Method Article

أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

DOI:

10.3791/56464

⸱

November 26th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Protein Aggregation and Aging, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Graduate School of Cellular and Molecular Neuroscience, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهدف الطريقة المعروضة هنا استكشاف تجميع البروتين أثناء الشيخوخة العادية في نموذج الكائن الحي C. ايليجانس. ويمثل البروتوكول أداة قوية لدراسة مجاميع كبيرة غير قابلة للذوبان العالية التي تشكل مع التقدم في السن وتحديد كيفية تأثير التغيرات في بروتيوستاسيس تجميع البروتين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العقود الأخيرة، زاد انتشار اضطرابات الأعصاب، مثل مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD). هذه الاضطرابات المرتبطة بالعمر تتميز بظهور المجاميع البروتين مع هيكل فيبريلاري في أدمغة هؤلاء المرضى. بالضبط لماذا تخضع عادة للذوبان البروتينات تظل عملية تجميع غير مفهومة. وأعرب عن اكتشاف أن تجميع البروتين لا يقتصر على عمليات المرض، وبدلاً من ذلك جزءا من عملية الشيخوخة العادية يمكن دراسة الآليات الجزيئية والخلوية التي تنظم تجميع البروتين، دون استخدام اكتوبيكالي البشرية البروتينات المرتبطة بالمرض. هنا يصف لنا منهجيات دراسة تجميع البروتين المتأصلة في ايليجانس كاينورهابديتيس من خلال نهج تكميلية. أولاً، علينا النظر في كيفية زراعة عدد كبير من العمر متزامنة C. ايليجانس للحصول على الحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين ونقدم الإجراءات البيوكيميائية لعزل المجاميع عالية-غير قابلة للذوبان-كبيرة. في تركيبة مع ضربة قاضية وراثية مستهدفة، من الممكن تشريح دور مورثة مصلحة في تعزيز أو منع البروتين العمر تعتمد على التجميع باستخدام أما تحليل شامل مع الكمية الكتلي أو التحليل القائم على مرشح مع الأجسام المضادة. يتم ثم تأكدت هذه النتائج بتحليل في فيفو مع الحيوانات المحورة وراثيا معربا عن معلم الفلورسنت البروتينات المعرضة للتجميع. هذه الأساليب ينبغي أن تساعد على توضيح السبب في بعض البروتينات المعرضة للتجميع مع التقدم في السن وكيفية الحفاظ على هذه البروتينات تعمل بكامل طاقتها في نهاية المطاف.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعترف ميسفولدينج البروتين والتجميع كسمة مميزة لعدة أمراض الأعصاب مثل التصلب العضلي الجانبي (المرض) الإعلانية، والمشتريات، والخرف فرونتوتيمبورال (FTD) والعديد من الآخرين. على سبيل المثال، تجميعات α-سينوكلين في ييفات اميلويد التي تتراكم كهيئات ليفي خاصة في المادة الرمادية في الدماغ للمرضى PD، أثناء وجوده في المرض المرضى ميسفولد، ماساتشوستس-43 أو فوس على شكل مجاميع هيولى في تردي الخلايا العصبية الحركية. في كل من هذه الاضطرابات الأعصاب، تفشل آليات الحفاظ على التوازن بروتين أو بروتيوستاسيس لمنع تراكم تجمعات البروتينات، وبالتالي تؤدي إلى المرض.

بروتيوستاسيس أمر حاسم لضمان الوظائف الخلوية وفي ظل الظروف العادية هذه الآليات التنظيمية أحكام السيطرة على معدل تخليق البروتين وقابلة للطي، والتدهور. عدة دراسات تثبت أن مع الشيخوخة، العديد من الخلايا والأجهزة قادرة على الحفاظ على التوازن البروتين تدريجيا للخطر، وتدهور الفسيولوجية لشبكات بروتيوستاسيس مع التقدم في السن ظرفا هاما أمراض الأعصاب (إعادة النظر في المراجع1،،من23). حقيقة أن مراقبة جودة البروتين والاستجابة الخلوية على الإجهاد البروتين تكشفت هي الخطر مع التقدم في السن تشير إلى أن ميسفولدينج البروتين وتجميع يمكن أن تكون نتيجة عامة للشيخوخة. وفي الواقع، نحن وآخرون أظهرت أن تجميع البروتين لا يقتصر على الأمراض، وبدلاً من ذلك يصبح جزء من البروتين شدة المنظفات-غير قابلة للذوبان في الحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين4،،من56،7 ،،من89،10. وكشف تحليل الحسابية و في فيفو أن هذه المجاميع الفسيولوجية المتعلقة بالسن يشابه المجاميع المرض في عدة جوانب5. اكتشاف تجميع البروتين الذاتية، وتعتمد على العمر يعطينا الفرصة لتشريح الآليات الجزيئية والخلوية التي تنظم تجميع البروتين، دون استخدام اكتوبيكالي أعرب عن البروتينات البشرية المرتبطة بالمرض. وفي الوقت الحاضر، توجد سوى معلومات محدودة حول تنظيم إينسولوبيليتي البروتين على نطاق واسع وآثار هذه التقلبات على صحة الكائن الحي.

