مقالة منهجية

مصل وبلازما نسخة الكشف رقم PCR الوقت الحقيقي باستخدام

DOI:

10.3791/56502

⸱

ديسمبر 15, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذه المخطوطة نسخة رقم تحليل تباين أداؤها في الحمض النووي المصل أو البلازما باستخدام نهج PCR الوقت الحقيقي. هذا الأسلوب مناسبة للتنبؤ بمقاومة الأدوية في مرضى سرطان البروستاتا المقاوم الاخصاء، ولكن يمكن أن تكون مفيدة أيضا لأمراض أخرى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تبين الحمض الحر خلية البلازما والمصل (كفدنا) كمصدر للمعلومات، وغير الغازية من المؤشرات الحيوية لتشخيص مرض السرطان والتشخيص والرصد والتنبؤ بمقاومة العلاج. بدءاً من فرضية أن الحصول على الاندروجين الجينات مستقبلات (ع) نسخة رقم (CN) حدث متكرر في الاخصاء المنتشر مقاومة سرطان البروستاتا (مكربك)، ونقترح لتحليل هذا الحدث في كفدنا كالعلامات البيولوجية تنبؤية محتملة.

نحن تقييم CN ع في كفدنا استخدام فحوصات PCR الوقت الحقيقي مختلفة 2 و 2 إشارة الجينات (رناسيب و آغو1). كمية الحمض النووي من 60 استخدمت نانوغرام لكل تركيبة الإنزيم. AR وأكد مكسب CN استخدام PCR الرقمية كوسيلة أكثر دقة. تحليل التباين CN وقد ثبت بالفعل أن تكون مفيدة للتنبؤ بمقاومة العلاج في وضع مكربك، ولكن قد يكون من المفيد أيضا لأغراض أخرى في مختلف البيئات المريض. تحليل CN في كفدنا مزايا عديدة: غير الغازية وسريعة وسهلة لتنفيذ، ويبدأ من كمية صغيرة من المواد المصل أو البلازما.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعميم الخلية الحرة الحمض النووي (كفدنا) في الدم قد ثبت أن مصدر أمثل للمؤشرات الحيوية لتشخيص مرض السرطان والتشخيص والرصد والتنبؤ بمعاملة المقاومة1،2. وقد أظهرت العديد من الدراسات توافق جيد بين التعديلات الحمض النووي (الطفرات، نسخ عدد الاختلافات، تعديلات جينية في الأنسجة) وتلك التي عثر عليها في المقابل البلازما عينات1، تؤكد أن تعميم الورم الحمض النووي (كتدنا) مفيدة للورم الابتدائي والمنتشر الأنسجة التعديلات3. وبالتالي يتيح إمكانية دراسة كتدنا لإعادة بناء الجينومي ترتيبات جديدة والاختلافات (كنفس) نسخة رقم المسرطنة محددة4، تحديد خلايا الاستنساخ وسوبكلونال يحتمل أن المنتشر. وقد ثبت كتدنا سريرياً مفيدة خاصة لرصد علاج السرطان كما أنها تؤوي طفرات محددة وكنفس، المتعلقة بالعلاجات المستهدفة المحددة5،6. كما يتغلب على الحاجة خزعات الأنسجة ويسمح للنتائج يمكن الحصول عليها في أوقات مختلفة أثناء علاج سرطان محددة بطريقة غير الغازية.

فيما يتعلق بسرطان البروستاتا، ارتباط كبير بين تعميم الاندروجين خالية من الخلايا مستقبلات (ع) كنفس والعلاج استجابة ل abiraterone وانزالوتاميدي وقد ثبت، قد تكون تشير إلى AR الجينات عدد النسخ (CN) في كفدنا العلامات البيولوجية واعدة قادرة على التنبؤ بمعاملة المقاومة7،،من89،10،11. يمكن تقييم كنفس جينات محددة في كتدنا باستخدام نهج مختلفة مع حساسية مختلفة، والتكلفة، وسرعة (على سبيل المثال. بكر في الوقت الحقيقي، والرقمية، وتسلسل الجيل القادم).

