يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الأحماض الدهنية المشبعة الحث على موت الخلايا المرتبطة السيراميد بلعم

8.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56535

⸱

أكتوبر 31, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville

في هذه المقالة

ملخص

نحن توضيح طريقة مستقيم إلى الأمام لاشتقاق مورين الضامة الأولية من خلايا نخاع العظام ويرتبط طريقة بسيطة لتحضير الأحماض الدهنية جيش صرب البوسنة. ثم نظهر أن الأحماض الدهنية المشبعة يمكن أن يستحث موت الخلايا بلعم، ومثل موت الخلايا يرتبط إيجابيا مع تراكم مستويات السيراميد الخلوية.

الملخص

أعرب الضامة عالية البروتين ملزمة الأحماض الدهنية البشرة والدهنية الأحماض الدهنية ملزمة البروتين. أنها نشاط امتصاص المشبعة والأحماض الدهنية غير المشبعة، والتي قد تلعب دوراً حاسما في تنظيم وظائفهم المناعية. وأظهرت العديد من الدراسات أن الأحماض الدهنية المختلفة، المشبعة أو غير المشبعة، قد تمتلك تأثيرات مختلفة على نمو الخلايا ووظيفتها. ومع ذلك، تختلف النهج المستخدمة لإعداد الأحماض الدهنية، التي قد تؤدي إلى نتائج غير الفسيولوجية. ألبومين المصل، ناقل طبيعي للأحماض الدهنية في الدم المحيطي الثدييات، يوصي بتشكيل المتقارن معقدة مع ملح الصوديوم للأحماض الدهنية دراسة وظيفة الأحماض الدهنية في خلايا الثدييات، وبالتالي تقليل سمية الصابون الأحماض الدهنية. وهكذا، بسيطة وسريعة نسبيا التدفئة وسونيكاتينج أسلوب تطوير والمقدمة هنا لتشكيل المتقارنة الأحماض الدهنية جيش صرب البوسنة. يمكننا وصف بروتوكول باستخدام الأحماض الدهنية المشبعة، لا سيما دهني الأحماض للحث على موت الخلايا الشديدة في الماوس نخاع العظام المستمدة الضامة. كذلك ندلل على أن موت الخلايا المستحثة بالأحماض الدهنية المشبعة يرتبط ارتباطاً إيجابيا بمستويات السيراميد الخلوية المتراكمة. ويمكن تمديد هذا الأسلوب للدراسات المتعلقة بتأثير الأحماض الدهنية في خلايا الثدييات الأخرى.

المقدمة

الأحماض الدهنية تلعب دوراً حاسما في استقلاب الطاقة وفي تركيب غشاء فوسفوليبيدات في أنواع مختلفة من الخلايا. وقد الأحماض الدهنية انخفاض معدلي الذوبان مائي. إعداد مناسبة من الأحماض الدهنية ذات أهمية حاسمة لدراسة الوظائف البيولوجية للأحماض الدهنية في خلايا الثدييات. عندما يتم إعداد الأحماض الدهنية مع الإيثانول، الأحماض الدهنية عديدة قد تظهر آثارها السمية الصابون (المنظفات) على غشاء الخلية، حتى في تركيزات منخفضة نسبيا1. كالناقل الطبيعي، الرئيسية للأحماض الدهنية الحرة في المصل، يعتبر الزلال ناقل جيدة للأحماض الدهنية التسليم في المختبر للأحماض الدهنية الدالة فحوصات2،،من34. ومع ذلك، تفاصيل إعداد المتقارن الأحماض الدهنية والزلال عادة لا تتوفر حتى ولو تم نشر العديد من الأوراق البحثية باستخدام الأحماض الدهنية.

