Method Article

بروتوكول ديسيلولاريزينج كوكليا الماوس لهندسة الأنسجة الإذن الداخلية

DOI:

10.3791/56523

⸱

January 1st, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من هذا البروتوكول إظهار وسيلة فعالة ديسيلولاريزي وديكالسيفي كوكليا الماوس للاستخدام السقالات لتطبيقات هندسة الأنسجة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الثدييات، وخلايا الشعر ميتشانوسينسوري التي تيسر الاستماع الافتقار إلى القدرة على التجدد، التي حدت من العلاجات لفقدان السمع. استراتيجيات الطب التجديدي الحالية تركز على زرع الخلايا الجذعية أو التلاعب بالجينات المحيطة بدعم الخلايا في الإذن الداخلية لتشجيع استبدال التالف من الخلايا الجذعية لتصحيح السمع. ومع ذلك، المصفوفة خارج الخلية (ECM) قد تلعب دوراً حيويا في حفز والحفاظ على وظيفة خلايا الشعر، ولم يجر التحقيق فيها جيدا. استخدام cochlear إدارة المحتوى في المؤسسة سقالة لزراعة الخلايا الجذعية البالغة قد يوفر رؤى فريدة من نوعها في كيفية تكوين والهندسة المعمارية للبيئة خارج الخلية الإيدز الخلايا في الحفاظ على وظيفة السمع. هنا نقدم طريقة لعزل وديسيلولاريزينج كوتشلياي من الفئران لاستخدامها بمثابة السقالات قبول perfused الخلايا الجذعية البالغة. في البروتوكول الحالي، كوتشلياي يتم عزل من الفئران euthanized، ديسيلولاريزيد، وديكالسيفيد. بعد ذلك، تم بعناية perfused جيلي الخلايا البشرية وارتون (هوجكس) التي كانت معزولة من الحبل السري في كل قوقعة الإذن. واستخدمت في كوتشلياي كالمفاعلات الحيوية، وتم استزراع الخلايا لمدة 30 يوما قبل أن يخضع لتحليل تجهيز. كوكليا ديسيلولاريزيد الاحتفاظ بهياكل خارج الخلية يمكن تحديدها، ولكن لم يكشف عن وجود خلايا أو ملاحظته شظايا من الحمض النووي. اجتاحت معظم الداخلية والخارجية للقوقعة الخلايا perfused إلى القوقعة ونمت دون وقوع أي حادث خلال مدة 30 يوما. وهكذا، يمكن استخدام الأسلوب الحالي لدراسة كيف cochlear التنمية الخلية يؤثر على المحتوى والسلوك.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القوقعة بنية معقدة دوامة موجودة في العظم الصدغي. وهو يتألف متاهة عظمى خارجي و متاهة membranous متحدة المركز، والداخلية1. متاهة ميمبرانوس يتكون من ثلاثة ممنوع السوائل: فيستيبولي سكالا، سكالا وسائط الإعلام، و حبل سكالا1. دور وسائط الإعلام سكالا ظهارة الحسية، التي تتألف من العديد من أنواع الخلايا، ولكن خلايا الشعر الحسية (المفوض السامي)، الذي ترانسدوسي الطاقة الميكانيكية في الموجات الصوتية للنبضات العصبية2، تتسم بأهمية خاصة. التعرض للصدمات الصوتية3،،من45،6من الدواء والمرض7،8والشيخوخة9 كل ما يمكن أن يؤدي وظيفة السمع البصر عن طريق الإعدام المفوض السامي. فقدان خلايا الشعر في الثدييات دائمة، على عكس HCs إنفلونزا الطيور، التي يمكن تجديدها بعد إصابة10.