هنا يصف لنا نهجاً بسيطاً وسريعا، استناداً إلى فحوصات مزدوجة في تكنولوجيا PCR الوقت الحقيقي، لتقييم CN ع في كفدنا من المصل والبلازما عينات7،8. ونحن نظر اثنان فحوصات PCR مختلفة مصممة في منطقتين مختلفتين من الجينوم داخل إنترون 5 ع (Xq12) واثنين من الجينات الأخرى، كمرجعية معيارية داخلية الجينات يعرف أن لها وضعا رقم نسخة عادية في سرطان البروستاتا (رناسيب، يقع في 14q11؛ قبل1، الموجود على 1 ف 34). نحن تحديد الجينات مرجعيتين، بدلاً من واحدة، زيادة الدقة والحساسية للنتائج. كمية الحمض النووي من 60 تم تضخيمه نانوغرام لكل تركيبة الإنزيم (مقايسة مجتمعة AR-assay_1 + رناسيب ول ع-assay_2 + AGO1). تجميع ثلاث عينات الحمض النووي المصل أو البلازما من الذكور الأصحاء وتستخدم معايرة. أننا اعتبرنا قطع من > 1.5 لكسب ع و < 0.5 للحذف. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها مرنة وأن جينات أخرى يمكن أيضا تقييم، تغيير الجينات القياسية المرجعية الداخلية، استناداً إلى نوع الورم وخصائصها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون البروتوكول من عزل الحمض النووي من عينات المصل أو البلازما لإجراء PCR الوقت الحقيقي لتحليل عدد النسخ. وأجريت استخراج الحمض النووي ومراقبة كمية الحمض النووي (جهاز المطياف الضوئي) PCR الوقت الحقيقي لأهداف محددة. وترد في الشكل 1، موجزاً للإجراءات والجدول الزمني.

البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة أخلاقيات البحوث البشرية IRST.

1-المصل جمع وتجهيز

  1. جمع حوالي 5 مل كل الدم في أنبوب مصل دون تخثر الدم للحصول على المصل. صيانة أنابيب الدم عند 4 درجة مئوية حتى التجهيز.
  2. أنابيب الطرد المركزي في 1,000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  3. نقل المصل بعناية في أنابيب 2 مل.
  4. تجاهل أنبوب جمع وفورا تجميد المادة طافية في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2-البلازما جمع وتجهيز

  1. جمع حوالي 10 مل كل الدم في أنبوب بلازما مع أدتا الحصول على البلازما. ملء الأنبوب تماما ومن ثم عكس ذلك 8 مرات. صيانة أنابيب الدم عند 4 درجة مئوية حتى التجهيز.
  2. الطرد المركزي الأنبوب في 1,800 س ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع لا وضع الفرامل على أجهزة الطرد المركزي.
  3. نقل الجزء العلوي من البلازما بعناية في أنابيب 2 مل. تكرار النقل، ترك 1 مل على الأقل من المادة طافية فوق طبقة الخلايا البيضاء.
    ملاحظة: نقل الجزء العلوي من المادة طافية يقلل من خطر التلوث بالخلايا أو الخلايا الحطام.
  4. تجاهل أنبوب جمع وفورا تجميد المادة طافية في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3-الحمض النووي في معزل عن المصل أو البلازما

ملاحظة: ينبغي إجراء عزل الحمض النووي من المصل أو البلازما باستخدام البروتوكول التجاري بتعديل في الخطوات التالية.

