مقالة منهجية

نهج بسيط للحث على العصب الذاتية التجريبية في الفئران C57BL/6 للتقييمات الفنية ولاثيل

9.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56455

⸱

نوفمبر 9, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neuroscience, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne

في هذه المقالة

ملخص

يوجز هذا التقرير نهج بسيط للحث على نجاح العصب الذاتية التجريبية (EAN) استخدام البروتين المايلين صفر الببتيد180-199 (P0) في تركيبة مع adjuvant فروند بالكامل والسمية السعال الديكي. نحن نقدم نموذجا متطورة قادرة على دقة تقدير مدى عجز وظيفي وأمراض الأعصاب التي تحدث في هذا EAN.

الملخص

العصب الذاتية التجريبية (EAN) نموذج تجريبي يحظى بتقدير جيد لأمراض المناعة الذاتية دملينتينغ الطرفية. فعل المرض EAN تحصين الفئران مع الببتيدات العصبية لتوجيه هجوم تحريضية تجاه مكونات الجهاز العصبي المحيطي (PNS). ومكنت التطورات الأخيرة استحثاث EAN في السطر الماوس C57BL/6 مقاومة نسبيا استخدام البروتين المايلين صفر (P0)106-125 أو الببتيدات180-199 P0 تسليمها في adjuvant جنبا إلى جنب مع حقن السم السعال الديكي. القدرة على حفز EAN في سلالة C57BL/6 يسمح باستخدام العديد من الأدوات الوراثية الموجودة على هذه الخلفية الماوس، ويسمح بالتالي دراسة إمراضية المرض متطورة والاستجواب للعمل آليا للمداواة الرواية في تركيبة مع نهج محوره وراثيا. في هذه الدراسة، ندلل على نهج بسيط لحمل EAN استخدام الببتيد180-199 P0 في الفئران C57BL/6 بنجاح. أننا أيضا مخطط بروتوكول لتقييم العجز الوظيفية التي تحدث في هذا النموذج، مصحوبا بمجموعة من الميزات لاثيل. وهكذا، هذا النموذج هو نموذج تجريبي قوية لدراسة الآلية المرضية لاعتلالات الأعصاب دملينتينغ الطرفية البشرية، وتحديد مدى فعالية العلاجات المحتملة التي تهدف إلى تشجيع إصلاح المايلين وحماية ضد تلف الأعصاب في المناعة الذاتية العصب.

المقدمة

اعتلالات الأعصاب الطرفية يمكن أن تكون وراثية في الأصل أو المكتسبة، أما مع اعتلالات الأعصاب المكتسبة بعد أما الإقفارية الأيضية،، بريسيبيتانتس الملتهبة أو السامة. يكون من المفيد أيضا تصنف هذه الأمراض أما محواري أو ديميليناتيفي في الأصل. الأكثر شيوعاً اكتسب دملينتينغ اعتلالات الأعصاب المحيطية هي "اعتلال دملينتينغ الالتهابات الحادة" (الرابطة، المعروف أيضا بمتلازمة غيان-باريه GBS) واعتلال دملينتينغ التهاب مزمن (سبب)1، 2 , 3 , 4؛ باثوجينيتيكالي على حد سواء تتسم بفعل المناعة الذاتية ضد غمد المايلين، مما تسبب في ديمييلينيشن الأعصاب المحيطية. في هذه الأمراض، وتنشيط خلايا تي عبور حاجز الدم في الأعصاب وتولد رد فعل المناعة في السندات الإذنية. يؤدي تنشيط الضامة داخل العصب ثم demyelination أما مباشرة عن طريق هجوم متجولة أو غير مباشر عن طريق وسطاء التهابات يفرزها، نتج عنه عجز السريرية مثل الشلل والخلل الحسي5. بينما محاور عصبية ديميليناتيد الاحتفاظ بالقدرة على أن تكون ريميليناتيد بعد ديميليناتيون، ريميليناتيون غالباً ما يتأخر أو غير مكتملة، أسفر عن قابلية محاور عصبية عارية لضرر لا يمكن إصلاحه، وهو السبب الرئيسي للدائم السريرية العجز. حاليا العلاجات الأكثر فعالية إيمونومودولاتوري، ولكن على الرغم من فعاليتها، في كثير من الحالات الانتعاش بطيء غالباً، والمرضى ~ 25% سوف تواجه العجز الوظيفية المتبقية التي تقلل إلى حد كبير على نوعية حياة6، 7.

EAN هو نموذج حيوانية مستخدمة على نطاق واسع من دملينتينغ الأعصاب الطرفية التي قدمت أفكاراً قيمة في المرضية ووسيلة لتقييم العوامل العلاجية رواية4. يمكن أن يتسبب هذا الطراز في الأنواع المختلفة مثل الأرانب، الجرذان، الفئران وخنازير غينيا، وهو فعل التحصين مع المستضدات العصبية. ومع ذلك، في نهاية المطاف التعريفي EAN ناجحة يعتمد على استجابة مناعية مناسبة للمرض إلى حدوث. ونظرا للاختلافات الأنواع (وبينها species/سلالة) في وظيفة المناعة، قد وضعت مجموعات متعددة من المستضدات، ومأمونية بنجاح حمل EAN. من حيث الأدوات الوراثية مورين، C57BL/6 هو الأكثر استخداماً؛ ومع ذلك، الببتيد بروتين P2 التقليدية 57-81 (P257-81) التي ينتج عنها مرض في سلالة من الماوس سخل عرضه8 غير قادر على المرضية غير المشروعة مما أدى إلى عجز وظيفي في سلالة C57BL/6. لحسن الحظ، تسليم نماذج التوعية باستخدام P0106-125 أو الببتيدات P0180-199 ، في adjuvant جنبا إلى جنب مع حقن السعال الديكي السمية يمكن التغلب على هذا الحاجز، تمكين أدوات الجينية المتطورة التي ستستخدم في موريني EAN النموذجي.

ويرد هنا، طريقة بسيطة لاستحثاث EAN في الفئران C57BL/6. وباﻹضافة إلى ذلك، تقدم نهجاً مفصلة شاملة لتقييم العجز الوظيفي ولاثيل المرتبطة بهذا المرض. واختير P0180–199 الببتيد9 تفضيل البديل57-81 P010. الطراز199 180–P0 قد وصفت لإنتاج علامات سريرية أقل حدة بالمقارنة مع البديل57-81 P010فمن المرجح أن تحمل إدخال يحتمل أن الاضطرابات الوراثية الضارة، التعافي من العمليات الجراحية (مثل غرس مضخة ناضح)، وهي قابلة للمطحنة مشيه دالة اختبار4. ومع ذلك، الاختبارات الدالة مشيه المطحنة وغذائها البروتوكولات المذكورة هنا يمكن بسهولة تطبيق عند دراسة هذا المرض في متغير57-81 التي يسببها P0.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

كافة الإجراءات الموصوفة هنا أقرها المعهد فلوري لعلم الأعصاب والصحة العقلية (مركز الدماغ ملبورن) الحيوان لجنة الأخلاقيات واتبع "قانون الممارسة الأسترالية" "استخدام الحيوانات" للعلم الأغراض-

1-تحريض EAN

ملاحظة: EAN يمكن أن يتسبب بنجاح في الفئران C57BL/6 الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 6 8 أسابيع. البروتوكول التوجيهي يأخذ 9 أيام في المجموع. اليوم 0 يشير إلى يوم التحصين الأولى. لهذا البروتوكول، وقد أجريت الحقن تحت التخدير (راجع الخطوة 1-1-2 أدناه)-

  1. "في اليوم"-1:
    1. إعداد "السم السعال الديكي" حل (انظر الجدول للمواد) 1.6 ميكروغرام/مل باستخدام الفوسفات متساوي التوتر الماوس عقيم في م 0.1 مخزنة المالحة (طن متري-برنامج تلفزيوني).
    2. أنيسثيتيزيشن مع إيسوفلوراني:
      1. ضع الماوس (C57BL/6، ذكر، 6-8 أسابيع) في قاعة أنيسثيتيزيشن وضبط تدفق الأوكسجين إلى 1 لتر/دقيقة
      2. قم بتشغيل المرذاذ isoflurane وضبطه إلى 2.5 في المائة لمراقبة التنفس وأنيسثيتيزيشن، وانتظر لمدة 2 دقيقة، أو حتى ردود الفعل الأولية (أطرافهم القرنية وهند) التي لم تعد تستجيب
    3. إزالة الماوس من قاعة أنيسثيتيزيشن وإدارة 250 ميليلتر من الحل "السمية السعال الديكي" أعلاه عن طريق حقن داخل (القائمة) استخدام 0.5 مل حقنه بإبرة 30 1/2 ز.
    4. تعد العدوى عن طريق الحقن للتحصين:
      1. تحضير الحل استخدام حل 2 مغ/مل من P0 الببتيد 180-199 (مع > نقاوة 98%، تسلسل S-S-K-R-G-R-قتبفلياملدهسرس) في المحلول الملحي 0.9 ٪.
      2. تحضير حل ب استخدام الحل 20 ملغ/مل من بكتريا السل (انظر الجدول للمواد) في فروند ' s كاملة adjuvant (قانون المنافسة المنصفة، تتألف من: مونولاتي مانيدي 15% + 85% من زيت البارافين و 0.5 ملغ/مل من يهتمان قتلوا والمجففة الزبدية متفطره M)-
      3. جعل العدوى النهائي للحقن، الجمع بين أجزاء متساوية الحجم من حلول A و B في الخافق حبة ومزجها في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
        ملاحظة: الحلول A و B يمكن الاحتفاظ بها كمخزون وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها شهر واحد ولكن العدوى النهائي الموحد يجب أن يكون مستعدا طازجة في يوم حقن الفأر.
  2. "في اليوم" 0، إدارة 50 ميليلتر من العدوى (الإعداد المذكورة في الخطوة 1.1.4) في ماوس عن طريق حقن تحت الجلد استخدام إبرة 23 ز.
    ملاحظة: الحقن يمكن أن توضع بين ريش الكتف، أو بين أطرافهم هند وذيل على dorsum والذيلية.
  3. في اليوم 1، جعل الحل "السمية السعال الديكي" 1.2 ميكروغرام/مل (في النقل المتعدد الوسائط-برنامج تلفزيوني) وإدارة 250 ميليلتر في ماوس عن طريق الحقن القائمة باستخدام 0.5 مل حقنه بإبرة 30 1/2 ز.
  4. في 3 يوم، كرر الخطوة 1-3 أعلاه.
    ملاحظة: يمكن أن تتكون حلول الأسهم A و B والمخزنة في ˚C 4 لمدة أقصاها شهر واحد. غير أن العدوى عن طريق الحقن النهائي، أنتجت عن طريق الجمع بين الحلول الأسهم A و B، يجب أن يتم في اليوم للحقن.
  5. في يوم 8، إدارة 50 ميليلتر من العدوى (الإعداد المذكورة في الخطوة 1.1.4) في ماوس عن طريق حقنه تحت الجلد (راجع الخطوة 1-2 أعلاه)، في موقع الحقن نفسها كما في الخطوة 1، 2 (لكل الحيوانات)

2-"التهديف السريرية"

  1. أداء التهديف السريرية بها يوميا ابتداء من اليوم 0.
  2. إعطاء كل الماوس على درجة من 0، 1، 2، 3، أو 4 وفقا لمعايير منشورة 4. انظر الجدول 1 للتهديف السريرية EAN.
    ملاحظة: للاتساق، ينبغي بذل مجهود نقاط الفئران في نفس الوقت يوميا بنفس الباحث.

3. السيارات "تقييم الدالة"

ملاحظة: تقييم أداء المحرك بالتوازي مع التهديف السريرية للفوج نفسه من الحيوانات. يجب أن تكون متصلاً جهاز تقييم الدالة السيارات إلى جهاز كمبيوتر أن له (انظر الجدول للمواد) تركيب جهاز تصوير دالة مشيه. من المستحسن أيضا أن جميع الفئران تقييم ينبغي أن اعتادوا على المهمة قيد التشغيل قبل التعريفي EAN. للقيام بذلك، تتم ممارسة تشغيل (تشغيل الاختبار 2 للماوس) ثلاثة أيام قبل تحريض المرض (اليوم-3)-

  1. بدوره على جهاز تقييم وظيفة الحركة والتبديل على زر الضوء.
  2. القفا الماوس بحزم والحبر قدميها بتخفيض على حاوية مليئة بالحبر الأحمر بينما يمسك ذيله.
    ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة لسلالة C57BL/6، ولكن يمكن تخطي إذا كان يتم استخدام سلالة ماوس مع لون معطف أبيض-
  3. ضع الماوس في المقصورة المشي وتعيين سرعة المطحنة في 15 سم/س.
  4. تشغيل في حلقة مفرغة وانقر " سجل " الزر لالتقاط حركة تشغيل الماوس باستخدام الدالة مشيه نظام التصوير (انظر الجدول للمواد).
    5. استخدام جهاز ضبط وقت
  5. وقياس كل تشغيل 36 s. بعد 36 ثانية، وإيقاف التسجيل ووقف حلقة مفرغة.
    ملاحظة: تعتبر الفئران التي لا يمكن إكمال بنجاح هذه المهمة قيد التشغيل لهذا الفاصل s 36 لم.
  6. حفظ ملف الفيديو في مجلد معين.
  7. كرر الخطوات أعلاه لكل الماوس لتقييمها. اختبار الفئران بنفس المهمة قيد التشغيل كل 3 أيام-
  8. تحليل ملفات الفيديو تم تحريرها باستخدام البرمجيات لمعلمات الدالة مشيه (انظر الجدول للمواد)-
    ملاحظة: تفاصيل كيفية تحليل معلمات الحركية المختلفة تختلف بين البرامج حتى الرجاء الرجوع إلى الشركة المصنعة ' تعليمة s قبل التحليل. للحصول على أدلة النسيجي محواري وتلف المايلين عبر إيمونوهيستوتشيميستري أو المجهر الإلكتروني، الحيوان الأنسجة يمكن أن تتخذ في أي مرحلة وظيفة وظيفة الحركة التقييم اعتماداً على أهداف محددة للبحوث-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الببتيد180-199 P0 المستحث EAN C57BL/6 الفئران يؤدي إلى مرض أحادية الطور مع نقاط سريرية بداية من بعد 6 أيام ويلاحظ أول التحصين (نقطة في البوصة)، والأعلى درجة الخطورة من 25 نقطة في البوصة متبوعاً ببعض نقاط السريرية تحسن من 40 نقطة في البوصة المدة (الشكل 1)4،9. من حيث الوظيفة مشيه، الفئران تبدأ تفشل في مهمة قيد تشغيل بسيطة أقرب 6 نقطة في البوصة، ومن الفئران 35 نقطة في البوصة قد قدرة ضئيلة على ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويوجز هذا التقرير طريقة بسيطة لحمل EAN استخدام الببتيد180-199 P0 في الفئران C57BL/6، وتمكين التحديد الكمي للعجز لاثيل والوظيفية الرئيسية في الفئران التي يسببها مع EAN. متميزة في بروتوكول التعريفي EAN الموصوفة هنا استخدام التخدير أثناء إجراء حقن التحصين. استخدام التخدير isoflurane يعزز إلى حد كبير القدرة على ضمان أن الحجم الإجمالي للعدوى يتم حقن تحت الجلد في الموقع المطلوب مع الحد الأدنى من الخطأ والإجهاد للحيوانات.

سوف تبدأ الفئران لعرض علامات سريرية للمرض من 6 نقطة في البوصة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفين قد لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا العمل.

شكر وتقدير

وهو استيراد NHMRC بيتر دوهرتي وزميل مهنة أوائل أستراليا البحوث التصلب المتعدد (MSRA). جلف معتمد من قبل MSRA زمالات ما بعد الدكتوراه. تم دعم هذا العمل الصحة الوطنية الأسترالية ومنح المشروع مجلس البحوث الطبية (NHMRC) #APP1058647 JX.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
C57BL / 6 ، ذكر ، 6-8 أسابيعمن العمر الموارد الحيوية الأسترالية Cenre ، واشنطن ، أستراليا
السموم للسعال الديكيBiological Laboratories، Inc. ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية# 181
0.1 M الفوسفات متساوي التوتر الفوسفات المملح (MT-PBS)سيكون للمختبرات بروتوكولها الخاص.
لدى مختبرات IsofluranePharmachem ، كوينزلاند ، أستراليابروتوكولها الخاص للإدارة.
P0180– 199 < / sub>peptideWuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG ، CHNP0180 &ndash ؛ 199, تسلسل S & ndash; S– ك– R– ز & ندش ؛ R– س– T– P– V– L– Y– أ & نداش; م & ندش ؛ L– د & نداش; H– S– R– S
الحرارة قتلت المتفطرة السلية (سلالة H37RA)ديفكو ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية# 231141
فرويند الكامل (FCA)ديفكو ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية# 263910
16٪ بارافورمالدهيد (PFA)خدمات المجهر الإلكتروني# 15710تمييع إلى 4٪ PFA يوم جمع الأنسجة.
25٪ جلوتارالدهايدProSciTech Pty Ltd ، كوينزلاند ، أستراليا# 11-30-8تمييع إلى 2.5٪ جلوتارالديهايد يوم التثبيت.
أزيد الصوديومChem-Supply Pty Ltd ، SA ، أسترالياSL189إنشاء 10٪ (وزن / حجم) مخزون في 0.1 مليون طن متري - PBS. استخدم بنسبة 0.03٪ (حجم / حجم).
السكروزكيم توريد بي تي واي المحدودة ، SA ، أسترالياSA030تستخدم بنسبة 30٪ (وزن / حجم).
درجة حرارة القطع المثلى (OCT) متوسطةساكورا فينيتيك ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية# 4583
مصل الحمار العاديميرك ميليبور ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية#S30-100استخدم كمخفف للأجسام المضادة عند 10٪ (حجم / حجم) أو تركيز آخر يحدده المختبر الخاص.
Triton-X 100Sigma Aldrich ، MI ، الولايات المتحدة الأمريكية#90o2-31-1استخدم في مخفف الأجسام المضادة بنسبة 0.3٪ (حجم / حجم) أو تركيز آخر يحدده المختبر الخاص.
بروتين سلائف الأرانب المضاد للأميلويد (APP)Invitrogen (Life Technologies) ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكيةS12700يستخدم في الساعة 1: 400 أو المعايرة في المختبر الخاص.
الأرانب المضادة للاتصال المرتبط بالبروتين -1 (كاسبر)هدية من البروفيسور إليور بيليس ، معهد ويزمان للعلوم ، إسرائيلتستخدم في الساعة 1: 500 أو معايرة في المختبر الخاص.
مناسبة Alexa فلور الأجسام المضادة الثانوية المترافقةالمجسات الجزيئية (تقنيات الحياة) ، أو ، الولايات المتحدة الأمريكيةاستخدام مختلففي 1: 200 أو المعايرة في المختبر الخاص. يخضع اختيار الأنواع التي نشأ فيها الجسم المضاد واختيار Alexa Fluor لتقدير كل مختبر.
محلول التركيب المائيداكو (أجيلينت) ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةسيكون لكل مختبر تفضيلاته الخاصة.
<قوي>الاسم<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
Equipment
0.5 مل حقنة مع 301/2< / sup> g إبرBD#326105
23 جم إبرديناربحريني #305143
حبر أحمريمكن استخدام أي وسادة حبر حمراء أو صبغة طعام حمراء لتمييز أقدام.
جهاز DigiGate (بما في ذلك جهاز المشي)eMouse Detailss Inc. Framingham ، MA
DigiGate Imaging SystemeMouse Detailss Inc. Framingham ، MA
Stopwatchيمكن استخدام أي مؤقت.
DigiGait 8 SoftwareeMouse Detailss Inc. فرامنغهام ، ماساتشوستس
تشريح المجهرZeissيمكن استخدام أي مجهر تشريح مناسب.
الشرائح المشحونةSuperfrost Plus و Lomb Scientific Pty LtdSF41296SP
CyrostatLeicaيمكن استخدام أي cyrostat مناسب.
معدات التروية وأدواتالتشريح سيكون للمختبرات بروتوكتولات التروية الخاصة بها.
المرطبة غير الشفافةالخاصة بها باستخدام حاوية بلاستيكية غير شفافة.
قلم رصاص الشمعأوالسطحي لإنشاء بئر حول قسم الأنسجة.
المجهر متحد البؤرZeis LSM780يمكن استخدام أي مجهر متحد البؤر مع خطوط ليزر مناسبة.
فيجي / صورة Jالمعاهد الوطنية للصحةمتاحة من www.fiji.sc
قائمةسيكون مساعد #S3023 وسادة قد تنتج مختبرات الغرفة يمكن أيضا استخدام التوتر

المراجع

  1. Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
  2. Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
  3. Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
  4. Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
  5. Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
  6. Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
  7. Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
  8. Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
  9. Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
  10. Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
  11. Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
  12. Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EAN P0 180 199

مقالات ذات صلة