مجموعة متنوعة من الجهود البحثية المعاصرة سعت إلى استعادة HCs المفقودة، على الرغم من اختلاف النهج التجريبية المحددة. التلاعب بالجينات في ظهارة الحسية وزرع الخلايا الجذعية التي ميزت خارج الجسم هي النهج السائد في الميدان، على الرغم من أن قد تم طرق الاستقراء التي تسعى إلى التفريق بين الخلايا الجذعية في cochlear أورجانويدس حاول11،،من1213. كل من هذين النهجين أما يعتمد مباشرة على الخلايا الجذعية، أو العظة التنموية المستخدمة من قبل الخلايا الجذعية؛ بيد أن المشتركة ثانية، ويحتمل أن تكون حاسمة، هو عنصر إدارة المحتوى المؤسسي للقوقعة نفسها14،15.

إدارة المحتوى في المؤسسة لا يوفر الدعم المادي للخلايا والأنسجة، والتي تشمل سطح لالتصاق الخلايا وانتشار، والبقاء على قيد الحياة، والهجرة، ولكن أيضا تلعب أدواراً حاسمة في تطوير HCs ودوامه العقدة15،16 ،17. وبطبيعة الحال يوفر إدارة المحتوى في المؤسسة التي تحدث إشارات الاستقرائية التي قد توجه تحديد النمط الظاهري الخلية و/أو خلية التصاق وانتشارها، وبقاء18. ونتيجة لذلك، استخدام القوقعة ديسيلولاريزيد في تركيبة مع هوجكس المستزرعة توفر فرصة فريدة لاستكشاف دور تجديد إدارة المحتوى في المؤسسة، والمفوض السامي. هوجكس هي نوع خلية متاحة بسهولة، وغير مثيرة للجدل المعزولة من حبل السرة البشرية التي تتصرف مثل الخلايا الجذعية الوسيطة19. وقد أظهرت هوجكس القدرة على التفريق بين أسفل الخلية الحسية الأنساب20،21. وهكذا، تفاصيل البروتوكول الحالي العزلة، وديسيلولاريزيشن، ونضح من كوكليا من جثث الماوس C57BL مع هوجكس للهندسة أنسجة الإذن الداخلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت جميع الإجراءات، بما في ذلك القتل الرحيم الحيوان، وفقا للموافق عليها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) البروتوكول (أكوب #2014-2234) في المركز الطبي جامعة كانساس (كومك).

ملاحظة: هوجكس كانت معزولة من الحبال السرة البشرية التي كانت تبرعت بها المرضى التي قدمت المستنيرة واستخدمت العينات وفقا للبروتوكولات التي أقرتها اللجنة مواضيع البشرية جامعة كانساس (15402 # كو-مجلس الهجرة واللاجئين).

1-العظم الصدغي الحصاد والعزلة القوقعة

  1. قطع رأس ماوس euthanized على نحو ملائم، وعمرها 15 عاماً في الأسبوع بالقطع بين الجمجمة وأول فقرة عنق الرحم مع زوج حادة من مقص الجراحة، ثم رش أسفل الرأس مع الإيثانول 70% لتطهير (الشكل 1A).
  2. تقسم الجمجمة في طائرة منتصف السهمي استخدام نفس زوج حادة مقص جراحي (الشكل 1B-ج، خطوط متقطعة).
  3. إزالة أنسجة المخ من الجمجمة باستخدام زوج من الملقط (الشكل 1، رأس السهم).
  4. تحديد العظم الصدغي من خلال وجود السمع وجذور الأعصاب دهليزي (الشكل 1E-F، رؤوس الأسهم) في داخل الجمجمة وقناة الإذن من الخارج (الشكل 1F، السهم). قص بعناية من خلال الجمجمة لعزل العظم الصدغي من الجزء المتبقي الجمجمة (الشكل 1).
    ملاحظة: في بعض الحالات، قد يكون ممكناً دقة نقب عظام الجمجمة بعيداً عن العظم الصدغي المحيطة بها دون الحاجة إلى قطع.
  5. إدراج الملقط غرامة في فتح قناة الإذن حوالي 5 ملم (الشكل 1 ح)، حيث لا خطر النصائح ثقب القوقعة. كسر برفق فتح العظام الفقاعة (الشكل 1 ح، أعلى المنطقة المظللة بالأحمر) حيث أنها كسور (الرقم 1I، أحمر منقط الخط).
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، مجهر تشريح يمكن أن تساعد في هذه العملية لضمان وضع دقيق والتلاعب بالصكوك.
  6. استخدام الملقط غرامة، حدق بعيداً ما تبقى الفقاعة من العظم الصدغي، فضح متاهة عظمى من القوقعة (1J الشكل، الأقواس الحمراء).
  7. ضع طبق بتري كبير بما فيه الكفاية لاحتواء العظم الصدغي (مثلاً، 30 ملم أو أكبر) تحت تشريح نطاق مجال الرؤية وملئه بما يكفي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لتغطية العظم الصدغي (مثلاً، مل 0.5 إلى 1).
  8. غمر العظم الصدغي مع الفقاعة إزالة في برنامج تلفزيوني مع نوافذ بيضاوية وجولة القوقعة مواجهة.
    ملاحظة: إزالة النظام الدهليزية من القوقعة ليس من الضروري، كما النظام الدهليزية يخدم أيضا كمؤشر للتلاعب وتوجيه ملامح القوقعة (الرقم 1I و الشكل 2).
  9. استخدام زوج جيد جداً من الملقط، إزالة الشريان ستابيديال، الذي يمر stapes.
  10. إدراج تلميح واحد من الملقط غرامة فائقة من خلال قوس stapes حيث مرت الشريان، ودقة رفع stapes إلى أعلى. وينبغي رفع stapes ديسارتيكولاتيد الخروج من الإطار البيضاوي.
  11. استخدام تلميح واحد من الملقط غرامة فائقة، الثقب البيضاوي وجولة windows.
  12. استخدام برنامج تلفزيوني س 1 ملء محقنة قياس 28.5 مع أنابيب (القطر الداخلي 0.28 ملم، القطر الخارجي مم 0.61) المرفقة، ضع الأنبوب فوق الإطار البيضاوي (الشكل 2A -ب).
    ملاحظة: فتح الأنبوب يمكن التلاعب بها باستخدام الملقط غرامة فائقة مما يساعد على ضمان وضع دقيق.
    1. استخدام المحاقن الطازجة وأنابيب لكل قوقعة الإذن.
  13. نتخلل 2 مل 10% مضاد حيوي فطري (المضادة مكافحة) و 10% البنسلين-ستربتوميسين (القلم-بكتيريا) في برنامج تلفزيوني عن طريق القوقعة ما يزيد على 5 دقائق لإزالة في perilymph. بيرفوسينج سريع جداً مع الكثير من الضغوط ستؤدي إلى الأضرار الهياكل الدقيقة داخل القوقعة.
    ملاحظة: يدوياً القيادة المحاقن باليد نتخلل السوائل عن طريق القوقعة فعالة، على الرغم من أن مضخة التروية يمكن أن تستخدم كبديل لذلك.
    1. إذا بيرفوسينج يدوياً، استخدام زوج من الغرامة، ذاتية الإغلاق الملقط على استقرار القوقعة (الشكل 2A) أثناء التروية باستيعاب الجزء الدهليزية من العظم الصدغي.
      ملاحظة: على الرغم من أن ليس مطلوباً، وهذا يترك كلتا يديه مجاناً للتعامل مع الصكوك؛ جهة يمكن أن تدفع المحاقن (الشكل 2A) بينما أخرى يمكن وضع الأنابيب على النحو المناسب (الشكل 2).
    2. من هذه الخطوة إلى الأمام، والحرص على تجنب تعريض القوقعة دون داع إلى الهواء. إدخال فقاعات الهواء في المسافات السوائل بحظر تداول السوائل، وسيضر تجفيف المزيد الهياكل الدقيقة داخل القوقعة.
  14. إزالة وتجاهل أي المتبقية العضلات العظام والأنسجة الأجزاء باستخدام الملقط غرامة.
  15. إذا لزم الأمر، تخزين كوكليا معزولة في 4 درجات مئوية في مكافحة المضادة نسبة 10% والحل القلم-بكتيريا 10% في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى سبعة أيام مع التغييرات العادية في حل المضادات الحيوية كل 48 ساعة.