أعرب الضامة عالية البروتين ملزمة الأحماض الدهنية البشرة والدهنية الأحماض الدهنية ملزمة البروتين5،6،،من78. أنها نشاط امتصاص المشبعة والأحماض الدهنية غير المشبعة التي قد تنظم على وظائف المناعة. لدراسة تأثير الأحماض الدهنية في الضامة، والخلايا الأخرى، كانت أساليب مختلفة لإعداد الأحماض الدهنية التطبيقية1،،من79. استخدام الأحماض الدهنية مستعدة على نحو ملائم/مصل الزلال يصرف للتحقيق في تأثير الأحماض الدهنية في الدالة بلعم ذا أهمية حاسمة في الحصول على بيانات ذات مغزى بيولوجيا. يمكن أن توفر دراسات بشأن تأثير الأحماض الدهنية في بلعم الدالة المعرفة الأساسية والأهداف العلاجية المحتملة المتعلقة بالأيض الأحماض الدهنية في أمراض تشترك بلعم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأقر البروتوكول "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة لويزفيل.

1-"الماوس نخاع العظام المستمدة الضامة" (بمدمس)

  1. يوثانيزي CO 2 باستخدام ماوس نوع البرية 6-8 أسبوع وصحية. دبوس وصولاً إلى لوحة رغوة والرش مع الإيثانول 70% حتى يتم استيعابه. إزالة عظام الساق/عظم الفخذ مع ملقط ومقص. وضعها في طبق بتري مع مل 5 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). تنفيذ كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة.
  2. قص فتح طرفي عظم الساق/عظم الفخذ مع مقص في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة. مسح العظام بإبرة ز 25 مع برنامج تلفزيوني + 2% مصل بقرى الجنين (FBS) في أنبوب 15 مل.
  3. الطرد المركزي خلايا نخاع العظام في ز 500 x، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5
  4. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء خلايا الدم الحمراء (RBC) لأقل من 1 دقيقة ديلوت فورا مع برنامج تلفزيوني 1 x مل 9. الطرد المركزي مرة أخرى كما في الخطوة 1، 3. صب سوبيرناتانتس-
  5. ريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني 1 x 10 مل، تصفية تعليق خلية عن طريق شبكة نايلون ميكرومترات 40 عقيمة في أنبوب 15 مل آخر لإزالة الحطام خلية/كتل. الطرد المركزي مرة أخرى كما هو الحال في 1.3. صب سوبيرناتانتس-
  6. ريسوسبيند بيليه الخلية في 15 مل روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي) 1640 مع 5% FBS و 10 ميكروغرام/مل الجنتاميسين، لوحة الخلايا في طبق استنبات الأنسجة 100 ملم في 37 س ج حاضنة لدوامة 60 دقيقة بلطف الطبق، أخرج العائمة الخلايا، والتعويل عليها-
  7. لوحة 6 × 10 6 خلايا في طبق 100 ملم مع 12 مل بلعم التفريق بين وسائط الإعلام (RPMI 1640 مع 5% FBS والجنتاميسين 10 ميكروغرام/مل، مختلطة مع وسائل الإعلام مكيفة 30% L929 10) مع 10 نانوغرام/مل الماوس المؤتلف بلعم عامل تحفيز مستعمرة (م-CSF) لمدة يومين.
  8. بعد استزراع لمدة يومين في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO 2، تغذية كل طبق مع 6 مل بلعم الطازجة التفريق بين وسائط الإعلام مع 10 نانوغرام/مل م-CSF.
  9. في يوم 5، تأخذ 8 مل من وسائط الإعلام القديمة بدون إزعاج الخلايا وإضافة 10 مل بلعم الطازجة التفريق بين وسائط الإعلام مع 10 نانوغرام/مل م-CSF.
  10. في يوم 7، حصاد الضامة المشتقة من نخاع العظم (بمدمس) باستخدام رافعة خلية.
    ملاحظة: الضامة المرفقة يمكن أيضا يمكن فصلها مع 5 مل 1 مم يدتا في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 5 إلى 10 دقائق بعد إزالة خلايا التعويم والغسيل لوحة مرتين مع مل 5 1 x برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا كما هو الحال في الخطوة 1، 3. وريسوسبيند لهم في بلعم الطازجة التفريق بين وسائط الإعلام، ويعول عليها مع هيموسيتوميتير.
    1. تأكيد بمدمس ' النمط الظاهري بالتدفق الخلوي كوصف 5. إعداد الماوس المستمدة الضامة في تركيز بعض الدراسات التالية.

2. جيش صرب البوسنة-الدهنية "حمض مترافق إعداد"

  1. تحضير 2 مم جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني العقيمة. على سبيل المثال، تزن ز 6.65 جيش صرب البوسنة، إضافة 30 مل س 1 برنامج تلفزيوني حل، ثم قم بإضافة برنامج تلفزيوني أكثر حتى 50 مل، قياس المكونات لجعل 2 مم جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني س 1-
  2. تحضير ملح الصوديوم الفردية 5 مم من الأحماض الدهنية في 2 مم جيش صرب البوسنة. الحرارة إلى 37 درجة مئوية أو أعلى، إذا لزم الأمر، و sonicate المزيج من 2 مم جيش صرب البوسنة وملح الصوديوم للأحماض الدهنية حتى يتم الحصول على حل واضح.
    ملاحظة: مقارنة بالأحماض الدهنية غير المشبعة، الأحماض الدهنية المشبعة بحاجة إلى درجة حرارة أعلى، والمزيد من الوقت سونيكيشن تذويب.
    3. تصفية
  3. تصفية الحل الدهنية-حمض-جيش صرب البوسنة من خلال 0.22 ميكرومتر، وقاسمه أنابيب إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي العقيمة، وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها على المدى القصير أو في-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. وينبغي مراعاة لا هطول الأمطار بعد التخزين في 4 درجات مئوية في الثلاجة.

3. المشبعة "الأحماض الدهنية يحفز الخلية الموت من الماوس نخاع العظام المستمدة الضامة"

  1. لوحة بمدمس في صفيحة زراعة الأنسجة 24-جيدا مع 0.4 × 10 6/mL في بلعم التفريق بين وسائط الإعلام-
  2. علاج الخلايا مع حمض النخليك 0.4 مم وحمض دهني ح 16 إلى 24 في حاضنة 37 درجة مئوية مع شركة 5% 2. استخدام جيش صرب البوسنة كعنصر سلبي.
  3. حصاد الخلايا مع رافعة خلية بعد العلاج وتدور أسفل الخلايا في ز x 500، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5
  4. وصمة عار الخلايا مع 488 الخامس-أليكسا أنيكسين و 7-أمينواكتينوميسين د (7-عاد) في 100 ميكروليتر annexin V ربط المخزن المؤقت لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
  5. تمييع العينة مع 200 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم annexin، تخلط بلطف، ثم تبقى العينات على الجليد بعد فترة الحضانة.
  6. تحليل الخلايا ملطخة بأسرع طريق التدفق الخلوي 5. أنيكسين 488 الخامس-أليكسا يتم الكشف عن في قناة فيتك ويتم الكشف عن 7-الإغراق في قناة بيركب/بيركب-Cy5.5.

4. داخل الخلايا "تلطيخ السيراميد"

  1. بعد العلاج الأحماض الدهنية، وحصاد الخلايا كما هو الحال في الخطوة 3، 3. قم بإصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 4% للحد الأدنى 30
  2. تغسل العينة مع مل 1 1 x برنامج تلفزيوني، وتدور إلى أسفل خطوة في 3.3، وصب المادة طافية.
  3. وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على مكافحة السيراميد جسم الأولية (تخفيف 1: 200) في س 1 ميكروليتر 100 permeabilization المخزن المؤقت ل 30 دقيقة
  4. المياه والصرف الصحي، وزيادة ونقصان لأسفل الخلايا مرة أخرى كما في الخطوة 4، 2-
  5. وصمة عار في الخلايا مع الماوس المضادة IgM جسم الثانوي (تخفيف 1: 500) في س 1 ميكروليتر 100 permeabilization المخزن المؤقت ل 30 دقيقة
    6. أغسل
  6. وتدور أسفل الخلايا مرة أخرى كما في الخطوة 4، 2. إضافة 250 برنامج تلفزيوني 1 x ميكروليتر وتحليل الخلايا ملطخة بالتدفق الخلوي 5.
    ملاحظة: انظر قائمة كاشف مفصلة في الجدول للمعدات والمواد الكاشفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

السمنة زيادة تركيزات الأحماض الدهنية الحرة في مصل الدم. البالعات المهنية، الضامة نشاط تناول الأحماض الدهنية للحفاظ على التوازن المضيف. خلال هذه العمليات، قد حمل الدهون محمل بشكل زائد بلعم موت الخلية. وتحقيقا لهذه الغاية، نحن مثقف بمدمس في المختبر مع مستويات البدانة الغذائية من الأحماض الدهنية وموت الخلية بلعم المقاسة باستخدام تدفق تلطيخ سيتوميتريك. مقارنة لسيطرة جيش صرب البوسنة، الأحماض الدهنية المشبعة، لا سيما دهني الأحماض، الناجمة عن موت الخلية كبيرة من الخلايا الميتة كانت تظهر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

إعداد الأحماض الدهنية الحل السليم ذات أهمية حاسمة لدراسة الوظيفة البيولوجية للأحماض الدهنية. تحييد الأحماض الدهنية يزيد ذوبانه في محلول مائي. ومع ذلك، أملاح الصوديوم للأحماض الدهنية، وخاصة الأحماض الدهنية المشبعة، لا تزال منخفضة القابلية للذوبان في الماء أو في برنامج تلفزيوني كما لاحظنا. أسلوب واحد استخدام الإيثانول 95-100% للمساعدة على حل الأحماض الدهنية1. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن ملاحظة ارتفاع السمية للخلايا حتى في تركيزات أقل للأحماض الدهنية غير المشبعة أقل سمية. طريقة أخرى لتحضير الأحماض الد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

بتأييد هذا العمل جزئيا بأموال بدء جامعة لويزفيل، ويمنح المعهد الوطني للسرطان (بيثيسدا، ماريلاند) R01CA177679، R01CA180986.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
CPX حمام بالموجات فوق الصوتية  برانسونيكموديل 2800
بالميتات الصوديوم (PA)Nu-Chek Prep، Inc.S-1109M.W. 278
ستيرات الصوديوم (SA)Nu-Chek Prep، Inc.S-1111M.W. 306
ألبومين مصل البقر (BSA) ، خالي من الأحماض الدهنيةفيشر ساينتفيك9048-46-8
عامل تحفيز مستعمرة البلاعم الفأر (mM-CSF)   ؛تكنولوجيا إشارات الخلية,  Inc.5228
RPMI 1640VWR International71002-878
Annexin V ، Alexa Fluor 488 مترافقفيشر ScientificA13201
7-AADBD Biosciences559925
الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للسيراميد (الفأر IgM) استنساخSigmaC8104-50TST: MID 15B4
الماعز المضاد للفأر IgM المضاد ، وسلسلة صغيرة ، FITC مترافقSigmaAP128F
تثبيت المخزنBiolegend420801
النفاذيةEbioscience4307693
Blood Cell Lysis Buffer   ؛Sigma11814389001
Annexin V Binding BufferBD Biosciences556454
خلايا L929ATCCCCL-1
Corning & nbsp ؛ رافع الخلية فيشر Scientific07-200-364
ملاحظة: MW للوزن الجزيئي.
المؤقت Red

المراجع

  1. Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
  2. Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
  3. Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
  4. Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
  5. Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
  6. Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
  7. Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
  8. Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
  9. Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
  11. Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
  12. Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

BSA V
الأحماض الدهنية المشبعة الحث على موت الخلايا المرتبطة السيراميد بلعم
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.