Method Article

المستندة إلى صفيف "مقارنة الجينوم التهجين منصة" "الكشف عن كفاءة من نسخ عدد الاختلافات" في طفرات "سريعة النيوترون" المستحثة فصة برميلية

DOI:

10.3791/56470

⸱

November 8th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول خطوات تجريبية ومعلومات حول الكواشف ومعدات وأدوات التحليل للباحثين الذين يرغبون في القيام بتحليل الجينوم كله التهجين الجينومي المقارن القائم على صفيف (CGH) لنسخ عدد الاختلافات في النباتات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هي طفرات لا تقدر بثمن من الموارد الوراثية للدراسات وظيفة الجينات. لإنشاء مجموعات متحولة، يمكن أن تستخدم ثلاثة أنواع من المطفرة، بما في ذلك البيولوجية مثل تي-دنا أو ينقول، أو الكيميائية مثل إيثيل ميثانيسولفوناتي (EMS) أو المادية مثل الإشعاعات التأين. نوع الطفرة لاحظ يتفاوت مطفر المستخدمة. للتأين الإشعاعي الناجم عن طفرات، تشمل طفرات الحذف أو الازدواجية، أو إعادة ترتيب. بينما يقتصر تي-دنا أو الطفرات ينقول المستندة إلى الأنواع التي عرضه للتحول، يمكن تطبيق الطفرات الكيميائية أو الفيزيائية لمجموعة واسعة من الأنواع. ومع ذلك، وصف الطفرات المستمدة من الطفرات الكيميائية أو الفيزيائية تقليديا يعتمد على خريطة نهجاً قائما على استنساخ، وهو العمل المكثف ومضيعة للوقت. وهنا نعرض أن منصة تهجين جينومي مقارن القائم على مجموعة (أكغ) عالي الكثافة جينوم يمكن تطبيقها على الكشف عن كفاءة وتميز الاختلافات نسخة رقم (كنفس) في طفرات المستمدة من الطفرات القصف (ليبونن) النيوترونات السريعة في فصة برميلية، أنواع البقول. تحليل تسلسل الجينوم كله يبين أن هناك جينات أكثر من 50,000 أو نماذج الجينات في م. برميلية. في طفرات الحالية، والتي يسببها ليبونن في برميلية م. مستمدة من أكثر من 150,000 خطوط M1، تمثل الموارد الوراثية لا تقدر بثمن للدراسات الفنية للجينات في الجينوم. منصة أكغ الموصوفة هنا أداة فعالة لوصف طفرات المستحثة ليبونن في م. برميلية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البقوليات (قرنيات) هي ثالث أكبر عائلة النباتات المزهرة، مع العديد من الأنواع الهامة اقتصاديا مثل فول الصويا (ماكس جليكاين) والبرسيم (فصة ساتيفا). نباتات البقول يمكن أن تتفاعل مع البكتيريا التربة النتروجين، تسمى عموما رهيزوبيا لتطوير العقيدات الجذرية التي ينخفض رابع الغلاف الجوي للأمونيا للاستخدام بالنبات المضيف. على هذا النحو، يتطلب إدخال القليل من الأسمدة النيتروجينية زراعة محاصيل البقول وهكذا تسهم الزراعة المستدامة. إنتاج محاصيل البقول الأوراق والبذور ذات محتوى عالي البروتين، تخدم كعلف ممتاز ومحاصيل الحبوب. ومع ذلك، أنواع البقول المزروعة عموما لديهم هياكل معقدة الجينوم، مما يجعل الدراسات الفنية من الجينات التي تلعب أدواراً رئيسية ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: الشكل 1 يبين الخطوات الخمس لمجموعة بروتوكول CGH. وهم: 1) إعداد المواد النباتية؛ 2) عزل عينات الحمض النووي ذات جودة عالية؛ 3) التالي وتنقية لعينات من الحمض النووي؛ 4) التهجين، الغسل، والمسح الضوئي من صفائف الجينوم كله؛ و 5) تحليل البيانات CGH. م. برميلية الجينوم كله بلاط صفائف تحتوي على ما مجموعة 971,041 المسابير اليغو فريدة من نوعها تستهدف 50,000 أكثر من الجينات أو نماذج الجينات في الجينوم (انظر الجدول للمواد). تحقيقات فريدة متباعدة تقريبا كل 150 زوج قاعدي (bp) في مناطق اكسونيك و 261 bp في مناطق الجينوم برميلية م. إينترونيك.

1-"إعداد المواد النباتية"

  1. سكاري....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 2 توزيع نسب2 سجل تم تسويتها للمسخ مقابل إشارات WT عبر الجينوم كله. وكشف تحليل للبيانات CGH التقريبي الحذف 22 كيلو بايت على كروموسوم 4 تشمل الجينات السونة كامل33 والعديد غيرها المشروح الجينات في الطور FN6191 (الشكل 2و الشكل 3). وغطت المنطقة المحذوفة المرشح 73 تحقيقات متتالية في الصفيف مع نسب2 سجل طبيعية يعني أقل من-2.5 (تكميلية.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قمنا بتطوير منصة CGH المستندة إلى الصفيف للكشف ووصف القصف النيوترونات السريعة (ليبونن)-التي يسببها طفرات في عام م. برميلية A17 جيمالونج. للتدليل على استخدام صفيف الأسلوب CGH في الكشف عن الطفرات الجينية، أجرينا تحليلاً أكغ للمسخ FN6191، التي عرضت النمط الظاهري فرط نودولاتيون خلافا للنباتات البرية نوع، عند تلقيح مع الرايزوبيوم س. Sm1021. لتحليل تجزئة، اعتبرت شريحة كبيرة إذا كان يعني أن نسبة2 سجل للتحقيقات داخل الجزء كان فوق العتبة العليا أو أدنى من عتبة أدنى لأن مقارنة المصفوفة المعطاة. الع.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل هو توفير التمويل جزئيا بمنحه من "جبهة الخلاص الوطني محطة أبحاث الجينوم" (دائرة الرقابة الداخلية--1127155).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Medicago truncatula < / em> مجموعة الجينوم ، 1 × 1 مAgilentG4123A
< م > Medicago truncatula < / em > FN6191 (متحول)في المنزلFN6191
< em > Medicago truncatula < / em > Jemalong A17 (مرجع)في المنزلA17
حامض الكبريتيكSigma-Aldrich320501
DNeasy Plant مجموعة صغيرةQiagen69104
مقياس الطيف الضوئي النانويThermo Scientific1000D
SureTag مجموعة وضع العلامات على الحمض النوويAgilent5190-3400
التمهيدي العشوائيAgilent5190-3399
AcetonitrileSigma-Aldrich271004-1L
ThermocyclerMJ researchPTC-200
الطرد المركزيLabnet international IncSpectrafuge 24D
حل التثبيت والتجفيفAgilent5185-5979
Oligo aCGH / ChIP-on-chip طقم التهجينAgilent5188-5380
حشية غرفة التهجينAgilentG2505
Human Cot-1 DNAAgilent5190-3393
Oligo aCGH / ChIP-on-chip Wash Buffer 1 و 2Agilent5188-5221
غرفة التهجين ، فرنAgilentG2534A
AgilentG2545A
أعمدة التنقيةAgilent5190-3391
ماسح ضوئي بالليزرRocheMS200
NimbleScan 2.6Roche خريطة إشارة Nimblegen5225035001
1.9خريطة إشارة Roche Nimblegen1.9
شرائح التهجين غير القابل للصدأ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312(2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Comparative Genomic HybridizationCopy Number VariationsFast Neutron BombardmentMedicago truncatulaArray based CGHDNA IsolationMicroarray HybridizationWashing BufferSpectrophotometer AnalysisSignal Mapping Software

Related Articles