Method Article

استخدام جهاز ميكروفلويديكس لتحفيز الميكانيكية وتصوير قرار عالية من C. ايليجانس

DOI:

10.3791/56530

⸱

February 19th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Mechanical Engineering, Stanford University, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Group of Neurophotonics and Mechanical Systems Biology, The Institute of Photonic Sciences (ICFO)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدوات جديدة للبحوث ميتشانوبيولوجي هناك حاجة لفهم كيف الميكانيكية الإجهاد ينشط المسارات البيوكيميائية ويتسبب الاستجابات البيولوجية. هنا، نحن عرض طريقة جديدة لتحفيز الميكانيكية الانتقائي للحيوانات المعطل تداولها مع فخ موائع جزيئية السماح بتصوير عالي الدقة من الاستجابات الخلوية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هدف مركزي واحد من ميتشانوبيولوجي فهم متبادل أثر الإجهاد الميكانيكي على البروتينات والخلايا. على الرغم من أهميته، هو ما زالت غير مفهومة تأثير الإجهاد الميكانيكي على وظيفة الخلوية. في جزء منه، وجود هذه الفجوة في المعرفة نظراً لعدد قليل من أدوات تمكين تشوه المتزامن للأنسجة والخلايا، وتصوير الأنشطة الخلوية في الحيوانات الحية، وكفاءة تقييد الحركة في الكائنات نموذج خلاف كثيري التنقل، مثل ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس. صغر حجم C. ايليجانس يجعلها مباراة ممتازة للأجهزة المستندة إلى ميكروفلويديكس للبحث، وقد عرضت حلولاً للتثبيت باستخدام أجهزة موائع جزيئية. على الرغم من أن هذه الأجهزة تسمح لتصوير عالي الدقة، هو المغطى الحيوان كاملا في بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، والزجاج، ويحد من الوصول الفعلي لتسليم القوة الميكانيكية أو التسجيلات الكهربية. في الآونة الأخيرة، قمنا بإنشاء جهاز يدمج المحركات الهوائية مع تصميم ملائمة متوافق مع الفحص المجهري الفلورية ذات الدقة العالية. قناة يشتغل مفصولة من القناة الملائمة دودة غشاء PDMS رقيقة. هو نحيد هذا الحاجز إلى الجانب من دودة بتطبيق ضغط من مصدر خارجي. الجهاز يمكن استهداف الخلايا العصبية ميتشانوسينسيتيفي الفردية. تنشيط هذه الخلايا العصبية يتم تصويرها في الاستبانة مع مؤشرات الكالسيوم المرمزة وراثيا. تقدم هذه المقالة طريقة عامة استخدام سلالات C. ايليجانس معربا عن مؤشر النشاط المراعية للكالسيوم (GCaMP6s) في هذه الخلايا العصبية مستقبلات اللمس (ترنس). ومع ذلك، الأسلوب، لا يقتصر ترنس ولا أجهزة استشعار الكالسيوم كتحقيق، بل يمكن توسيعها للخلايا الحساسة ميكانيكيا أو أجهزة استشعار أخرى.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حاسة اللمس توفر الحيوانات مع معلومات حاسمة عن بيئتهم. ويعتبر اللمس اعتماداً على القوة التطبيقية، حميدة، ممتعة، أو مؤلمة. تم الكشف عن تشوه النسيج خلال اتصال بالخلايا ميتشانوريسيبتور المتخصصة جزءا لا يتجزأ من الجلد التي تعبر عن البروتينات مستقبلات، قنوات أيون الأكثر شيوعاً. خطوات ربط مفهوم القوة بايون قناة التنشيط خلال اللمس والألم ليست مفهومة تماما. ومن المعروف حتى أقل حول كيف فلاتر تشوه الميكانيكية وميتشانوريسيبتورس ما إذا كان الكشف عن تغييرات في إجهاد أنسجة الجلد أو التشديد على1،،من23. وتنشأ هذه الفجوة في التفاهم، في جزء منه، من الافتقار إلى الأدوات المناسبة لتطبيق التحفيز ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصنيع الجهاز

  1. تنزيل الملف المرفق قناع (تكميلية ملف 1) وإنشاء قناع كروم باستخدام خدمة تجارية أو مرفق داخلي. كما البعد أصغر على الجهاز هو 10 ميكرون (سمك الغشاء المحرك)، ضمان أن القناع بدقة عالية بما فيه الكفاية، داخل ± 0.25 ميكرومتر، لإنتاج موثوق الميزات.
  2. اتباع أساليب الطباعة الحجرية التصويرية سو-8 القياسية (مثلاً، مراجع24،25،26) اختﻻق العفن الإنتاج اللاحقة للأجهزة PDMS؛ يتم سرد موجز للخطوات أدناه-
    ملاحظة: سو-8 مادة حساس، الذي كروسلينكس عند التعرض للضوء فوق البنفسجي (استيعاب ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

8-سو الطباعة الحجرية والترابط رقاقة
بروتوكول الطباعة الحجرية وصب PDMS اتباع الإجراءات القياسية. التفاصيل يمكن الاطلاع على أماكن أخرى23،24،،من2526. وينبغي أن تقشر PDMS يفر دون مشاكل بعد علاج. إذا راوغ الميزات سو-8 أثناء تقشير PDMS، أما طبقة الالتصاق سو-8 أو سيلانيزيشن لم يكن كافياً. إذا لم يكن في تفعيل البلازما كوفيرسليبس الزجاج ورقائق PDMS كا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يوضح أسلوب لتقديم تحفيز ميكانيكية دقيقة لجلد الدودة المحاصرين في رقاقة موائع جزيئية. أنه يهدف إلى تسهيل اندماج المحفزات المادية للإجابة على الأسئلة البيولوجية، ويهدف إلى تنظيم عملية البحث ميتشانوبيولوجي في مختبرات بيولوجية. ويمتد هذا الأسلوب السابق فحوصات لتقييم وظيفة الخلايا العصبية ميتشانوسينسوري في C. ايليجانس. التقنيات الكمية ونصف الكمية السابقة قياس القوى1،34 والسلوك35، ولكن كانت صعوبة في الاندماج مع التصوير عا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر ساندرا نون مانوسالفاس-كينو، "لادبلي عيد البوريم"، ميمون فرح وجوبيسيتي ديفيا سانشيز فيرونيكا لتقديم الدعم في تصميم الجهاز وجيل من الحيوانات المسخ. وأيد هذا البحث بالمعاهد الوطنية للصحة منح R01EB006745 (BLP)، R01NS092099 (إلى MBG)، K99NS089942 (في الكنيست)، F31NS100318 (إلى ALN) وتلقت تمويلاً من مجلس البحوث الأوروبي (المنسق) تحت أفق 2020 للبحث والابتكار في الاتحاد الأوروبي (برنامج منح الاتفاق رقم 715243 لعضو الكنيست).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
قناع الكرومCompugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)5 بوصات، مصمم في AutoCAD (Autodesk، Inc.)
قناع الكرومMitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)5 '' ، مصمم في AutoCAD (Autodesk، Inc.)
قناع الكرومKuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/5 بوصة، مصمم في أوتوكاد (أوتوديسك، إنك)
رقاقة السيليكون مقاس 4 بوصات (اختبار B) منشأةستانفورد للتصنيع النانوي
SU-8 2002MicroChem
SU-8 2050MicroChem
Spin-coaterLaurell TechnologiesWS-400BZ-6NPP / LITE
مؤقت التعرضOptical Associates، IncOAI 150
وحدة تحكمالإضاءةOptical Associates، Inc2105C2
SU-8 المطورMicroChem
2-PropanolFisher ScientificA426F-1GAL
AcetoneFisher ScientificA18-4
Trichloromethylsilane (TCMS)Sigma-Aldrich92361-500MLتحذير: TCMS سام ومتفاعل مع الماء
Sylgard 184 Elastomer KitDow كورنينجPDMS
بريبوليمر خزعة لكمة ، 1 ممVWR95039-090
أكسجين بلازما AsherBranson / IPC
أنابيب معدنية صغيرة (0.635 مم OD ، 0.4318 مم ID ، 12.7 مم) ؛ حجم المقياس 23TWNew England Small Tube CorporationNE-1300-01
مرشح حقنة Nalgene ، 0.22 & mu ؛ مThermo Scientific725-2520لتصفية جميع المحاليل ، فإن الجسيمات الصغيرة تسد رقاقة
أنابيب البولي إيثيلين ؛ 0.9652 مم OD ، 0.5842 مم IDSolomon ScientificBPE-T50
حقنة ، 1 ملBDScientific 309628لمحاصرة الديدان وإطلاق
حقنة ، 20 ملBDScientific 309661للتدفق القائم على الجاذبية
Gilson Minipuls 3 ، التمعجي مضخةجيلسونلامتصاص المحاليل والديدان من رقاقة
وحدة التحكم في التدفق Microfluidic ، مجهزة ب 0 & ndash ؛ 800 كيلو باسكال قناة ضغطElveflowOB1 MK3توصيل الضغط
بولي يوريثان شفافة مقاومة للماء ، معرف 4 مم و 6 مم اتصال ODMcMaster-Carr5195 T52من هواء المنزل إلى مضخة الضغط
البولي يوريثين الشفافة المقاومة للماء ، معرف 2.6 مم و 4 مم ODMcMaster-Carr5195 T51توصيل مضخة الضغط بأنبوب صغير
Push-to-Connect Tubng للهواءماكماستر كار5111K468متري - محول إمبراطوري
موصل مستقيم ل 6 مم ومرات ؛ 1/4 & Prime; أنبوب ODMcMaster-Carr5779 K258
Leica DMI 4000 B نظام الفحص المجهريLeica
63 مرة ؛ / 1.32 NA HCX PL APO هدف الزيتLeica506081
Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT كاميرا CMOS الرقميةHamamatsuC11440-42U
Lumencor Spectra X محرك خفيفLumencorمع مصدر ضوء سماوي وأخضر / أصفر
مقسم شعاع الإثارةChroma59022bsفي المجهر
Hamamatsu W-view Gemini صورة تقسيم البصرياتHamamatsuA12801-01لتقسيم الانبعاث الأخضر والأحمر وعرضهما على مناطق مختلفة على شريحة الكاميرا
مقسم شعاع الانبعاثChromaT570lpxrفي مقسم الصور
مرشحات الانبعاث GCamp6sChromaET525 / 50mفي مقسم الصور ،
مرشحات الانبعاث mCherryChromaET632 / 60mفي مقسم الصور
أنابيب أنابيب

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
  2. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic ChipMechanical StimulationC ElegansHigh Resolution ImagingGCaMP6sTouch Receptor NeuronsPneumatic ActuatorsPressure ActuationFluorescence MicroscopyWorm Trapping

Related Articles