السلكية C. ايليجانس واحدة من الكائنات نموذج درس آخر على نطاق واسع في الشيخوخة البحث هذه الحيوانات عمر قصيرة نسبيا وتظهر العديد من الميزات المميزة الشيخوخة لاحظ في أعلى من الكائنات الحية. وقد درست آثار الشيخوخة على إينسولوبيليتي البروتين في C. ايليجانس بتجزئة البيوكيميائية متسلسلة استناداً إلى قابلية الذوبان التفاضلية، الذي يستخدم على نطاق واسع لاستخراج المجاميع المرض في ميدان البحوث نيوروديجينيريشن11 . حسب الكمية الكتلي، عرضت عدة مئات من البروتينات ليصبح تجميع المعرضة في C. ايليجانس في غياب المرض5. هنا نحن تصف بالتفصيل في البروتوكول أن تنمو إعداد كبيرة من الديدان في ثقافة السائل واستخراج متسلسلة لعزل البروتينات المجمعة للقياس الكمي بالطيف الكتلي والتحليل بوصمة عار الغربية. لأن تتراكم البروتينات تجمعات والمعرضة للتجميع في سن C. ايليجانس الغدد التناسلية وأقنعة التغييرات الأخرى الأنسجة الجسدية5،،من1213، نستخدم متحولة الغدد التناسلية أقل لتركيز التحليل على البروتين إينسولوبيليتي في أنسجة غير الإنجابية. طريقة عرض تمكين تحليل مجاميع كبيرة تستعصي على الحل عالية، والتي غير قابلة للذوبان في الحزب الديمقراطي الصربي 0.5% والأعلاف بسرعة الطرد المركزي منخفضة نسبيا. بدلاً من ذلك، تم وضع بروتوكول استخراج أقل صرامة لجمع مجاميع أصغر وأكثر قابل للذوبان أيضا نشرها في أماكن أخرى من10. وبالإضافة إلى ذلك، يصف لنا الطريقة المستخدمة لتقييم التجميع في فيفو في C. ايليجانس.

عموما، يمكن تقييم هذه الأساليب في تركيبة مع تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) دور مورثة اهتمام بتحوير تجميع البروتين تعتمد على العمر. ولهذا يصف لنا تحليل مقتطفات من الديدان الصغار والمسنين مع أو بدون ضربة قاضية من البروتين محددة تهم استخدام [رني]. هذه الأساليب ينبغي أن تكون أداة قوية لتحديد مكونات شبكة الاتصال بروتيوستاسيس تنظيم إينسولوبيليتي البروتين. مداخلات عديدة مثل خفض الأنسولين/يشبه الأنسولين عامل النمو (IGF) 1 إشارات (IIS) قد ثبت بشكل كبير تأخير C. ايليجانس الشيخوخة14. مسارات طول العمر غالباً ما يحفز آليات مراقبة نوعية البروتين وهكذا هذه المسارات يمكن أن يكون نشاط التأثير على معدل التراكم البروتين. وكمثال على ذلك، علينا أن نظهر التجميع انخفاض البروتين المتأصلة في الحيوانات المعمرة على تثبيط مسار IIS7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: للحصول على فهم أفضل لهذا الإجراء، هو تعلق تخطيطي لسير العمل (الشكل 1).

1-نمو "إعداد كبيرة من الشباب" والمسنين C. ايليجانس يتعرضون للاستهداف [رني] الجينات مصلحة

ملاحظة: طفرات العقيمة المستحثة بدرجة الحرارة gon-2(q388) استخدام C. ايليجانس (CF2253) للحصول على عدد كبير من السكان المسنين متزامنة. خلال جميع الخطوات، من المهم للعمل تحت ظروف شبه معقمة مع لهب المكشوف والتحقق من أن لا الملوثات (على سبيل المثال، مع الفطريات أو البكتيريا) موجودة. نفذ الخطوات (كما سينتريفوجيشنز) في درجة حرارة الغرفة إذا لم يرد وصف لدرجة الحرارة.

  1. إعداد طفرات gon-2(-) C. ايليجانس للحصول على الحيوانات أقل الغدد التناسلية
    ملاحظة: للحصول على الحيوانات العقيمة التي تفتقر إلى الغدد التناسلية، الطفرة فقدان لوظيفة يجب أن يتسبب في الحيوانات الأصل بتحويل هذه في آخر مرحلة اليرقات (L4) إلى 25 درجة مئوية تجنبا لمساهمة الأمهات.
    1. أول توسع للحيوانات gon-2(-) لجمع جيل الوالدين لدرجة حرارة التحول
      1. OP50 الإشريكيّة القولونية الانتصارات سلالة على صفيحة ليسوجيني مرق (رطل) واحتضان ذلك بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      2. وفي اليوم التالي تطعيم متوسطة 200 مل رطل مع واحد OP50 استنساخ واحتضان ذلك بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      3. القادم يوم البذور 15 عالية النمو (HG) متوسطة لوحات (قطرها 9 سم) مع 0.5 مل OP50 وتوزيع OP50 مع ملعقة. تبقى اللوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.
      4. القطعة الحيوانات gon-2(-) (لا المتعطشة للأجيال الماضية اثنين) على لوحات متوسطة 15 HG المصنف مع OP50 والحفاظ عليها عند 20 درجة مئوية حتى اللوحات المتلاقية مع الكبار وبعض OP50 لا تزال متاحة.
      5. وفي الوقت نفسه، البذور 60 HG لوحات متوسطة مع OP50 كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.3 وتبقى اللوحات في درجة حرارة الغرفة. حذراً: لوحات المبذورة ينبغي لا أن تظل لأكثر من أسبوع واحد كما أجار سوف الكراك في درجة حرارة الغرفة.
      6. بليتش لوحات المتلاقية بمجرد بدء معظم البالغين لوضع البيض كما هو موضح سابقا15. جمع البيض في اثنين من 15 مل-أنابيب ومكان في خلاط نوتاتينج بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية.
      7. أغسل اليوم التالي فقست L1s مع المخزن المؤقت M9 (85 ملم كلوريد الصوديوم، 42 مم نا2هبو4·7H2س، 22 مم خ2ص4): أجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز 30 s وتجاهل المادة طافية، وتعبئة ما يصل إلى علامة 15 مل مع M9. الطرد المركزي وتجاهل المادة طافية، وكرر الخطوة 1.1.1.6. ملء الأنابيب مع الكريات دودة الناتجة تصل إلى علامة 15 مل مع M9.
      8. تقييم العدد الإجمالي ل L1s مع مجهر تشريح عن طريق العد L1s موجودة في 2 ميليلتر قطرات توضع على ألواح أجار غير المصنفة. متوسط الأرقام التي تم الحصول عليها من قطرات تسعة على الأقل.
      9. إضافة 6,500 L1s الواحد المبذورة لوحة زئبق وتمكنك من الديدان تنمو في 20 درجة مئوية حتى مرحلة L4.
    2. توسيع الحيوانات gon-2(-) للحصول على الحيوانات أقل الغدد التناسلية للتجربة الثانية
      1. مرحلة L4، تنتقل الديدان من خطوة 1.1.1.9 إلى 25 درجة مئوية حتى أنها تبدأ بوضع البيض وتفريخ L1s.
      2. جمع البيض و L1s بالترسيب
        ملاحظة: بعد تحول درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية، يفضل استخدام الترسيب كأسلوب لطيف لفصل البيض هشة و L1s من الكبار.
        1. أغسل اللوحات مع M9 باستخدام 5 مل M9 في خمس لوحات. نقل الديدان في أنابيب 50 مل.
        2. تملأ جميع الأنابيب للعلامة 45 مل مع M9 والسماح للرواسب الكبار لمدة حوالي 10 دقائق، وجمع كل المادة طافية في أنبوب 50 مل وكرر هذه الخطوة مع بيليه. الطرد المركزي المادة طافية الذي يحتوي على البيض و L1s في س 3,000 ز لمدة 1 دقيقة والسماح للرواسب L1s لمدة حوالي 10 دقائق، وإزالة المادة طافية حتى يتم ترك 15 مل.
          ملاحظة: هذا خطوة حاسمة. لا تقم بإزالة المادة طافية في وقت مبكر جداً، لجمع L1s أكبر عدد ممكن.
        3. وضع الأنابيب التي تحتوي على البيض و L1s في خلاط نوتاتينج بين عشية وضحاها في 25 درجة مئوية.
  2. ثقافة السائل من الحيوانات أقل الغدد التناسلية لجمع الشباب والذين تتراوح أعمارهم بين الحيوانات يتعرض لاستهداف جين للفائدة [رني]
    ملاحظة: يمكن رد بعض الجينات على [رني] درجة الحرارة تعتمد كما هو موضح سابقا16. وكبديل لذلك إلى [رني], مورثة متحولة يمكن إدراجها في الخلفية gon-2(-) .
    1. إعداد البكتيريا لثقافة السائل
      1. إعداد البكتيريا OP50 و [رني] (البكتيريا المنتجة دسرنا المرجوة والبكتيريا مع ناقل فارغ كعنصر تحكم) بتطعيم ل 4 رطل متوسطة مع 12 مل كل ثقافة البكتيرية (إضافة تركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين و 1 مم إيبتج إلى [رني] الثقافات البكتيرية) واحتضانها لهم عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 180 لفة في الدقيقة.
      2. وفي اليوم التالي حصاد الثقافات في 6,700 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة سوبيرناتانتس وريسوسبيند كل بيليه في 60 مل المثلج S الوسائط القاعدية (100 مم كلوريد الصوديوم، البوتاسيوم 50 مم فوسفات الهيدروجيني 6، أبقى على الجليد). تبقى الكريات ريسوسبينديد الثلاثة (OP50، التحكم [رني] البكتيريا والبكتيريا [رني] للجينات للفائدة) في 4 درجات مئوية حتى الخطوة 1.2.2 أو 1.2.3.
        ملاحظة: يمكن زراعة الديدان في [رني] من المرحلة L1 (راجع الخطوة 1.2.3) أو لتفادي العيوب التنموية من آخر مرحلة اليرقات L4 (راجع الخطوة 1.2.2).
    2. ثقافة السائل للمعاملة مع [رني] في الماضي بدأت مرحلة اليرقات L4
      1. إضافة وسائط 200 مل S القاعدية في قارورة ثقافة فيرنباتش (قدرة مل 2,800). حجم ثقافة نهائية من 300 مل (انظر 1.2.2.4)، إضافة سترات البوتاسيوم 10 مم، الرقم الهيدروجيني 6، 3 مل تتبع المعادن الحل (5 ملم حمض الإيثيلين (يدتا)، 2.5 مم فيسو4، 1 مم الحركة2، 1 مم زنسو4مم 0.1 CuSO4)، 3 مم MgSO4 ، 3 مم كاكل2و 100 نانوغرام/مل كاربيندازيم 5 ميكروغرام/مل الكوليسترول). إغلاق قارورة مع سداده ملولبة غشاء. الرجوع إلى الجدول 1 لوصفات من المخازن المؤقتة.
      2. تأخذ L1s من أصل 25 درجة مئوية (الخطوة 1.1.2.2.3) ونقلها إلى أنابيب 15 مل. الطرد المركزي في 1,900 س ز لمدة 3 دقائق وإزالة المادة طافية، وتعول L1s كل ميليلتر 2 كما هو الحال في الخطوة 1.1.1.8. إضافة 500,000 L1s في قارورة الثقافة فيرنباتش إعدادها في الخطوة السابقة.
      3. إضافة OP50 (من الخطوة 1.2.1) نسبيا لعدد الديدان. على سبيل المثال، للديدان 500,000 إضافة 60 مل OP50.
      4. الثقافة دودة كاملة مع S القاعدية لكي الحجم الإجمالي 300 مل. احتضان ثقافة دودة حتى مرحلة L4 عند 25 درجة مئوية في حاضنة هز مع 150 دورة في الدقيقة.
      5. وفي اليوم التالي الديدان ينبغي أن يكون حجم L4s البرية من نوع. لتغيير من OP50 البكتيريا [رني]، جمع الحيوانات في ست 50 مل-أنابيب والسماح لهم بالرواسب وإزالة المادة طافية. أغسل L4s مع M9 لإزالة بقايا البكتيريا OP50: الطرد المركزي في 1900 غ س لمدة 3 دقائق وإزالة المادة طافية ونقل جميع L4s في واحدة 50 مل-أنبوب. عد L4s الواحدة 5 ميليلتر (تسع مرات على الأقل). مرتين 50,000 L4s هناك حاجة لجمع دودة الشباب ومرتين 100,000 L4s هناك حاجة لجمع دودة أعمارهم.
      6. إعداد أربع قوارير الثقافة فيرنباتش كما هو موضح في 1.2.2.1. إضافة أيضا بتركيز 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين و 1 مم إيبتج نهائي لكل قارورة.
      7. إضافة عنصر تحكم [رني] البكتيريا والبكتيريا [رني] للجينات للفائدة (من الخطوة 1.2.1) التناسب لعدد الديدان: إضافة 7 مل البكتيريا منها كل قارورة للديدان الصغار ومل 14 في قارورة للديدان أعمارهم.
      8. إضافة الديدان 50,000 كل قارورة لجمع دودة الشباب والديدان 100,000 كل قارورة لجمع دودة أعمارهم، وإكمال الثقافات مع S القاعدية لملء تصل إلى 300 مل. احتضان ثقافات دودة (أربعة في المجموع) في 25 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة.
    3. ثقافة السائل للمعاملة مع [رني] بدءاً من المرحلة L1
      1. إعداد أربع قوارير الثقافة فيرنباتش كما هو موضح في 1.2.2.1 وإضافة تركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين و 1 مم إيبتج.
      2. تواصل مع إعداد L1s كما هو موضح في 1.2.2.2. وفي المجموع، هناك حاجة الديدان 300,000 لتقسيمها إلى أربع قوارير.
      3. إضافة عنصر تحكم [رني] البكتيريا والبكتيريا [رني] للجينات للفائدة (من الخطوة 1.2.1) يتناسب مع العدد الديدان كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.7 والنظر أيضا في مرحلة النمو بين مرحلة المستوى 1 والمستوى 4: إضافة 13 مل البكتيريا منها كل قارورة للشباب w أورمس ومل 26 في قارورة للديدان أعمارهم.
      4. يستمر كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.8.
    4. الحفاظ على الثقافات C. ايليجانس السائلة
      1. جمع دورياً قاسمة من كل ثقافة السائل ومكان على شريحة زجاجية (بدلاً من ذلك على صفيحة أجار) التحقق من عدم وجود لا التلوث. استخدام مجهر تشريح، تحقق المستويات الغذائية البكتيرية في الثقافة خاصة أثناء مرحلة النمو. إعداد مقدما الثقافات ل 2 من السيطرة [رني] البكتيريا والبكتيريا [رني] للجينات للفائدة كما هو موضح في الخطوة 1.2.1. إضافة هذه الثقافات ايليجانس جيم السائل إذا لزم الأمر، والحفاظ على ما تبقى في 4 درجات مئوية.
      2. فحص دوري لأن الحيوانات عقيمة. لن يكون لغالبية الحيوانات الغدد التناسلية. اعتماداً على بينيترانسي الطفرة غون--2 ، بعضها قد يكون تم إحباط هياكل جوندال لكن ينبغي أن تراعي لا الحيوانات مع البيض.
  3. مجموعة من الشباب والذين تتراوح أعمارهم بين الديدان يتعرضون إلى [رني] في ثقافة السائل
    ملاحظة: جميع الخطوات التالية لقارورة السائل ثقافة واحدة ولكن كل الثقافات من نفس العمر بالتحكم والبكتيريا [رني] للجينات للفائدة ينبغي معالجتها معا.
    1. جمع الديدان الصغار في اليوم 2 أو 3 لقياس المستويات القاعدية للبروتين إينسولوبيليتي اليوم. ينبغي أن تكون الديدان الذين تتراوح أعمارهم بين المجمعة (في آخر) عندما نصف السكان قد مات. لتحديد هذا، تحسب ديدان ميتة وعلى قيد الحياة في عدة قطرات من السائل الثقافة على صفيحة أجار. يتم حساب متوسط النسب عبر قطرات تسعة على الأقل.
    2. إعداد الكواشف التالية: 1 L M9، 1 ل M9 مع 0.01 ٪ أوكتوكسينول-9 (M9 + أوكتوكسينول-9)، والسكروز 60% 40 مل في ddH2سين إبقاء الكواشف على الجليد.
    3. صب الديدان من قارورة واحدة في قمع فصل وترك الرواسب الديدان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. فتح في محبس الحنفية والتنقيط والديدان في أنبوب 50 مل واحد.
    4. تقسيم بيليه دودة اثنين 15 مل-أنابيب والطرد المركزي في 1,900 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ليغسل الديدان وإزالة المادة طافية وملء يصل إلى 15 مل مع M9. كرر الطرد المركزي. وأخيراً نقل الديدان إلى أنبوبين 50 مل وتملأ بإجمالي حجم 20 مل مع M9 المثلج.
    5. لإزالة البكتيريا والديدان الميت، إضافة 20 مل مخففة دودة الكريات اثنين على اثنين 50 مل-أنابيب مليئة السكروز 60% المثلج 20 مل. الطرد المركزي بسرعة في 2,700 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتسريع 9 وتباطؤ 7. بعناية إزالة الطبقة الأعلى الدودة مع بيبيت كبيرة (25 مل). أن يصل إلى 15 مل (ولكن أقل إذا كان من الواضح أن هناك الكثير من الديدان الميت). وضع هذا مباشرة إلى 37 مل M9 + أوكتوكسينول-9 (أنابيب 3 كل أنبوب السكروز) أعد على الجليد. الطرد المركزي في س 2,700 ز لمدة 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تسارع التباطؤ في 7 و 9.
      ملاحظة: كلاهما تحتاج إلى أن تكون الجليد؛ وإلا لن يعمل الانفصال. لا تخلط! لأن السكروز السامة للديدان من المهم أن تكون سريعة للخطوة التالية.
    6. تقسيم بيليه إلى أربعة 15 مل-أنابيب ويغسل مرتين مع المثلج M9 + أوكتوكسينول-9: أجهزة الطرد المركزي في 1,900 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المادة طافية، تملأ بعلامة 15 مل مع المثلج M9 + أوكتوكسينول-9 وتكرار الإجراء.
    7. أغسل مرة واحدة مع M9 المثلج والجمع بين أنابيب أربعة إلى اثنين من الأنابيب. تملأ M9 في درجة حرارة الغرفة إلى إجمالي حجم 4 مل في 15 مل-الأنابيب وتدوير في خلاط نوتاتينج عند 25 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
      ملاحظة: يساعد هذا الديدان لهضم أي بكتيريا متبقية في القناة الهضمية. تحقق من الديدان تحت المجهر لمعرفة أن هناك لا ميتة أحد.
    8. أغسل الديدان مرتين مع المثلج M9 + أوكتوكسينول-9 كما هو موضح في 1.3.5. تغسل مرتين مع M9 ونقل الديدان إلى أنبوب واحد.
    9. أغسل الديدان مرة واحدة في المخزن المؤقت لاستخراج الملح عالية "إعادة التجميع" (رب) دون مثبطات (حمض مورفولينيثانيسولفونيك 4 م 0.1 (MES)، وحمض اتهيلينيجليكولتيتراسيتيك 1 مم (عطا)، 0.1 مم يدتا، 0.5 مم MgSO4، 0.75 متر كلوريد الصوديوم، 0.02 م فلوريد الصوديوم (NaF)) قبل جمع. إزالة المادة طافية حتى يكون هناك لا سائل على رأس بيليه دودة.
      ملاحظة: هذه الخطوة والمرحلة التالية ينبغي أن يتم سريعاً لتجنب القطع الأثرية في الديدان تسبب بارتفاع تركيز الملح في المخزن المؤقت.
    10. تقدير حجم بيليه دودة وإضافة وحدة تخزين متطابقة من رب مع مثبطات (2 × كوكتيل مثبط البروتياز). استخدام ماصة باستور، وضع الديدان والتنقيط ببطء في أنبوب 50 مل نصف مملوءة بالنيتروجين السائل في الثلج الجاف. واسمحوا نيتروجين سائل يتبخر وتخزين الديدان المجمدة في-80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
      تنبيه: النتروجين السائل في درجة حرارة منخفضة للغاية؛ ملابس الحماية المناسبة.

2. استخراج البروتين غير قابلة للذوبان مع الشباب والذين تتراوح أعمارهم بين الحيوانات يتعرض لاستهداف جين للفائدة [رني]

  1. تعطل حيوانات التي تم جمعها في الخطوة 1، 3
    ملاحظة: من المهم تجنب أي ذوبان الجليد من عينات الفيروس المتنقل. يبرد الهاون مع النتروجين السائل وتنفيذ الإجراء الكامل على الثلج الجاف.
    تنبيه: النتروجين السائل في درجة حرارة منخفضة للغاية؛ ملابس الحماية المناسبة.
    1. نقل الديدان المجمدة لقذائف الهاون قبل تبريد وطحن 2.5 دقيقة.
      ملاحظة: كن حذراً أثناء طحن: في البداية، من الديدان المجمدة رصاصات صغيرة ومن السهل أن تفقد لهم.
    2. إضافة النيتروجين السائل (حوالي 100 مل) في مسحوق ليبرد مرة أخرى وطحن لآخر دقيقة 2.5 الاختيار مع المجهر أن الهيئات الدودة كسر. نقل المسحوق في أنابيب 2 مل وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  2. استخراج البروتين غير قابلة للذوبان السريع لتحليل لطخة غربية
    ملاحظة: استخدام هذا الأسلوب لمقارنة مستويات البروتين المحتوى وغير قابلة للذوبان مجموع البروتين بين أيام مختلفة مع أو بدون [رني] استهداف الجين للفائدة. تنفيذ كافة الخطوات حتى الخطوة 2.2.3 على الجليد!
    1. جعل 50 مغ ديدان الأرض من الخطوة 2.1 مع 150 ميليلتر راديويمونوبريسيبيتيشن المقايسة (ريبا) المخزن المؤقت (50 مم تريس درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم يدتا، 0.5% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، ديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.5% (SDO)، 1% نونيلفينيلبوليثيلينجليكول (NP40)، 1 مم فينيلميثيلسولفونيل الفلوريد (بمسف)، 1 × كوكتيل مثبط البروتياز). مجانسة تعليق استخدام المحاقن 1 مل مع إبرة الرمادي (27 × ½ "، 0.4 مم × 13 مم)؛ وضع التعليق 10 مرات.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 18,400 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية.
    3. ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر ريبا المخزن المؤقت والطرد المركزي في 18,400 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وتدور قريبا، وأن تحرص على إزالة بقايا طافية.
    4. لجعل البروتينات عالية غير قابلة للذوبان، ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت اليوريا/الحزب الديمقراطي الصربي ميليلتر 75 (م 8 اليوريا، 2% الحزب الديمقراطي الصربي، 50 مم ديثيوثريتول (DTT)، 50 مم تريس، درجة الحموضة 8) واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. لتحليل محتوى البروتين الكلي، الجمع بين المعهد الملكي أول طافية من الخطوة 2.2.2 واستثارة بيليه اليوريا/الحزب الديمقراطي الصربي. لحساب وحدات التخزين المستخدمة للاستخراج، ينبغي أن يتضمن جزء مجموع ثلثي ريبا طافية وثلث الكسر بيليه اليوريا/الحزب الديمقراطي الصربي. في جل تدرج صغيرة 4-12%، التحقق من مستويات بروتين غير قابل للذوبان بتحميل ميليلتر 9 في كسر اليوريا/الحزب الديمقراطي الصربي وميليلتر 4 مجموع البروتين مجتمعة. أداء مجموع البروتين وصمة عار تلطيخ لرصد مستويات البروتين. بالغربية النشاف باستخدام أجسام مضادة محددة، التحقق من التغييرات في إينسولوبيليتي للبروتينات الفردية كمياً بالطيف الكتلي (انظر القسم 3).
  3. استخراج البروتين غير قابلة للذوبان لعزل البروتينات SDS تستعصي على الحل الكتلي
    ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات على الجليد.
    1. على الثلج الجاف مرات وزنها اثنين 350 ملغ الديدان الأرضية في النقطة الزمنية ولكل البكتيريا [رني] (الديدان، الشباب والمسنين والسيطرة [رني] البكتيريا والبكتيريا [رني] للجينات للفائدة) في أنابيب 2 مل.
    2. لإزالة البروتينات القابلة للذوبان الملح عالية، إضافة مجلدين من رب كل وزن (700 ميليلتر) مع مثبطات، 1 مم بمسف، 200 يو/مليلتر الدناز الأول، و 100 ميكروغرام/مل رناسي أ إلى كل أنبوب وجعل مسحوق على الجليد. وضع التعليق في محقن 1 مل (إبرة رمادي، 27 x ½ "، 0.4 مم × 13 مم) 15 مرة، واحتضان ذلك على الجليد لأدنى 10 أجهزة الطرد المركزي في 18,400 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تذهب من خلال طبقة الدهون وجمع المادة طافية يحتوي على الملح عالية البروتينات القابلة للذوبان في أنبوب 2 مل واحد كل حالة (أربعة أنابيب في المجموع). إزالة الدهون وتخلص منه. الكوة الملح عالية البروتينات القابلة للذوبان لتجميد في-80 درجة مئوية.
    3. للتخلص من الدهون، جعل بيليه مع 700 ميليلتر رب مع مثبطات تحتوي على السكروز 1 م (دون الدناز أنا ورناسي A). وضع التعليق في محقن 10 مرات واحتضان ذلك على الجليد للحد الأدنى 5 أجهزة الطرد المركزي في 18,400 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. كن حذراً لإزالة جميع المادة طافية والدهون والتخلص منها.
    4. لإزالة البروتينات القابلة للذوبان في الحزب الديمقراطي الصربي، جعل بيليه مع 700 العازلة ريبا ميليلتر. وضع التعليق في محقن 10 مرات واحتضان عليه لمدة 10 دقائق على الجليد. أجهزة الطرد المركزي في 18,400 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية المحتوية على البروتينات القابلة للذوبان في الحزب الديمقراطي الصربي وقاسمه للتجميد في-80 درجة مئوية.
    5. تجمع العينات اثنين لكل شرط معا بعد سولوبيليزينج كل بيليه مع 500 ميليلتر ريبا العازلة. وضع التعليق في محقن 10 مرات. أجهزة الطرد المركزي في 18,400 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. كن حذراً لإزالة جميع المادة طافية وتجاهل ذلك.
      ملاحظة: هدف الاستخراج لفصل البروتينات القابلة للذوبان من البروتينات غير قابلة للذوبان. ولذلك، من المهم لإزالة جميع بقايا ريبا طافية قبل إضافة حمض الفورميك في الخطوة التالية.
    6. جعل بيليه النهائية التي تحتوي على بروتينات عالية غير قابلة للذوبان مع 400 ميليلتر 70% حمض الفورميك ووضع التعليق في محقن 20 مرة. احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد. الطرد المركزي في 50,000 ز x لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتسارع 3 وتباطؤ 5، لإزالة الحطام بشرة دودة. جمع المادة طافية تحتوي على بروتينات عالية غير قابلة للذوبان وتجميدها في-80 درجة مئوية.
    7. الغسيل الكلوي للكسور بروتين غير قابل للذوبان الكتلي
      ملاحظة: دياليزي في 4 درجات مئوية.
      1. إعداد المخزن المؤقت لغسيل الكلي ل 8 (50 مم تريس، 1 مم DTT، 0.1 مم بمسف، درجة الحموضة 7.5) وتقسم إلى ثمانية ل 1 قنينة. ضع الأغشية الثلاثة (مرشحات غشاء = 0.025 ميكرومتر) على سطح المخزن المؤقت لكل كوب 1 لتر.
      2. كل غشاء، بعناية تحميل ميليلتر 65 من البروتين غير قابلة للذوبان solubilized في حمض الفورميك التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.3.6. وينقسم كل شرط على الأغشية الستة.
      3. التحقق من الرقم الهيدروجيني لنموذج واحد بإزالة 5 ميليلتر وإضافته إلى شريط الأس الهيدروجيني. إذا كان الرقم الهيدروجيني بين 7 و 8 (تقريبا بعد ح 2)، جمع العينة من بيبيتينج إلى أعلى وأسفل برفق. وأخيراً، استخدم 10 ميليلتر الغسيل الكلوي العازلة لغسل متسرعا قبالة كل الغشاء. تجميد عينات في-80 درجة مئوية.

3-شاملة تحديد وتقدير حجم التغييرات في إينسولوبيليتي البروتين مع العمر الناجمة عن استهداف جين للفائدة [رني]

  1. التحضير لتحليل الطيف كتلة
    1. تقييم كمية البروتينات غير قابلة للذوبان في عينات دياليزيد عن طريق تحميل قاسمة على 4-12% هلام تدرج جنبا إلى جنب مع عينة مرجعية من تركيز معلوم. تؤدي تلطيخ جل مجموع البروتين وقياس كمية البروتين مع برنامج تحليل صورة. هذه الخطوة ضروري لتقدير كمية التربسين اللازمة الهضم (الخطوة 3.1.4).
    2. تركز العينات باستخدام مبخر الطرد مركزي وجعل البروتينات غير قابلة للذوبان في تركيز اليوريا م 8 نهائي.
    3. الألكلة والحد
      1. إضافة Tris(2-carboxyethyl) هيدروكلوريد الفوسفين (تسيب) بتركيز نهائي من 4 مم للعينات. احتضانها ح 1 في 57 درجة مئوية مع 300 دورة في الدقيقة. وضع العينات في درجة حرارة الغرفة.
      2. إضافة إيودواسيتاميدي إلى نهائي تركز 8.4 ملم. احتضان لمدة 45 دقيقة (يمكن المحتضنة ح 2) في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
      3. تمييع هذه العينات في بيكربونات الأمونيوم 150 مم للحصول على تركيز يوريا م 2 نهائي.
    4. هضم البروتينات بنسبة 5% w/w تعديل التربسين بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 400 لفة في الدقيقة.
    5. تحميل عينة من هضم البروتينات في جل مخزونات النشر الاستراتيجي 12% وأداء جل مجموع البروتين تلطيخ لتحليل إذا عملت الهضم. إذا كان لا يزال هناك بعض الفرق الحالي، كرر الخطوتين 3.1.4 و 3.1.5.
    6. تتم تسمية الببتيدات من مراقبة الصغار والمسنين و [رني] يعامل C. ايليجانس مع العلامات إيسوباريك كوانتيتيشن النسبي والمطلق اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدام أساليب أخرى لوضع العلامات على الببتيدات أو البروتينات يمكن للقياس الكمي مثل العلامات الجماعية جنبا إلى جنب.
      ملاحظة: كتلة تحليل الطيف: لتقليل تعقيد عينة، يجب فصل الببتيدات اللوني لتبادل الأيونات الموجبة القوية إلى كسور مختلفة ل تحليل الطيف الكتلي5. مطيافات الشامل عدة قادرة على تحليل العلامات إيسوباريك كوانتيتيشن النسبي والمطلق كما هو موضح في مكان آخر من17. ينبغي معالجة البيانات التي تم الحصول عليها مع البرامج المناسبة. عموما يسمح هذا التحليل تحديد البروتينات عالية غير قابلة للذوبان والتغييرات الخاصة بهم على سن وتعديل بروتيوستاسيس.

4. في فيفو تقييما لتأثير الجينات للفائدة على نمط التراكم خلال الشيخوخة

  1. من تحليل الطيف الكتلي في القسم 3، حدد بروتين معرضة لتجميع تعتمد على العمر الذي يتراكم بدرجة مختلفة في الحيوانات تتعرض إلى [رني]. إنشاء المحورة وراثيا C. ايليجانس خطوط التعبير عن هذا البروتين معلم مع بروتين فلوري وتحت سيطرة المروج لها كل منهما أو مروج الأنسجة على حدة (انظر المناقشة لاختيار المروج المناسبة). الحفاظ على الضغط عند 15 درجة مئوية باستخدام تقنيات قياسية في لوحات النمو ديدان أسطوانية (الحرس الوطني) المصنف مع OP50. على سبيل المثال، اخترنا سلالة دودة معربا عن بوليادينيلاتي-ملزمة البروتين (PAB-1) تنصهر في ن-المحطة إلى تاجرفب تحت سيطرة مروج عضلة البلعوم بميو-2-
  2. في فيفو تقييم التغييرات في التجميع مع التقدم في السن على تثبيط الجينات للفائدة
    1. يوم أو يومين في وقت مبكر، إعداد نانوغرام/كاربينيسيلين (الكربوهيدرات)/لوحات إيبتج مع عنصر تحكم ([رني] موجه فارغ L4440) البكتيريا والبكتيريا [رني] لكبح الجين للفائدة. (بالنسبة لبروتوكول مفصلة حول [رني] في "جوف علوم التعليم قاعدة البيانات"، انظر C. ايليجانس . أساسيات علم الأحياء 1: الخميرة، المورفولوجية و C. ايليجانس. [رني] في C. ايليجانس. جوف، كامبريدج، ماجستير، دوي: 10.3791/5105 (2017)).
    2. [رني] العلاج من المستوى 1، فصل مكان وضع البيض الديدان على عدة لوحات صغيرة نانوغرام/الكربوهيدرات/إيبتج (قطرها 6 سم) المصنف مع التحكم [رني] أو [رني] البكتيريا للجينات للفائدة عند 20 درجة مئوية. إزالة الكبار بعد ح 2، الحفاظ الذرية في 20 درجة مئوية. لتجنب عيوب الإنمائية، يمكن أن تبدأ العلاجات [رني] بعد مرحلة اليرقات L4.
    3. وبمجرد الذرية تصل إلى مرحلة اليرقات L4، نقل هذه L4s على لوحات نانوغرام/الكربوهيدرات/إيبتج الجديد المصنف مع التحكم [رني] أو [رني] البكتيريا للجينات للفائدة. إعداد لوحات تسعة مع الوراثي 15 كل لكل الشروط والاحتفاظ بها في 20 درجة مئوية. الديدان الشيخوخة تحتاج إلى نقلها بعيداً عن ذريتهم إلى لوحات جديدة كل يوم الثاني حتى نهاية هذه الفترة الإنجابية ولكي تكون قادرة على التمييز بينها وبين ذريتهم.
    4. تقييم التغيرات في توزيع البروتين المعرضة للتجميع المسمى بعلامة نيون تحت مجهر فلوري ستيريو مع 24 x التكبير أثناء مرحلة البلوغ، كل يوم.
      ملاحظة: تعتمد على العمر تراكم البروتين المعرضة للتجميع في بونكتا مشرقة كقراءة للتجميع. ينبغي أن تكون هذه بونكتا الهياكل العالية غير متحرك أن توصف بأنها المجاميع. وهذا ينبغي أن تحدده fluorescence الانتعاش بعد فوتوبليتشينج (فراب) باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. للبروتين المجمعة، ينبغي أن يراعي لا الانتعاش في منطقة المبيضة بعد دقيقة على الأقل 45،18. لقياس التغييرات مع التقدم في السن، ونحن سجل أنماط التوزيع في الديدان مزامنة العمر overexpressing PAB-1 في اليوم 2، ويوم 5، ويوم 7 من مرحلة البلوغ كالتالي: تدني مستويات التجميع (0-10 tagRFP::PAB-1 بونكتا في لمبة البلعوم الخلفي)، مستويات التجميع المتوسط (أكثر من 10 بونكتا في لمبة البلعوم الخلفي)، ومستويات التجميع عالية (أكثر من 10 بونكتا في لمبة البلعوم الأمامي).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا باستخدام الأساليب التي عرضت هنا لتقييم الحيوانات كيف طويلة الأمد مع انخفاض IIS تعدل تجميع البروتين تعتمد على العمر. بالغربية لطخة (راجع الخطوة 2-2، سريعة استخراج البروتين غير قابلة للذوبان لتحليل لطخة غربية)، ونحن تحليله الإجمالي ومحتوى البروتين غير قابلة للذوبان من الشباب (اليوم 3 لسن البلوغ) والذين تتراوح أعمارهم بين (اليوم 18 سن الرشد) الديدان على التحكم [رني] وعلى [رني] استهداف الأنسولين/ منتدى إدارة الإنترنت-1-مثل مستقبلات داف-2. لاحظنا أي تغييرات كبيرة في مستويات البرو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ونحن التقرير منهجية لعزل البروتين عالية الذوبان المجاميع من الشيخوخة C. ايليجانس تعرض ل [رني] لتحليل الطيف الكتلي والنشاف الغربية. ونحن تبين أن تحسين بروتيوستاسيس بخفض IIS إلى حد كبير يحول دون تجميع البروتين تعتمد على العمر. عن طريق تحديد البروتينات المعرضة لتجميع معين أوفيريكسبريس في C. ايليجانس، فمن الممكن كذلك تشريح آليات تحوير تجميع البروتين المتأصلة.

تجميع الملازمة للعمر تعتمد على البروتين مقابل تجميع البروتين المرتبط بالمرض
ويستند هذا العمل الحال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من دزني وماري كوري منحة الإدماج الدولي (322120 إلى D.C.D.)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
قارورة ثقافة فرنباخ Corning4425-2XLPyrex ، سعة 2،800 مل ، مع 3 مسافات بادئة
غطاء برغي غشائي   ؛Schott1088655GL45
خلاط الجوزVWR444-0148
قمع منفصلNalgene4300-1000سعة 1,000 مل
1 مل حقنة   ؛BD Plastipak300013
إبرة رمادية ، 27 جم × ½ ؛ "، 0.4 مم × 13 ممBD Microlance 3300635
مرشحات غشاء 0.025 وميكرو ؛ إمميليبورVSWP04700
شريط الأس الهيدروجينيMachery-Nagel92110pH-Fix 0-14
روتشي4693132001أقراص كاملة صغيرة خالية من EDTA 
أوكتوكسينول-9 ApplichemA1388Triton X-100
4-حمض مورفولين إيثان سلفونيك (MES)سيجما ألدريتشM1317
نونيلفينيل بولي إيثيلين غليكولApplichemA1694Nonidet P40 (NP40)
DNaseIRoche04716728001مؤتلف وخالي
RNase محلول RNaseAPromegaA7973
تلطيخ لطخة البروتين الكليةThermofisherS11791Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel تلطيخThermofisherS12001Sypro Ruby بروتين هلام صبغة
TCEP (تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين هيدروكلوريد) Serva36970
يودوأسيتاميدسيرفا26710
أمونيوم بيكربوناتسيجما ألدريتش09830
تسلسل الصف المعدل التربسينPromegaV5111
علامات متساوية الضغط للكمية النسبية والمطلقةSciex4352135iTRAQ كواشف متعددة عدة
طرد مركزي Avanti J-26XPBeckmann Coulter393126
أجهزة الطرد المركزي الفائقة Optima Max-XPBeckmann Coulter393315
أجهزة الطرد المركزيEppendorf5404000413
جهاز طرد مركزي 5702Eppendorf5702000329
أجهزة الطرد المركزي Megafuge 40Rمكثف 75004518
حراري بالإضافة إلىمبخر الطرد المركزيEppendorf5305000304
مجهر ستيريو فلورسنت M165 FC & nbsp ؛لايكامع Planapo 2.0x موضوعي
تشريح مجهرLeica Leica S6E
مجهر التكبير العالي Zeiss Axio Observer Z1Zeissمع هدف PlanAPOCHROMAT 20x و Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image Analysis SoftwareImageJ
تحليل بيانات قياس الطيف الكتليProtein Prospectorhttp://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
<قوي>بكتريا قولونية سلالة< / قوية>
OP50CGC
<قوية > بكتيريا RNAi< / strong>
L4440مكتبة Julie Ahringer RNAi
C. elegans< / em> المسوخ < / قوي>
CF2253CGC ، اسم السلالة: EJ1158   ؛النمط الجيني: gon-2 (q388) < / em
> C. elegans < / em > الجينات المعدلة وراثيا < / strong>
DCD214مختبر ديلا ديفيد في DZNE T & uuml. النمطالجيني bingen: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
النمطالجيني bingen: daf-2 (e1370) III ؛ uqIs24 [Pmyo-2:: tagrfp: :p ab-1] < / em>
حاجز كوكتيل من أجهزة علميDCD215 مختبر ديلا ديفيد في DZNE Tü

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
  2. David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247(2012).
  3. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  4. Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
  5. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450(2010).
  6. Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
  7. Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
  8. Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
  9. Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311(2016).
  10. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
  11. Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
  12. Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
  13. Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725(2015).
  14. Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010(2016).
  15. Sulston, J. H. The Nematode Caenorhabditis elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
  16. Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
  17. Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
  18. Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
  19. Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
  20. Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
  21. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
  22. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964(2014).
  23. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
  24. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
  25. Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295(2008).
  26. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
  27. Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639(2009).
  28. Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101(2017).
  29. Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
  30. Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
  31. Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein AggregationCaenorhabditis elegansAge Synchronized WormsHighly Insoluble AggregatesGenetic KnockdownQuantitative Mass SpectrometryFluorescent Tagged ProteinsRAB Extraction BufferUltracentrifugationFormic Acid Solubilization

Related Articles