2-cochlear التجهيز

  1. ديسيلولاريزيشن
    1. لكل القوقعة، كبريتات ملء قنينة زجاج 20 مل التﻷلؤ مع دوديسيل صوديوم 1% (SDS) الحل في إزالة المتأين (DI) المياه، الذي يستخدم في ديسيلولاريزي القوقعة.
    2. قص غيض قبالة ماصة بلاستيك 7 مل نقل استخدام شفرة حلاقة حتى لا يكون كبيرا بما يكفي لقوقعة الإذن المرور من خلال فتح.
    3. استخدام ماصة نقل، برفق وضع القوقعة إلى ماصة حيث يمر فقط على حافة وقف إنتاج المواد الانشطارية قبل بضعة ملليمترات.
    4. طرد القوقعة إلى القنينة التﻷلؤ مملوءة بحل الحزب الديمقراطي الصربي 1%.
    5. تعميم 2 مل من الحزب الديمقراطي الصربي 1% في الماء (دي) دي المتأين عن طريق القوقعة في القنينة التﻷلؤ استخدام ماصة نقل.
    6. ضع القنينة التﻷلؤ في دوار، وتسمح القنينة التﻷلؤ لتدوير 10 لفة في الدقيقة ح 72 في درجة حرارة الغرفة.
      1. تغيير حل الحزب الديمقراطي الصربي 1% كل 24 ساعة على مدى فترة ح 72. العناية عند تغيير الحزب الديمقراطي الصربي لفضح القوقعة للهواء ابدأ.
    7. أغسل القوقعة ثلاث مرات عن 30 دقيقة مع المياه دي.
أداء يغسل في نفس القنينة التﻷلؤ المستخدمة لرسوم مخزونات النشر الاستراتيجي؛ وفي هذه المرحلة، هو ديسيلولاريزيد القوقعة.
  • ديكالسيفيكيشن
    1. إزالة المياه دي المتبقية من القنينة التﻷلؤ، وترك ما يكفي لإبقاء القوقعة المغمورة.
    2. لبدء ديكالسيفيكيشن، إضافة 5 مل حمض الإيثيلين 10% (يدتا) (0.02 M) في المياه دي التﻷلؤ القنينة التي تحتوي على القوقعة.
    3. تعميم 2 مل يدتا 10% في المياه دي عن طريق القوقعة في القنينة التﻷلؤ باستخدام ماصة نقل.
    4. مكان القنينة التﻷلؤ في محور دوار، والسماح للقنينة التﻷلؤ لتدوير 10 لفة في الدقيقة ح 72 في درجة حرارة الغرفة. تغيير الحل يدتا 10% كل 24 ساعة على مدى فترة ح 72. العناية عند تغيير الحلول حيث أن القوقعة لا يتعرض للهواء.
    5. شطف القوقعة 3 مرات ل 2 ح مع برنامج تلفزيوني 1 x؛ وفي هذه المرحلة، هو ديكالسيفيد القوقعة.
  • تخزين
    1. تخزين كوتشلياي ليصل إلى 72 ساعة في 10% مكافحة المضادة، 10% بكتيريا قلم حلاً في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قد تكون أطول من فترات التخزين ممكن مع التغييرات العادية في حل المضادات الحيوية؛ ومع ذلك، لا تم التحقق من تخزين ممتدة من كوكليا المجهزة في هذا البروتوكول.

    • 3-المشتريات وتوسيع هوجكس

    1. عزل هوجكس وفقا للبروتوكولات المنشورة سابقا22. بإيجاز، الجزء السري الحبال إلى أقسام 3 سم.
    2. بعناية تجعل الطول شق ضحلة مع مشرط على كل قطعة من الحبل السري لإلغاء وفضح جيلي وارتون الحبل السري. استخدام الملقط لإزالة الأوعية الدموية.
    3. تغسل شرائح الحبل السري مرتين مع برنامج تلفزيوني كافية (مثلاً، 40 مل في 60 مم طبق بيتري) إلى غمر الأنسجة. فرم ناعما شرائح الأنسجة مع مشرط. هضم الأنسجة في 100 مم طبق بيتري مع 50 مل متوسطة الهضم (كولاجيناز نوع 2 0.2 ٪، 1 ٪ البنسلين والستربتوميسين، في انخفاض الجلوكوز المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو)).
    4. وضع الأنسجة في هضم المتوسطة في شاكر مداري 50 لفة في الدقيقة بين عشية وضحاها في 5% CO2، حاضنة 37 درجة مئوية. وفي اليوم التالي تضعف الهضم المتوسطة بنسبة 01:16 في المائة 2 مضاد حيوي فطري في برنامج تلفزيوني، وبيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز 500 x في درجة حرارة الغرفة (~ 27 درجة مئوية) للمادة 10 دقيقة تجاهل طافية.
    5. ريسوسبيند الكريات في متوسط نمو الخلايا الجذعية الوسيطة (مسكجم) وإعادة تجميع الخلايا. تعامل الخلايا لوحة في كثافة 7 × 103 خلايا/سم2 في زراعة الأنسجة قوارير T-75. الثقافة هوجكس في مسكجم، وتوسيع لمرور 5 للتجارب.
      ملاحظة: هوجكس قد تكون شبه مثقف في قوارير تي أكبر (مثلاً، T-150، T-300) عند باساجينج لزيادة غلة هوجكس للتجارب.

    4-ضخ هوجكس في "كوتشلياي ديسيلولاريزيد"

    1. إعداد كوتشلياي ديسيلولاريزيد
      1. باستخدام تقنية معقمة، أغسل كوتشلياي المخزنة في برنامج تلفزيوني 1 x ثلاث مرات لكل 30 دقيقة.
      2. نقل كوتشلياي إلى آبار منفصلة من صفيحة 24-جيدا، وإضافة 1 مل من 37 درجة مئوية قبل استعد مسكجم.
      3. احتضان كوتشلياي في 5% CO2, 37 درجة مئوية خلية ثقافة حاضنة للحد ني ح 1 قبل ضخ للخلايا.
    2. فصل هوجكس وريسوسبيند
      1. أغسل هوجكس مع 37 درجة مئوية قبل استعد 1 x PBS مرتين.
      2. إضافة ما يكفي 37 درجة مئوية قبل استعد التربسين مع يدتا 0.5% لتغطية سطح السفينة الخلية.
      3. احتضان هوجكس لمدة تصل إلى 5 دقائق في 5% CO2, 37 درجة مئوية خلية ثقافة حاضنة.
        1. تحقق من أن فصل 90% خلايا من سطح الثقافة الخلية عن طريق عرض الخلايا تحت مجهر مقلوب.
          ملاحظة: فصل الخلايا التي تتحرك عندما يتم استغلالها السفينة الثقافة بلطف،. وقد فصل الخلايا التي تظل ثابتة، لا.
        2. اضغط برفق جانبي قارورة كذلك إزاحة الخلايا المرفقة.
      4. باستخدام تقنية معقمة، هوجكس نقل من سفينة الثقافة إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل الذي يحتوي على وحدة تخزين ما يعادل من مسكجم لحجم التربسين المستخدمة لفصل الخلايا.
      5. بيليه هوجكس طريق سينتريفوجينج في 500 غرام x في درجة حرارة الغرفة (~ 27 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
      6. نضح المادة طافية، وريسوسبيند هوجكس في مسكجم بتركيز 500,000 خلايا/مل.
    3. نتخلل كوتشلياي
      1. نقل كوتشلياي إلى لوحة 24-بئر جديدة باستخدام ماصة نقل.
      2. إضافة قطره مسكجم لكل قوقعة الإذن لمنع أي القوقعة من الجفاف.
      3. دقة توجيه القوقعة استخدام الملقط غرامة فائقة بحيث تواجه النوافذ البيضاوي وجولة.
        ملاحظة: اتخاذ الحذر الشديد عند التعامل مع كل القوقعة مباشرة كما هو تلف القوقعة بسهولة.
      4. استخدام المحاقن معقمة 28.5-قياس الأنسولين مع أنابيب متصلة، رسم يصل 0.2 مل حراكه هوجكس (100,000 الخلايا).
      5. استخدام الملقط المعقم غرامة، ضع أنابيب الإطار البيضاوي.
      6. دقة وبطء نتخلل القوقعة مع 0.2 مل من حراكه هوجكس استخدام حقنه الأنسولين 28.5-قياس متصلة بأنابيب البولي إيثيلين (القطر الخارجي: 0.61 ملم، و "قطرها الداخلي": 0.28 ملم) على مدى ما يقرب من 5 دقائق.
      7. بعد نضح، إضافة 0.8 مل 37 درجة مئوية قبل استعد مسكجم تتضمن أيضا القوقعة لتحقيق الحجم الإجمالي في البئر إلى 1 مل.
      8. كرر الخطوات 4.3.3-4.3.7 لكل القوقعة، استخدام المحاقن طازجة والأنابيب في كل مرة.
      9. مكان perfused كوتشلياي في 5% CO2, 37 درجة مئوية خلية ثقافة حاضنة، وتغيير وسائل الإعلام ثلاث مرات في الأسبوع.

    5-القوقعة الحصاد والحفاظ عليها

    ملاحظة: كوتشلياي قد يكون مثقف وتحصد في أي وقت تصل إلى 30 يوما بعد انتهاء التروية.

    1. للحفاظ على كوتشلياي، إصلاح في بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني س 1 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على منصة هزاز.
    2. بعد التثبيت، يغسل كوكليا مع برنامج تلفزيوني 1 x ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.
    3. تدريجيا يذوي القوقعة مع الإيثانول وواضحة مع المذيبات هيدروكربونية الاليفاتيه قبل تضمينها في البارافين.
    4. قسم العينات بسمك 10 ميكرون باستخدام مبضع وجبل على الزجاج شرائح المجهر.
      ملاحظة: نماذج جاهزة الآن لغذائها أو تجهيز المناعي باستخدام البروتوكولات القياسية.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    باستخدام الأساليب المعروضة هنا، قيمت ديسيلولاريزيشن ناجحة من كوكليا قبل دراسة وجود أو غياب الحمض النووي عن طريق 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) تلطيخ. واعتبرت كوكليا ديسيلولاريزيد تماما إذا لم يتم تحديد هوية الحمض النووي داخل القوقعة ديسيلولاريزيد. القوقعة أصلية من تجربة سابقة والتي لم تطرأ ديسيلولاريزيشن أو ديكالسيفيكيشن كعنصر إيجابي لتوضيح الهياكل والخلايا الموجودة تقليديا في القوقعة ماوس C57BL. القوقعة ديسيلولاريزيد-ديكالسيفيد، الذي لم يكن لديه أي هوجكس غرست، استخدمت كعنصر سلبي. ...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    لقد أظهرنا بنجاح أن يمكن إزالة الخلايا cochlear الأصلية من القوقعة عبر عملية ديسيلولاريزيشن، الذي يسمح باستخدام القوقعة سقالة أنسجة معقدة، ثلاثية الأبعاد. سانتي وآخرون. 15 تطوير أسلوب كوكليا ديسيلولاريزينج الأولية، ودقة ويقدر حجم العديد من الهياكل cochlear عن طريق مع المعونة من الورقة الخفيفة الميكروسكوب23. مثل هذا العمل في وقت مبكر بمثابة أساس قوي لهندسة الأنسجة والخلية ثقافة التقنيات المعروضة هنا. ديسيلولاريزيد القوقعة يمكن بنجاح يملؤه الخلايا، ومثقف ثم لفترة طوي...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    بإثبات جامعة كانساس مفهوم صندوق تمويل المشروع الحالي. نود أن نشكر موظفي التمريض في كومك (كانساس سيتي، كانساس) لمساعدتنا في الحصول على البشرية السرة الحبال، وديفيد يورجنسن لمساعدة مع الثقافات كوتشلياي.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Allegra X-14R أجهزة الطرد المركزيBeckman-CoulterB08861
    أنابيب شبه صلبةBecton Dickinson427401
    نيو برونزويك Innova 2000 Shaler المداريEppendorfM1190-0002
    مقص جراحيأدوات العلوم الدقيقة14060-10
    ملقط دقيقأدوات العلوم الدقيقة11370-40
    ملقط فائق الدقةأدوات العلوم الدقيقة18155-13
    50 مل أنابيب مخروطيةفيشر ساينتفيك12565271
    طبق بتريفيشر ساينتفيكFB087579B
    U-100 حقنة الأنسولينفيشر العلمية14-829-1B
    قارورة تلألؤفيشر العلمية03-341-73
    الدوارفيشر العلمي88-861-049
    نقل ماصةفيشر العلمية22-170-404
    شفرة الحلاقةفيشر Scientific12-640
    المضادات الحيوية ومضادات الفطرياتفيشر Scientific15-240-062
    البنسلين الستربتومايسينفيشر Scientific15-140-122
    لوحة24 بئرفيشر ساينتفيك07-200-84
    شرائح مجهر زجاجي SuperFrostPLUS فيشر ساينتفيك12-550-15
    نقل ماصةفيشر Scientific22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant مع DAPIFisher ScientificP36935
    Clear-Rite 3Fisher Scientific22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 CO2< / sub> حاضنةفيشر Scientific13-998-078
    الخلايا الجذعية الوسيطةLonzaPT-3001
    Trypsin-EDTALonzaCC-3232
    TPP T-75 قارورة ثقافةMidSciTP90076
    TPP T-150 قارورة ثقافةMidSciTP90151
    TPP T-300 قارورة ثقافةMidSciTP90301
    مجهرتشريح نيكون إنسترومنتورزSMZ800
    نيكون كسوف TS2R-FL مجهر مقلوبنيكونMFA51010
    NuAire من الفئة الثانية ، نوع A2 خزانة السلامة الحيويةNuAireNU-425-600
    1X PBSSigma-AldrichP5368-10PAK
    1٪ حل SDSسيجما ألدريتش436143-100G
    10٪ EDTAسيجما - ألدريتشE9884-100G
    داخلية نمو

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
    2. LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
    3. Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
    4. Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
    5. Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
    6. Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
    7. Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere's disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
    8. House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
    9. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
    10. Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
    11. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
    12. Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
    13. Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
    14. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
    15. Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
    16. Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
    17. Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
    18. Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
    19. Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
    20. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
    21. Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
    22. Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
    23. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
    24. Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
    25. Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
    26. Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Mouse Cochlea DecellularizationInner Ear Tissue EngineeringCochlear ECM ScaffoldDecalcification ProtocolHuman Wharton s Jelly CellsTemporal Bone IsolationExtracellular Matrix AnalysisCell Perfusion TechniqueOrgan of Corti PreservationTissue Engineering Scaffold

    Related Articles