلات المناسبة، قد تستخدم هذا البروتوكول لتحليل الأنساب متعددة في جاسترولا للأجنة مرحلة سميط في وقت مبكر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها لجنة الاستخدام في "مدرسة الطب آيكان" في جبل سيناء ورعاية الحيوان المؤسسية.

1-حصاد ومعالجة الأجنة مرحلة الهلال القلب

  1. رفيقه ماوس الإناث خصبة مع عشيق خصوبة الذكور.
    2. التوصيل
  2. الاختيار لوجود الجماع المهبلي استخدام مسبار كليلة أو الملقط. ظهر اليوم للكشف عن التوصيل يعتبر الجنينية اليوم (ﻫ) 0.5 (انظر الشكل 1A لكامل الفترة الزمنية)-
    ملاحظة: المقابس يجب التحقق في الصباح، كما أنها تفقد طوال اليوم-
  3. صباح اليوم ال 8 (E8.25)، يوم التضحية السد الحوامل باستنشاق أول أكسيد الكربون 2، أو وفقا للوائح المحلية والمؤسسية-
    ملاحظة: التوقيت الدقيق يمكن أن سلالة تعتمد وينبغي أن يحدده مورفولوجيا تجريبيا.
    4. رذاذ
  4. البطن للماوس مع الإيثانول 70% تنظيف المنطقة وتقليل سفك. كشف الأحشاء عن طريق إجراء شق البطن من خلال الجلد وجدار الجسم.
  5. موقع الرحم وإزالة الرحم كامل القرن الأفريقي بعناية من الحيوان. ابدأ بالقطع فوق قناة واحدة، تقليم الدهون الموجودة خارج الرحم أثناء الانتقال إلى نهاية عنق الرحم. قطع طريق عنق الرحم، وتستمر إلى نهاية العلوي من قناة أخرى، قطع للإفراج عن كامل الرحم.
    6. صحن
  6. مكان الرحم في 10 سم مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4) ليغسل الدم الزائد. دون تشريح الرحم بقطع ميسوميتريوم بين كل ديسيدووم، الذي يحتوي على الأجنة. نقل الأجنة إلى طبق 6 سم مع برنامج تلفزيوني جديد.
  7. تحت مجهر تشريح، استخدام الملقط غرامة (#5) لإزالة أنسجة الرحم بعيداً عن الأنسجة ديسيدوال.
  8. استخدام الملقط، شريحة بعناية غيض نصف الجنينية ديسيدووم للكشف عن الجنين. قرصه ديسيدووم دفع الجنين للخارج وعناية سحب الجنين.
  9. تشريح الأنسجة اكسترامبريونيك بعيداً بقدر الإمكان دون إلحاق الضرر مورفولوجية الجنين ( الشكل 1B).
  10. استخدام ماصة نقل لوضع الأجنة في أنبوب 1.5 مل مع برنامج تلفزيوني جديد ثم ضع على الجليد. كرر 1.7-1.9 للأجنة المتبقية قبل المتابعة.
  11. أسبيراتي برنامج تلفزيوني وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. نضح PBS.
    ملاحظة: حاول إزالة برنامج تلفزيوني قدر ممكن دون إلحاق الضرر بها أو تجفيف الأجنة. ينصح الإزالة اليدوية للحلول في جميع الخطوات لتجنب فقدان الأجنة.
    12. بارافورمالدهيد
  12. الأجنة فيكس مع 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني عن ح 1 في الرايت
    ملاحظة: يمكن أن تكون ثابتة الأجنة بين عشية وضحاها (O/N) في 4 ° C.
  13. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. تبقى الأجنة في 4 درجات مئوية حتى على استعداد للمضي قدما مع الفلورة.
    ملاحظة: نقطة الإيقاف المؤقت. الأجنة ويمكن تخزينها بأمان في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع.

2. Staining الفلورة

ملاحظة: يمكن تعديل شروط الحضانة أدناه لاستيعاب جداول مختلفة. يوصي باستخدام لطيف الهز أو هزاز لجميع الخطوات حضانة طويلة.

  1. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت حظر (صابونين 0.5%، 1% البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني).
  2. احتضان على الأقل 4 ح في الرايت يمكن أيضا أن يتم ذلك س/ن 4 ° C.
    3. إزالة المخزن المؤقت حظر
  3. وإضافة خليط جسم الابتدائي المخفف في المخزن المؤقت لحظر. احتضان س/ن في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: انظر مواد القسم لوصف للأجسام المضادة المستخدمة واقترح تخفيف. وينبغي تحديد تخفيف جسم تجريبيا. استخدام Nkx2-5 كمرجع وصمة عار للهلال القلب ينصح، وهي الصورة الرئيسية إلى المصب تجزئة وتحليل الخطوات.
  4. إزالة الأجسام المضادة الأولية بتطلع.
  5. الغسيل 3 مرات لكل مع 0.1% 1 ح تريتون في برنامج تلفزيوني.
  6. إزالة المياه والصرف الصحي، وإضافة مزيج الأجسام المضادة الثانوية المخفف في المخزن المؤقت لحظر. احتضانها ح 3 في الرايت يمكن أيضا أن يتم ذلك س/ن 4 ° C.
  7. الغسيل 3 مرات لكل مع 0.1% 1 ح تريتون في برنامج تلفزيوني. يمكن أيضا أن يتم ذلك س/ن 4 ° C.
    8. كونتيرستين
  8. مع 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) في برنامج تلفزيوني للحد الأدنى 10
    ملاحظة: هذا كونتيرستين يمكن أن يؤديها في وقت واحد مع الجسم المضاد الثانوي.
  9. الغسيل 2 مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.1% تريتون في برنامج تلفزيوني.
  10. ببطء تعليق الأجنة في وسائل الإعلام تتلاشى لمكافحة تصاعد (2% w/v البروبيل – يبيغاللوكاتيشين (nPG)، 90% والغليسيرول، 1 x PBS؛ انظر قسم المواد لمزيد من التفاصيل). السماح لحجته على الأقل 1 ساعة قبل التركيب. بلطف نفض الغبار أنبوب دورياً لمساعدة الأجنة إسقاط في حل تتلاشى المضادة.
    ملاحظة: نقطة الإيقاف المؤقت. ويمكن تخزين الأجنة لعدة أيام في حل تتلاشى المضادة حتى جاهزة للتحميل وصورة-

3. تصاعد الأجنة للفحص المجهري

المجهر
  1. تحضير الشرائح للتركيب باستخدام أما شريط مزدوج-عصا أو الفواصل سيليكون. إذا كان استخدام الشريط المزدوج-عصا، جعل المكدسات المتوازية اثنين من 5-6 طبقات حوالي 15-20 ملم وبصرف النظر. هذا وسوف اترك مساحة كافية لوضع الأجنة وتأمين ساترة ( الشكل 1).
    2. ضع
  2. قطره 15 ميليلتر تتلاشى المضادة على الشريحة، بين الشريط المزدوج-عصا. نقل الأجنة واحد بعناية إلى الشريحة-
    ملاحظة: يمكن وضع الجنين واحد أو أكثر على شريحة. ومع ذلك، الخطوات اللاحقة التوجه أكثر صعوبة مع أجنة متعددة، والتصوير فترات طويلة قد تؤدي إلى تبييض الصورة.
  3. تحت مجهر تشريح باستخدام الملقط الجميلة، وضع الجنين أن تواجه الجانب الأمامي بعيداً عن الشريحة مع محور الجسم تمشيا مع المحور الطويل للشريحة. انظر الشكل 1 لتخطيطي للإعداد المتزايدة.
    4. ضع
  4. بعناية ساترة على العينة يستريح جانب واحد على مكدس واحد من الشريط المزدوج-عصا واستخدام الملقط لأقل ساترة بلطف حتى أنها تجري اتصالات أخرى الشريط.
    ملاحظة: الخطوات 3.3 و 3.4 أمرا حاسما لضمان التوجيه الصحيح للجنين للتصوير. عن طريق خفض ساترة على طول الخلفي للاتجاه الأمامي، لا ينبغي دحر الجنين ومنطقة الهلال القلب سيبقى موجها بعيداً عن الشريحة، الذي يعتبر مثاليا لتصوير المعني مجهر مقلوب.
  5. استخدام ماصة إضافة الإضافية تتلاشى المضادة بين الشرائح وساترة للحفاظ العينة من الزوال أثناء التخزين/تصوير-

4. [كنفوكل] تصوير

  1. الحصول على الصور باستخدام أعلى تكبير الهدف الذي يسمح لمنطقة الهلال كله القلب لالتقاطها في حقل واحد لعرض. استخدام معدلات أخذ العينات نايكست لتحديد أبعاد فوكسل x-y-z. وسوف يكون معظم الشركات المصنعة للمجهر " تحسين " الزر للتأكد من أخذ العينات نايكست.
    ملاحظة: صبغة Nkx2-5 مفيد هنا، كما أنها سوف تحدد منطقة الهلال القلب بأكملها. Z-خطوة أصغر حجماً (الإفراط) سوف تعطي أفضل 3D النمذجة النتائج لكن قد يؤدي إلى أوقات طويلة اقتناء و/أو تبييض لبعض العينات.
    2. إعداد
  2. التصوير المعلمات باستخدام الممارسات الأفضل التصوير القياسية. إلا وهي استخدام أقل كثافة الليزر ممكن لتحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء جيدة لكل فلوروفوري واختر مكسب وإزاحة المستويات التي تدر دينامية واسعة نطاق دون تشبع الإشارة-
    ملاحظة: تكون متسقة مع التصوير معلمات بين العينات التي سيتم مقارنة مباشرة. وهذا مهم بشكل خاص المصب 3D التحليل والقياس الكمي-

5. صورة التحليل والنمذجة 3D الكمية

ملاحظة: لهذا البروتوكول، تم تحليل الصور باستخدام حزمة البرامج إيماريس. قد يكون من الممكن استخدام حزم البديلة تحليل مماثل. ويغطي الوصف أدناه تحليل خط الأنابيب لقناة إشارة (أي Nkx2-5) وقناة واحدة تجريبية (أي يفب). يمكن تحليل قنوات إضافية من خلال تكرار هذه الخطوات. قدمت dataset مثال التي يمكن استخدامها لإجراء نسخ متماثل التحليل الوارد أدناه.

تحميل مجموعات بيانات الصورة الخام إلى عرض الساحة إيماريس
  1. وفتح ملف للجنين المطلوب في رأي تفوق. يجب تحميل البيانات في طريقة عرض ثلاثي الأبعاد في وضع خطة التأمين الطبي (كحد أقصى). فتح نافذة "ضبط العرض" وحدد القناة مرجع فقط.
  2. ضبط عتبة الصورة إذا لزم الأمر لرؤية أفضل. لهذا التحليل، ضبط غاما إذا كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة جداً لتجزئة-
    ملاحظة: إذا كان إجراء التصحيحات أشعة غاما، وتعديلات غير الخطية، لا يمكن استخدام الصور المعدلة لكثافة القياسات أو المقارنات. في هذه المرحلة يمكنك إجراء مزيد من المعالجة التمهيدية الصورة (أي تصويبات الإضاءة أو التمويه الضبابي أو التصفية الأخرى)، إذا كانت نسبة الإشارة إلى الضجيج الخاصة بك غير مرضية. إذا اخترت القيام بالمعالجة التمهيدية، يجب إجراء نفس الخطوات السابقة التجهيز لكافة الصور في الخاص بك dataset.
  3. إنشاء سطح جديد للقناة مرجع باستخدام خوارزمية السطحية الحوار-
    1. حدد " جزء فقط من "المنطقة مصلحة" " خانة الاختيار-
    2. ضبط منطقة المربع المحيط بحيث أنه يحتوي على المنطقة للفائدة (العائد على الاستثمار، أي منطقة الهلال القلب) كما رسمتها وصمة عار المرجعية.
    3. حدد القناة مرجع من القائمة المنسدلة قناة المصدر. الإعداد الافتراضي لتجانس (مساوياً لحجم فوكسل z) يكفي عادة ولكن قد تتطلب التحسين التجريبية. لهذا التحليل، استخدام تجانس يساوي نصف z فوكسل-الحجم-
    4. العتبة القيام بكثافة مطلقة. للتأكد من أن السطح لا يتعدى إشارة القناة، ضبط الحد الأدنى لاستخدام المنزلقات.
      ملاحظة: بعض الصور حيث يمكنك تحديد الخلايا بسهولة، يمكنك تضمين " تقسيم لمس الأجسام " الخوارزمية، وكذلك فصل الإشارات الخلفية.
    5. تصفية الكائنات بعدد فوكسل أو وحدة التخزين، ورفض الكائنات الخلفية (صغيرة أو تم العثور عليها في مناطق خارج منطقة Nkx2-5) التي يمكن إنشاؤها الخوارزمية. إنهاء الخوارزمية.
  4. باستخدام السطح الذي تم إنشاؤه حديثا، وإنشاء قناة مقنعين للقناة التجريبية.
    1. مع surface(s) المحددة، اختر " قناع Sel... ͟ " الدالة من إطار تحرير-
    2. حدد القناة التجريبية للفائدة (أي يفب). تأكد من أن " تكرار القناة قبل تطبيق قناع " يتم تحديد خانة الاختيار.
  5. نافذة "في تعديل العرض" قم بتحديد القناة ملثمين فقط. إنشاء سطح جديد للقناة ملثمين باتباع خطوات 5.3-5.3.5.
    ملاحظة: عند هذه النقطة قد يكون من المفيد ضبط مظهر كل قناع لتسهيل تصور النموذج الثلاثي الأبعاد: حدد كل سطح، وحدد علامة التبويب لون ضبط اللون الأساسي والشفافية حسب الحاجة. عدم دمج الألوان السطحية عندما تتداخل.
  6. للحصول على البيانات الحجمي، ومع كل السطح المحدد حدد علامة التبويب الإحصائيات. في " التفصيلية " دون علامة التبويب، اختر " "متوسط القيم" " من القائمة المنسدلة. ويمكن الاطلاع على الحجم الإجمالي للسطح في مجموع العمود من الجدول الذي تم إنشاؤه-
    ملاحظة: إذا كان السطح الذي تم إنشاؤه يحتوي على شظايا الخاطئة (أي الأجزاء التي من الإشارات الخلفية ليست مستبعدة خلال تجزئة أو المناطق متقطع من السطح الرئيسي)، قد تكون ضرورية لحساب إجمالي حجم يدوياً، أو تصفية السطوح بحجم أو عدد من فوكسيلس وضمان إدراج شرائح إشارة فقط في الحساب. ويمكن الاطلاع على وحدة التخزين لكل جزء من السطح عن طريق تحديد " "كافة القيم" " من القائمة المنسدلة. تحديد كل قيمة سيجعل المنطقة المقابلة تظهر الصفراء، مما يساعد في تحديد القيم لاستبعاد-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نوعية البيانات الختامية والتحليل يتوقف إلى حد كبير على (1) السلامة ومورفولوجيا تشريح الأجنة و (2) استخدام الأجسام المضادة عالية الدقة (3) الإعداد السليم للتصوير المعلمات. سوف إرباك عملية توليد السطحية وتعوق التحليل الكمي الأجنة معطوب. أمثلة للأجنة بشكل صحيح تشريح ونظموا مبينة في الشكل 2. يمكن أن يكون تشريح الأجنة كذلك بإزالة كيس الصفار، الذي كثيرا ما سيتم ربط الأجسام المضادة غير على وجه التحديد. ومع ذلك، إزالة كيس ألمح سيجعل الأجنة أقل متانة، ولذلك ينبغي توخي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول أعلاه توضح استراتيجية من أجل الحصول على بيانات كمية من الصور عالية الجودة جبل كاملة الفلورة الماوس بعد زرع الأجنة. عند القيام بشكل صحيح، يمكن استخدام البيانات الحجمي ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها من خلال هذه الخطوات للتحليل المقارن والمتعدد الجوانب لعدة مجالات ضمن الجنين. إشارة السطحية إخفاء النهج المذكور بشكل خاص عند التحقيق في خلية رواية السكان بالمقارنة مع الهياكل مرجعية راسخة.

أننا نعتقد أن هذا النهج يوفر ميزة واضحة على النهج القائمة. جبل كاملة الفلورة مع التصوير واسع المجال يم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة/NHLBI R56 HL128646 وصحة الطفل مينديتش ومعهد التنمية (متشدي) في إيسمس (بدون تاريخ). E.B. معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة/NIDCR منحة T32 HD075735. أجرى التحليل المجهري والصورة في "صميم مجهرية" في "مدرسة الطب آيكان" في جبل سيناء، التي يدعمها معهد السرطان تيش في جبل سيناء P30 CA196521 – منحة دعم مركز السرطان في الجزء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مسبار حادRobozRS-9580
ملقطRobozRS-8100
ملقط ناعمRobozRS-5015
مقص تشريحRobozRS-5912
SaponinSigma Aldrich84510
مصل بقري ألبومينSigma AldrichA8022
TritonRPIA4490
Goat anti-Nkx2-5Santa Cruz Biotechsc-8697مستخدم في 1: 100-1: 500
دجاج مضاد ل GFPabcamab13970مستخدم في 1: 500
أرنب مضاد للجزيرة 1abcamab109517مستخدم في 1: 100
أرنب مضاد ل Hcn4MilliporeAB5808مستخدم في 1: 100
488 مضاد للدجاججاكسون البحوث المناعية703-546-155أعيد تشكيلها في الماء وتخزينها في -20 درجة ؛ C في التركيز النهائي ل 50٪ من الجلسرين. تستخدم في 1: 500.
555 مضاد للماعزThermo Fisher ScientificA21432يستخدم في 1: 500
647 مضاد للأرانبJackson Immunoresearch711-606-152أعيد تشكيله في الماء وتخزينه عند -20 درجة ؛ C في التركيز النهائي ل 50٪ من الجلسرين. تستخدم في 1: 500.
DAPISigma AldrichD9542
n-Propyl gallateSigma Aldrich2370حل المخزون هو 20٪ وزن / حجم في DMSO. تم إعداد محلول العمل عن طريق خلط جزء واحد 10x PBS مع 9 أجزاء 100٪ جلسرين وإضافة محلول مخزون 0.1 جزء ببطء.
شرائح الفحص المجهري Superfrost PlusVWR Scientific48311-703
22x22 مم أغطيةVWR Scientific48366-227
Imaris 8.4.1Bitplane

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
  2. Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
  3. Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
  4. Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
  5. Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
  6. Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463(2016).
  7. Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654(2016).
  8. Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
  9. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
  10. Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
  11. Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
  12. Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
  13. Cai, C. -L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
  14. Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
  15. Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
  16. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
  17. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
  18. Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
  19. Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428(2017).
  20. Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
  21. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
  22. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
  23. Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
  24. Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة