هنا، نحن نقدم بروتوكول لعزل الماوس كله، سليمة الغدد الثديية للتحقيق في المصفوفة خارج الخلية (ECM) التعبير ومورفولوجيا الأقنية. الغدد البطن الماوس #4 استخرجت من الفئران موتهم الإناث 8-10 الأسبوع القديمة، ثابتة في الفورمالين مخزنة محايدة ومقطوع والملون باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري للبروتينات إدارة المحتوى في المؤسسة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الغدد الثديية الماوس سليمة، وكلها لتحليل التعبير المصفوفة خارج الخلية ومورفولوجية الغدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وكان الهدف من هذا الإجراء لحصاد الغدد الثديية البطن #4 من الإناث من الفئران موتهم من أجل تقييم التعبير إدارة المحتوى في المؤسسة، والهندسة المعمارية الأقنية. وهنا جيب صغير تحت الجلد تم إنشاؤه باستخدام مقص مايو كلينيك، السماح بفصل الغدد داخل الأنسجة تحت الجلد من الصفاق الكامنة. وساعد في التصور الغدد باستخدام 3.5 x-R الجراحية الصغرى الصفائحي. قذف كان مقلوب ويعلق مرة أخرى تحديد السماح لمنصات الدهون الثديية سليمة. وكان تشريح كل الغدد البطن #4 صراحة بانزلاق شفرة المبضع أفقياً بين طبقة تحت الجلد والغدد. فورا بعد الحصاد، ووضعت الغدد في 10% فورمالين مخزنة محايدة لمعالجة الأنسجة اللاحقة. استئصال غدة كامل مفيد لأنه يقضي على الدرجة الأولى خطر استبعاد هامة على مستوى الأنسجة التفاعلات بين الخلايا الظهارية الأقنية وغيرهم من السكان الخلوية ميكرونفيرونمينتال التي يمكن أن تضيع في خزعة جزئية. عيب واحد من المنهجية هو استخدام مقاطع المسلسل من الأنسجة الثابتة مما يحد من تحليلات للأقنية التعبير morphogenesis والبروتين إلى مواقع منفصلة داخل الغدة. على هذا النحو، تغييرات في التعبير الهندسة المعمارية والبروتين الأقنية في 3 الأبعاد (3D) لا يسهل الحصول عليها. عموما، الأسلوب المطبق للدراسات التي تتطلب الغدد الثديية موريني أسرة سليمة للتحقيقات المصب مثل سرطان الثدي أو morphogenesis الأقنية التنموية.
المقدمة
سرطان الثدي يتسم بدرجة كبيرة من أنسجة التليف1،2،،من34. يشار إلى إدارة المحتوى في المؤسسة، هذا الكيان غير الخلوية توجد بدرجات متفاوتة في جميع الأنسجة وتتكون أساسا من ميشوورك معقدة من كولاجينس فيبريلار وغير فيبريلار، الايلاستين، وجليكوبروتينس بالإضافة إلى جزيئات مختلفة مما يشير إلى أن المحتبسة في هذه المصفوفة. تحت شروط التماثل الساكن، ترسب وتدهور لإدارة المحتوى في المؤسسة مراقبة شديدة. 5 خلال tumorigenesis الثدي، هو تعطل توازن الترسيب إدارة المحتوى في المؤسسة والتدهور. على هذا النحو، أبلغ عن أورام الثدي للتعبير عن البرو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان في هذا البروتوكول تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لكلية فيلادلفيا للطب التقويمي وأجريت جميع التقنيات تحت صارمة مبادئ توجيهية أخلاقية.
1-نموذج الشراء والتجهيز
- حدد موضوع الحيوانات المناسبة والمكان إلى غرفة 2 CO. لهذه التجربة، استخدم الأسبوع 8-10 B6 موتهم الإناث القديمة. Cg-Cav1tmMIs/ي و C57BI/6J-
- بدوره على تدفق الغاز بنسبة 30-40%. بمجرد أن الحيوان ظاهر وعيه بعد حوالي 2 دقيقة، فتح صمام الغاز للضغط الكامل لأدنى 5 إضافية
ملاحظة: تأكيد وفاة الحيوان عن طريق مراقبة علامات مرئية للتنفس (مثل حركة الصدر) لمدة 10 دقائق بعد وق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد الفئران الإناث 5 أزواج من الغدد الثديية. على وجه التحديد، هناك زوج واحد من الغدد عنق الرحم (#1)، اثنين من أزواج من الغدد الصدرية (#2 و #3)، زوج واحد من البطن الغدد (#4)، و 1 زوج من الغدد الاربية (#5) (الشكل 1أ). هنا، نحن معزولة في الغدد #4 كما يمكن تحديدها بسهولة. وفي بعض الظروف، الغدد #4 و #5 عزلت معا كما كان من الصعب التمييز بين الأمرين. لعزل سليمة #4 البطن الغدد الثديية، قذف المثبتة ومفصولة بعناية من الصفاق الكامنة، كشف موقع الغدد #4 ي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في الورقة، التي وصفناها تقنية لعزل الغدد الثديية الماوس سليمة لإجراء تحاليل نسيجية المصب التعبير إدارة المحتوى في المؤسسة ومورفولوجيا الأقنية. فيما يتعلق بتحليلات مورفولوجية الأقنية، تمكن هذه المنهجية التحقيق السريع في الأقنية العمارة أساس الخروج من أقسام نسيجية الملون. طرق أخرى لتحليلات الأقنية تعتمد على حقن الأصباغ لتمكين التصور شجرة الأقنية، الأساليب التي قد تكون من الناحية الفنية صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً.
الإصابة بسرطان الثدي، أبلغ إدارة المحتوى في المؤسسة أن تكون غير طبيعية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
الكتاب يود أن ينوه وايلز نيسان/أبريل والدكتور روجيه بروديرسون للمساعدة مع نيكروبسي الحيوانية وغده العزلة، على التوالي. التمويل اللازم لهذا العمل وأيد مراكز "فيلادلفيا كلية الطب التقويمي" "اضطرابات مزمنة من الشيخوخة".
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المجهر الضوئي | أوليمبوس | BX43 | |
| كاميرا مجهر | أوليمبوس | DP73 | |
| برنامج تحليل الصور | أوليمبوس | سيلسين برنامج | |
| المعاهد الوطنية | للصحة ImageJ | ||
| 3.5x-R العدسات الدقيقة الجراحية | الورد حلول | التكبير حسب تفضيل الباحث | |
| مايو كليو مقص | Medline | DYND04035 | |
| تلطيخ الرف | فيشر Scientific | 121 | |
| طبق تلطيخ | فيشر Scientific | 112 | |
| برطمانات كوبلن | فيشر Scientific | 19-4 | |
| أغطية زجاجية | Fisher Scientific | 12-550-15 | الحجم المناسب للأنسجة |
| IHC EnVision + Kit (HRP ، Mouse ، DAB +) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y ، مدمن على الكحول | سيجما ألدريتش | HT110132 | |
| هاريس هيماتوكسيلين | سيجما ألدريتش | HHS16 | |
| مصل الحمار | EMD Millipore | S30 | |
| 10٪ فورمالين محايد | مخزن سيجما | ألدريتش HT501128 | |
| الزيلين ، كاشف الصف | سيجما ألدريتش | 214736 | |
| الإيثانول ، 200 دليل | على سيجما ألدريتش | 792780 | مناسب للبيولوجيا الجزيئية |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، 1x | جيبكو | 10010023 | |
| سترات الصوديوم | فيشر Scientific | S279-500 | |
| كربونات الكالسيوم | سيجما ألدريتش | 202932 | |
| دائم تصاعد متوسط | Dako | S1964 | |
| Eukitt تصاعد متوسط | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| الجسم المضاد للفيبرونيكتين | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C الجسم المضاد | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin الجسم المضاد | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision نظام الارتباط المزدوج HRP | Dako | ك 4065 |
المراجع
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).
- Provenzano, P. P., ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