  1. ذوبان الجليد قاسمة واحدة (التي تتضمن من 0.5 إلى 2 مل) من المصل أو البلازما في درجة حرارة الغرفة.
  2. دوامة وخلط العينة ونقل 0.5 مل من المصل أو البلازما في أنبوب واضحة 1.5 مل. تجميد بقية المواد في-80 درجة مئوية.
  3. إضافة 50 ميليلتر من البروتيناز ك (20 ملغ/مل) مباشرة إلى العينة.
  4. إضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت لتحلل للعينة، ومزيج جيد من قبل بيبيتينج.
  5. إغلاق الأنابيب واحتضان عينات من 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في كتلة الحرارة.
  6. إضافة المبلغ المشار إليه من الإيثانول 100% في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 1 و 2، كما هو مبين بإرشادات الشركة المصنعة.
  7. جلب العينات إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة 0.5 مل إيثانول المطلقة ومزيج جيد من قبل بيبيتينج.
  8. إضافة ميليلتر 650 من الخليط التي تم الحصول عليها في الخطوة 3، 7 إلى عمود الفصل والطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
  9. الأنبوب الذي يحتوي على التدفق من خلال تجاهل ومكان العمود على أنبوب جمع نظيفة جديدة. كرر الخطوتين 3.8 و 3.9 مرة أخرى.
  10. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 1، دون ترطيب حافة العمود وأجهزة الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
  11. أنبوب يحتوي على التدفق من خلال تجاهل واستبداله بأنبوب جمع نظيفة جديدة.
  12. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2، دون ترطيب حافة العمود وأجهزة الطرد المركزي بالسرعة الكاملة (20,000 س ز) لمدة 3 دقائق.
  13. أنبوب يحتوي على التدفق من خلال تجاهل واستبداله بأنبوب جمع نظيفة جديدة.
  14. الطرد المركزي بالسرعة الكاملة (20,000 س ز) لمدة 3 دقيقة لإزالة أي مخزن مؤقت الغسيل المتبقية.
  15. مكان العمود في أنبوب نظيف 1.5 مل. إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف والانتظار 7 دقيقة التأكد من ذلك المخزن ويتس العمود.
  16. الطرد المركزي في 8,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
  17. "الماصة؛" الوت من الخطوة 3.16 مرة أخرى إلى نفس العمود وأجهزة الطرد المركزي بالسرعة الكاملة (20,000 س ز) لمدة 1 دقيقة لضمان استرداد الحد الأقصى من الحمض النووي.

4-الحمض النووي التقييم الكمي، وتمييع

  1. إجراء التحديد الكمي للحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي. استخدم 2 ميليلتر من العينة مقاعد البدلاء-أعلى جهاز المطياف الضوئي لإرشادات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: إذا كانت كمية الحمض النووي لا يكفي للمضي قدما مع بكر في الوقت الحقيقي (على الأقل 120 نانوغرام)، القيام بعملية جديدة لعزل الحمض النووي.
  2. تمييع الحمض النووي من المصل أو البلازما إلى 2.5 نانوغرام/ميليلتر في وحدة تخزين نهائي كافية لبكر كلها في الوقت الحقيقي (حوالي 50 ميليلتر).

5-في الوقت الحقيقي بكر

  1. ذوبان الجليد نسخ عدد فحوصات والفحص الجيني مرجع وعينات الحمض النووي تضعف وآله لفرز المجمعة في الجليد. حجته في درجة حرارة الغرفة ميكس الرئيسية التي يتم تخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد مزيج ميليلتر 1 المقايسة المستهدفة و 1 ميليلتر من الفحص الجيني مرجع 10 ميليلتر من مزيج الرئيسي ل replicates 3 من كل عينة وآله لفرز تجميع. إعداد مزيج بما في ذلك عنصر تحكم سلبي (المياه) وعينات إضافية 2.
  3. في لوحة 96 جيدا، الكوة ميليلتر 12 من المزيج في كل بئر. لا لا من أنابيب ماصة أو زيادة ونقصان.
  4. إضافة 8 ميليلتر (تركيز 2.5 نانوغرام/ميليلتر) لكل عينة من الحمض النووي وآله لفرز المجمعة في كل بئر. لا لا من أنابيب ماصة أو زيادة ونقصان. تغيير تلميح لكل بئر.
    ملاحظة: يمكن معالجة 30 عينة من الحمض النووي لكل تجربة في الوقت الحقيقي باستخدام لوحة 96-جيدا: عينات 30 x 3 + التحكم المجمعة + السلبية آلة لفرز 1 × 3 = 94.
  5. باختصار تدور أسفل اللوحة في 1,000 س ز.
  6. تشغيل لوحة استخدام بروتوكول التالية: عقد المرحلة على 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، دورات 40 في 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.

6-بيانات التحليل والتفسير

  1. في قسم "الخيار" أدناه نتائج المؤامرة التضخيم، تعيين عتبة Ct في 0.2 للجينات الهدف الأول تحليل. كرر المجموعة لكل الجينات المستهدفة أو مرجع. لتصدير ملف PCR الوقت الحقيقي في الملحق.txt، اضغط "تصدير" في شريط الأدوات. العلم فقط "النتائج" في التحديد البيانات المراد تصديرها ← اختيار كنوع ملف الملحق.txt ← الصحافة "بدء التصدير" ← إغلاق أداة التصدير.
  2. فتح برنامج التحليل واستيراد ملف.txt (استيراد ← شريط الأدوات).
  3. حدد اسم الملف لتحليل وتحديد إعداد التحليل بشريط الأدوات (رمز للعب).
  4. تحديد نموذج معايرة وعدد نسخ الهدف (مثلاً، 1 نسخة للجينات AR ) المعروفة. اضغط على "تطبيق".
  5. لكل نموذج، قم بحذف بئر واحدة مع دلتا مختلفة Ct (ΔCt) بالمقارنة بابار أخرى.
  6. رياناليزي التجربة (رمز تلعب الصحافة).
  7. تقييم النتائج حسب عدد نسخ شريط الأرض أو الجدول.
    ملاحظة: الجدول النتائج يحتوي على معلمات متعددة مثل الثقة والحرز Z replicates تحليل يمكن أن تكون مفيدة لتفسير النتائج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان تركيز مجموع كفدنا القابلة للقياس التي كانت لجميع العينات التي تم تحليلها، عرض متوسط من 6.12 نانوغرام/ميليلتر (النطاق: 2.00 23.71 نانوغرام/ميليلتر) لعينات مصلية ومتوسط من 3.21 نانوغرام/ميليلتر (النطاق: 2.31-8.49 نانوغرام/ميليلتر) لعينات البلازما. قمنا بتحليل ما مجموعة 115 عينات من تجارب بكر في الوقت الحقيقي.

تم تقييم حساسية الاختبار باستخدام الحمض النووي مختلطة المصل من المرضى مع كسب عالية أو منخفضة ل AR، والحمض الن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AR تحليل CN في عينة مصل وبلازما يمثل نهجاً جديداً غير الغازية للتقسيم الطبقي لمرضى سرطان البروستاتا المقاوم الاخصاء (قانون الإجراءات الجنائية). وقد ثبت مؤخرا أن CN ع غير قادرة على التنبؤ بالنتائج في قانون الإجراءات الجنائية المرضى الذين عولجوا مع abiraterone وانزالوتاميدي، قبل وبعد العلاج الكيميائي7،8،،من910.

الميزة الرئيسية للنهج الذي نتبعه أن البر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر كيارا موليناري وفيليبو مارتيجنانو لتقديم الدعم في مجال تحليل البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب مصل BD VacutainerBecton Dickinson367814أنبوب دم كامل للمصل
BD Vacutainer EDTA TubesBecton Dickinson366643أنبوب دم كامل للبلازما
الإيثانول المطلقVWRيمكن للمستخدم استخدام أيضا شركات أخرى
TaqMan مقايسة رقمنسخ Thermo Fisher Scientific4400291فحوصات مصممة مسبقا والتحقق من صحتها باستخدام صبغة FAM. استخدمنا المقايسة التالية: AR_assay1: hs04107225 و AR_assay2: hs04511283
TaqMan مقايسة رقم النسخ (معدلة)Thermo FisherScientific 4467084اختبار مصمم مسبقا تم تعديله باستخدام صبغة VIC: AGO1: Hs02320401_cn
TaqMan رقم نسخ الفحص المرجعي ، الإنسان ، RNase PThermo Fisher Scientific4403326
TaqMan Universal PCR Master MixThermo Fisher Scientific4326708مزيج رئيسي لمجموعة أدوات PCR
QIAamp DNA Mini Time (50)Qiagen51304مجموعة استخراج الحمض النووي
MicroAmp 96-Well PlatesThermo Fisher ScientificN8010560لوحات لوقت realt PCR
NanoDrop 1000 مقياس الطيفالضوئي الحراري فيشر العلمي-يمكن للمستخدم أيضا استخدام طرق قياس الطيف الضوئي الأخرى لتحديد الحمض النووي
7500 نظامPCR سريع في الوقت الحقيقيالنظام الحيوي التطبيقي-يمكن للمستخدم استخدام أيضا أداة أخرى في الوقت
الحقيقي CopyCaller SoftwareApplied Biosystem-Softwareلتحليل رقم النسخ

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
  2. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
  3. Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
  4. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
  5. Diaz, L. A. Jr, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
  6. Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
  7. Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
  8. Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
  9. Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
  10. Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
  11. Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
  12. Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
  13. Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة