نهج بسيط للحث على العصب الذاتية التجريبية في الفئران C57BL/6 للتقييمات الفنية ولاثيل

اعتلالات الأعصاب الطرفية يمكن أن تكون وراثية في الأصل أو المكتسبة، أما مع اعتلالات الأعصاب المكتسبة بعد أما الإقفارية الأيضية،، بريسيبيتانتس الملتهبة أو السامة. يكون من المفيد أيضا تصنف هذه الأمراض أما محواري أو ديميليناتيفي في الأصل. الأكثر شيوعاً اكتسب دملينتينغ اعتلالات الأعصاب المحيطية هي "اعتلال دملينتينغ الالتهابات الحادة" (الرابطة، المعروف أيضا بمتلازمة غيان-باريه GBS) واعتلال دملينتينغ التهاب مزمن (سبب)^{1، 2 , 3 , 4}؛ باثوجينيتيكالي على حد سواء تتسم بفعل المناعة الذاتية ضد غمد المايلين، مما تسبب في ديمييلينيشن الأعصاب المحيطية. في هذه الأمراض، وتنشيط خلايا تي عبور حاجز الدم في الأعصاب وتولد رد فعل المناعة في السندات الإذنية. يؤدي تنشيط الضامة داخل العصب ثم demyelination أما مباشرة عن طريق هجوم متجولة أو غير مباشر عن طريق وسطاء التهابات يفرزها، نتج عنه عجز السريرية مثل الشلل والخلل الحسي⁵. بينما محاور عصبية ديميليناتيد الاحتفاظ بالقدرة على أن تكون ريميليناتيد بعد ديميليناتيون، ريميليناتيون غالباً ما يتأخر أو غير مكتملة، أسفر عن قابلية محاور عصبية عارية لضرر لا يمكن إصلاحه، وهو السبب الرئيسي للدائم السريرية العجز. حاليا العلاجات الأكثر فعالية إيمونومودولاتوري، ولكن على الرغم من فعاليتها، في كثير من الحالات الانتعاش بطيء غالباً، والمرضى ~ 25% سوف تواجه العجز الوظيفية المتبقية التي تقلل إلى حد كبير على نوعية حياة^{6، 7}.

EAN هو نموذج حيوانية مستخدمة على نطاق واسع من دملينتينغ الأعصاب الطرفية التي قدمت أفكاراً قيمة في المرضية ووسيلة لتقييم العوامل العلاجية رواية⁴. يمكن أن يتسبب هذا الطراز في الأنواع المختلفة مثل الأرانب، الجرذان، الفئران وخنازير غينيا، وهو فعل التحصين مع المستضدات العصبية. ومع ذلك، في نهاية المطاف التعريفي EAN ناجحة يعتمد على استجابة مناعية مناسبة للمرض إلى حدوث. ونظرا للاختلافات الأنواع (وبينها species/سلالة) في وظيفة المناعة، قد وضعت مجموعات متعددة من المستضدات، ومأمونية بنجاح حمل EAN. من حيث الأدوات الوراثية مورين، C57BL/6 هو الأكثر استخداماً؛ ومع ذلك، الببتيد بروتين P2 التقليدية 57-81 (P2_57-81) التي ينتج عنها مرض في سلالة من الماوس سخل عرضه⁸ غير قادر على المرضية غير المشروعة مما أدى إلى عجز وظيفي في سلالة C57BL/6. لحسن الحظ، تسليم نماذج التوعية باستخدام P0_106-125 أو الببتيدات P0_180-199 ، في adjuvant جنبا إلى جنب مع حقن السعال الديكي السمية يمكن التغلب على هذا الحاجز، تمكين أدوات الجينية المتطورة التي ستستخدم في موريني EAN النموذجي.

ويرد هنا، طريقة بسيطة لاستحثاث EAN في الفئران C57BL/6. وباﻹضافة إلى ذلك، تقدم نهجاً مفصلة شاملة لتقييم العجز الوظيفي ولاثيل المرتبطة بهذا المرض. واختير P0_180–199 الببتيد⁹ تفضيل البديل_57-81 P0¹⁰. الطراز_{199 180–}P0 قد وصفت لإنتاج علامات سريرية أقل حدة بالمقارنة مع البديل_57-81 P0¹⁰فمن المرجح أن تحمل إدخال يحتمل أن الاضطرابات الوراثية الضارة، التعافي من العمليات الجراحية (مثل غرس مضخة ناضح)، وهي قابلة للمطحنة مشيه دالة اختبار⁴. ومع ذلك، الاختبارات الدالة مشيه المطحنة وغذائها البروتوكولات المذكورة هنا يمكن بسهولة تطبيق عند دراسة هذا المرض في متغير_57-81 التي يسببها P0.

كافة الإجراءات الموصوفة هنا أقرها المعهد فلوري لعلم الأعصاب والصحة العقلية (مركز الدماغ ملبورن) الحيوان لجنة الأخلاقيات واتبع "قانون الممارسة الأسترالية" "استخدام الحيوانات" للعلم الأغراض-

1-تحريض EAN

ملاحظة: EAN يمكن أن يتسبب بنجاح في الفئران C57BL/6 الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 6 8 أسابيع. البروتوكول التوجيهي يأخذ 9 أيام في المجموع. اليوم 0 يشير إلى يوم التحصين الأولى. لهذا البروتوكول، وقد أجريت الحقن تحت التخدير (راجع الخطوة 1-1-2 أدناه)-

1. "في اليوم"-1:
   1. إعداد "السم السعال الديكي" حل (انظر الجدول للمواد) 1.6 ميكروغرام/مل باستخدام الفوسفات متساوي التوتر الماوس عقيم في م 0.1 مخزنة المالحة (طن متري-برنامج تلفزيوني).
   2. أنيسثيتيزيشن مع إيسوفلوراني:
      1. ضع الماوس (C57BL/6، ذكر، 6-8 أسابيع) في قاعة أنيسثيتيزيشن وضبط تدفق الأوكسجين إلى 1 لتر/دقيقة
      2. قم بتشغيل المرذاذ isoflurane وضبطه إلى 2.5 في المائة لمراقبة التنفس وأنيسثيتيزيشن، وانتظر لمدة 2 دقيقة، أو حتى ردود الفعل الأولية (أطرافهم القرنية وهند) التي لم تعد تستجيب
   3. إزالة الماوس من قاعة أنيسثيتيزيشن وإدارة 250 ميليلتر من الحل "السمية السعال الديكي" أعلاه عن طريق حقن داخل (القائمة) استخدام 0.5 مل حقنه بإبرة 30 ^1/2 ز.
   4. تعد العدوى عن طريق الحقن للتحصين:
      1. تحضير الحل استخدام حل 2 مغ/مل من P0 الببتيد _180-199 (مع > نقاوة 98%، تسلسل S-S-K-R-G-R-قتبفلياملدهسرس) في المحلول الملحي 0.9 ٪.
      2. تحضير حل ب استخدام الحل 20 ملغ/مل من بكتريا السل (انظر الجدول للمواد) في فروند ' s كاملة adjuvant (قانون المنافسة المنصفة، تتألف من: مونولاتي مانيدي 15% + 85% من زيت البارافين و 0.5 ملغ/مل من يهتمان قتلوا والمجففة الزبدية متفطره M)-
      3. جعل العدوى النهائي للحقن، الجمع بين أجزاء متساوية الحجم من حلول A و B في الخافق حبة ومزجها في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
         ملاحظة: الحلول A و B يمكن الاحتفاظ بها كمخزون وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها شهر واحد ولكن العدوى النهائي الموحد يجب أن يكون مستعدا طازجة في يوم حقن الفأر.
2. "في اليوم" 0، إدارة 50 ميليلتر من العدوى (الإعداد المذكورة في الخطوة 1.1.4) في ماوس عن طريق حقن تحت الجلد استخدام إبرة 23 ز.
   ملاحظة: الحقن يمكن أن توضع بين ريش الكتف، أو بين أطرافهم هند وذيل على dorsum والذيلية.
3. في اليوم 1، جعل الحل "السمية السعال الديكي" 1.2 ميكروغرام/مل (في النقل المتعدد الوسائط-برنامج تلفزيوني) وإدارة 250 ميليلتر في ماوس عن طريق الحقن القائمة باستخدام 0.5 مل حقنه بإبرة 30 ^1/2 ز.
4. في 3 يوم، كرر الخطوة 1-3 أعلاه.
   ملاحظة: يمكن أن تتكون حلول الأسهم A و B والمخزنة في ˚C 4 لمدة أقصاها شهر واحد. غير أن العدوى عن طريق الحقن النهائي، أنتجت عن طريق الجمع بين الحلول الأسهم A و B، يجب أن يتم في اليوم للحقن.
5. في يوم 8، إدارة 50 ميليلتر من العدوى (الإعداد المذكورة في الخطوة 1.1.4) في ماوس عن طريق حقنه تحت الجلد (راجع الخطوة 1-2 أعلاه)، في موقع الحقن نفسها كما في الخطوة 1، 2 (لكل الحيوانات)

2-"التهديف السريرية"

1. أداء التهديف السريرية بها يوميا ابتداء من اليوم 0.
2. إعطاء كل الماوس على درجة من 0، 1، 2، 3، أو 4 وفقا لمعايير منشورة ⁴. انظر الجدول 1 للتهديف السريرية EAN.
   ملاحظة: للاتساق، ينبغي بذل مجهود نقاط الفئران في نفس الوقت يوميا بنفس الباحث.

3. السيارات "تقييم الدالة"

ملاحظة: تقييم أداء المحرك بالتوازي مع التهديف السريرية للفوج نفسه من الحيوانات. يجب أن تكون متصلاً جهاز تقييم الدالة السيارات إلى جهاز كمبيوتر أن له (انظر الجدول للمواد) تركيب جهاز تصوير دالة مشيه. من المستحسن أيضا أن جميع الفئران تقييم ينبغي أن اعتادوا على المهمة قيد التشغيل قبل التعريفي EAN. للقيام بذلك، تتم ممارسة تشغيل (تشغيل الاختبار 2 للماوس) ثلاثة أيام قبل تحريض المرض (اليوم-3)-

1. بدوره على جهاز تقييم وظيفة الحركة والتبديل على زر الضوء.
2. القفا الماوس بحزم والحبر قدميها بتخفيض على حاوية مليئة بالحبر الأحمر بينما يمسك ذيله.
   ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة لسلالة C57BL/6، ولكن يمكن تخطي إذا كان يتم استخدام سلالة ماوس مع لون معطف أبيض-
3. ضع الماوس في المقصورة المشي وتعيين سرعة المطحنة في 15 سم/س.
4. تشغيل في حلقة مفرغة وانقر " سجل " الزر لالتقاط حركة تشغيل الماوس باستخدام الدالة مشيه نظام التصوير (انظر الجدول للمواد).
استخدام جهاز ضبط وقت
5. وقياس كل تشغيل 36 s. بعد 36 ثانية، وإيقاف التسجيل ووقف حلقة مفرغة.
   ملاحظة: تعتبر الفئران التي لا يمكن إكمال بنجاح هذه المهمة قيد التشغيل لهذا الفاصل s 36 لم.
6. حفظ ملف الفيديو في مجلد معين.
7. كرر الخطوات أعلاه لكل الماوس لتقييمها. اختبار الفئران بنفس المهمة قيد التشغيل كل 3 أيام-
8. تحليل ملفات الفيديو تم تحريرها باستخدام البرمجيات لمعلمات الدالة مشيه (انظر الجدول للمواد)-
   ملاحظة: تفاصيل كيفية تحليل معلمات الحركية المختلفة تختلف بين البرامج حتى الرجاء الرجوع إلى الشركة المصنعة ' تعليمة s قبل التحليل. للحصول على أدلة النسيجي محواري وتلف المايلين عبر إيمونوهيستوتشيميستري أو المجهر الإلكتروني، الحيوان الأنسجة يمكن أن تتخذ في أي مرحلة وظيفة وظيفة الحركة التقييم اعتماداً على أهداف محددة للبحوث-

الببتيد180-199 P0 المستحث EAN C57BL/6 الفئران يؤدي إلى مرض أحادية الطور مع نقاط سريرية بداية من بعد 6 أيام ويلاحظ أول التحصين (نقطة في البوصة)، والأعلى درجة الخطورة من 25 نقطة في البوصة متبوعاً ببعض نقاط السريرية تحسن من 40 نقطة في البوصة المدة (الشكل 1)4،9. من حيث الوظيفة مشيه، الفئران تبدأ تفشل في مهمة قيد تشغيل بسيطة أقرب 6 نقطة في البوصة، ومن الفئران 35 نقطة في البوصة قد قدرة ضئيلة على إكمال حلقة مفرغة بسيطة تشغيل المهمة ولم تتحسن في تشغيل القدرة حتى على 55 نقطة في البوصة4 (الشكل 1). الفئران التي يسببها مع EAN انخفض تدريجيا في قدرتها على أداء المهمة قيد التشغيل على مر الزمن. ويلاحظ تشغيل فشل المهمة في 80% من الفئران، ولكن بالإضافة إلى هذا، مشيه أطرافهم هند الآخذة في الاتساع في حلقة مفرغة تشغيل عجز وظيفية رئيسية التي لم تحل على مدى مدة المرض4.

وهناك العديد من الميزات الرئيسية لاثيل في P0180-199 التي يسببها EAN: الأضرار التي لحقت غمد المايلين؛ إكسون الإجهاد؛ والعقدة زيادة العرض والأضرار بالهياكل بارانودال. وتكشف دراسة الأقسام شبه رقيقة مأخوذة من الأعصاب الوركي مجالات ديمييلينيشن (الشكل 2B، أسهم) مقارنة بالاعصاب الوركي من مطابقة سن ضوابط صحية (الشكل 2A). الأهم من ذلك، فمن الممكن الحصول على نسب ز من الصور التي تم التقاطها من شبه رقيقة العصب الوركي المقاطع المصورة في طاقة عالية مع الخفيفة الميكروسكوب4. ومع ذلك، صور المجهر الإلكتروني (TEM) انتقال الطاقة العالية المطلوبة لتحديد ميزات لاثيل محددة مثل ديسميليناتون، الأضرار التي لحقت لوحة المايلين، ونشدد على علامات إكسون مثل تورم المتقدرية (ديسارانجيمينت و تشويه كريستي وكريستوليسيس الجزئي أو الكلي) (2Dمنالشكل 2–). يتفق مع الأدلة ultrastructural إكسون الإجهاد (الشكل 2-2د)، نموذج EAN180-199 التي يسببها P0 أيضا يعرض الضرر محواري الحاد، تجلى هائلة مرتفعة بيتا-اميلويد السلائف تعبير البروتين (APP) في الأعصاب الوركي (الشكل 3A). وهذا لا يحترم في أنسجة مطابقة سن مراقبة صحية (الشكل 3A). تم توثيق التغييرات لاثيل في العقد وبارانوديس جيدا في باريه؛ على وجه الخصوص، البديل11،أمان12. في نموذجنا EAN مورين، نحدد أن توسيع نطاق العقد وتعطل براندي ميزات إضافية لاثيل من P0 المستحث180-199 EAN (الشكل 3B).

رقم 1: التمثيل التخطيطي لنموذج التعريفي EAN، السريرية نقاط التقييم، وقدرة تشغيل خلال EAN. () لمحة عامة عن تحريض EAN البروتوكول في الفئران C57BL/6، ابتداء من 6-8 أسابيع عمر، مع الخطط (ب) (ج) وعشرات السريرية المتوقعة طبعا أوقات التشغيل أثناء المرض (انظر المرجع4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: عرض الفئران مع EAN المايلين فقدان وتلف المايلين وعلامات الإجهاد محاور عصبية. (A) A مشرق حقل الصورة (تحت 100 X التكبير) مأخوذة من مقاطع شبه رقيقة للأعصاب الوركي من مراقبة صحية تطابق العمر. (ب) مشرق حقل الصورة (تحت 100 X التكبير) مأخوذة من مقاطع شبه رقيقة للأعصاب الوركي من الفئران التي يسببها مع EAN في 55 يوما بعد التحصين الأولى (نقطة في البوصة). وتشير إلى مناطق تفتقر إلى المايلين محاطة بمحاور عصبية رقيقة myelinated (رؤوس) ريميلينيشن؛ وهذا لم يلاحظ في الأنسجة التي تم الحصول عليها من ضوابط صحية مطابقة المسنين (انظر ألف). (ج) ممثل الميكروسكوب الإلكتروني الصورة (تحت 5,000 X التكبير) اتخذت فرومسسياتيك الأعصاب من الفريق ب إظهار المايلين الباثولوجيا (السهم مفتوحة) والإجهاد إكسون (ربط ساحة تشير إلى تورم الميتوكوندريا على 55 نقطة في البوصة). (د) صورة تيم عالية قوة (المربع في ج المحيط) الميتوكوندريا منتفخة تبين أن تدل إكسون التشديد (رؤوس الأسهم)، ولكن هذا غير موجود من ضوابط صحية تطابق العمر (البيانات لا تظهر). تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون (أ، ب)، و 500 نانومتر (ج، د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: الإجهاد إكسون والباثولوجيا العقدي سمة من سمات P0180-199 التي يسببها EAN. (أ) طائرة واحدة [كنفوكل] الصور (تحت 40 X التكبير) المتخذة من خلال الأعصاب الوركي عند 55 نقطة بالبوصة. وتظهر الأنسجة من الفئران EAN هائلة مرتفعة التعبير التطبيق المترجمة يشترك مع β-ثالثا tubulin (علامة على الخلايا العصبية) التي تشير إلى علامات الإجهاد محواري. (ب) عالية الطاقة Z-الإسقاطات (100 X التكبير) من بارانوديس ملطخة بجسم مضاد ضد كاسبر في فروع العصب الوركي. في العقد من الفئران EAN، هناك زيادة مسافة بين بارانوديس المجاورة التي تشير إلى توسيع العقدة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ملاحظتها في الفئران EAN الباثولوجيا العقدي مثل اختلال في هيكل براندي لكن تغيب من مطابقة سن ضوابط صحية. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون (A)، و 5 ميكرومتر (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: نقاط EAN السريرية النموذج.

المؤلفين قد لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا العمل.